利用轉(zhuǎn)基因微藻生產(chǎn)蝦青素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請涉及微藻表達(dá)載體，以及使用β -胡蘿卜素酮化酶（BKT)和β -胡蘿卜素 羥化酶（CHYB)在轉(zhuǎn)基因微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法。具體而言，本申請涉及構(gòu)建微藻表達(dá)載 體，包含β-胡蘿卜素酮化酶基因（ΒΚΤ)和β-胡蘿卜素羥化酶基因（CHYB)的微藻表達(dá)載 體，包含所述微藻表達(dá)載體的微藻，使用ΒΚΤ和CHYB在微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法，使用所述 微藻表達(dá)載體制備生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因微藻的方法，所述微藻表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因微藻 中的應(yīng)用，以及所述微藻表達(dá)載體在生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蝦青素化學(xué)名稱是3,3< -二羥基_4,4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素[1]，分子 量式C4(]H5204。是一種非維生素 Α原的類胡蘿卜素，也是類胡蘿素合成的最高級別產(chǎn)物[1]， 是迄今為止自然界中發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑，具有強大的抗氧化活性[2]，其抗氧化性是類 胡蘿卜素的10倍、維生素 E的550倍[3]，被譽為"超級抗氧化劑"。
[0003] 蝦青素具有重要的生理生化功能。它能向自由基提供電子而生成相應(yīng)的陽離子基 團或吸引自由基的未配對電子形成加合物，從而清除自由基，起到抗氧化作用[4]。過量的羥 自由基會導(dǎo)致機體衰老，清除羥自由基可以調(diào)節(jié)DNA和重要生命物質(zhì)的修復(fù)過程[5]，因此 蝦青素具有增強免疫力、抵抗癌癥的作用a6]。蝦青素對轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶具有特殊作用，能夠 在皮膚受光時消耗腐胺[7]，因此其可以防止皮膚衰老。又由于酯化的蝦青素可以穿過血腦 屏障，因此其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康具有重要的生理功能M。酯化態(tài)的蝦青素易與蛋白質(zhì)形 成復(fù)合物，會產(chǎn)生不同的顏色[2]，因此被廣泛的應(yīng)用于飼料、食品添加劑中。絕大多數(shù)海產(chǎn) 甲殼類動物和魚類都含有蝦青素，但都是通過食物鏈從海洋微藻、浮游植物和浮游動物中 獲得的[9]。這些海產(chǎn)動物通常都是人類的日常膳食，對人體安全[2]。因此蝦青素在保健品、 功能食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料添加劑及食品添加劑等方面都有廣闊的應(yīng)用前景[1°]。
[0004] 但是，蝦青素的來源有限，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)供不應(yīng)求。蝦青素主要分為人工合成和生物合 成，生物合成又分為天然生物合成和轉(zhuǎn)基因生物合成。蝦青素最初是從河螯蝦外殼、牡蠣和 鮭魚中發(fā)現(xiàn)的一種紅色類胡蘿卜素，但是河螯蝦外殼、牡蠣和鮭魚中的蝦青素含量低、提取 工藝復(fù)雜，此外河螯蝦外殼、牡蠣和鮭魚的來源受到季節(jié)的限制。人工合成的蝦青素，由于 合成工藝復(fù)雜，僅有25%為左旋結(jié)構(gòu)，且都是游離形式的奸青素，目前人工合成的奸青素只 能用于飼料添加劑，限制了人工合成蝦青素的發(fā)展。
[0005] 目前天然奸青素主要來源于雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis)，而雨生紅 球藻具有生長周期長、易污染、細(xì)胞密度低等缺點導(dǎo)致蝦青素的產(chǎn)率較低[11]，造成天然蝦 青素價格昂貴、供不應(yīng)求。通過優(yōu)化雨生紅球藻的培養(yǎng)工藝或通過篩選突變體來解決蝦青 素產(chǎn)量低的問題至今尚未取得突破性進展。
[0006] 小球藻含有豐富的營養(yǎng)價值，具有生長周期短、細(xì)胞密度高、可以進行異養(yǎng)、混養(yǎng) 和光自養(yǎng)等營養(yǎng)方式進行快速生長等特點，因而在食品、醫(yī)藥、飼料以及能源等領(lǐng)域具有廣 泛的應(yīng)用價值。申請人所在團隊前期在國內(nèi)外首次揭示了一株工業(yè)用蛋白核小球藻的全 基因圖譜，并已建立了蛋白核小球藻的電擊轉(zhuǎn)化方法，實現(xiàn)了其基因工程改造（參見閏從 林《蛋白核小球藻外源基因表達(dá)系統(tǒng)的初步建立及其優(yōu)化》，華東理工大學(xué)碩士畢業(yè)論文， 2014)〇
[0007] 研究表明，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis)合成4下青素的過程中， β -胡蘿卜素酮化酶（β-carotene ketolase，BKT)是限速酶[12]，能夠以β -胡蘿卜素 (β-carotene)和玉米黃素（Zeaxanthin)為底物，形成角黃素（Canthanxanthin)和4下青 素 。β -胡蘿卜素輕化酶（β-carotene hydroxylase，CHYB)是一種非血紅素雙鐵單加氧 酶，催化β -胡蘿卜素形成玉米黃素。因此，β -胡蘿卜素酮化酶和β -胡蘿卜素羥化酶在 生成蝦青素的過程中起重要的作用。
[0008] 有文獻(xiàn)報道通過基因工程改造，可以將雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis) 的β-胡蘿卜素酮化酶（HpBKT)和β-胡蘿卜素羥化酶（HpCHYB)引入高等植物（例如煙 草[1315]、番茄[16]、擬南芥[12])中來生成蝦青素。但是轉(zhuǎn)基因植物種植周期長、含量低、提取 工藝復(fù)雜、成本高等缺點都限制了其發(fā)展。
[0009] 也有文獻(xiàn)報道通過基因工程改造將雨生紅球藻的β -胡蘿卜素酮化酶（HpBKT)和 胡蘿卜素羥化酶（HpCHYB)引入微生物（例如油脂酵母、大腸桿菌[17])中來生成蝦青素。 但是轉(zhuǎn)基因微生物不能生成酯化形式的蝦青素。
[0010] 但是現(xiàn)在還沒有任何文獻(xiàn)報道在微藻中，表達(dá)β-胡蘿卜素酮化酶（HpBKT)和 β-胡蘿卜素羥化酶（HpCHYB)來生產(chǎn)蝦青素的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本申請利用基因工程技術(shù)構(gòu)建微藻表達(dá)載體，并 且使用內(nèi)源性啟動子表達(dá)β-胡蘿卜素酮化酶（BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶（CHYB)在轉(zhuǎn) 基因微藻中生產(chǎn)蝦青素。具體而言，本申請涉及構(gòu)建微藻表達(dá)載體，包含胡蘿卜素酮化 酶基因（ΒΚΤ)和β-胡蘿卜素羥化酶基因（CHYB)的微藻表達(dá)載體，包含所述微藻表達(dá)載體 的微藻，使用ΒΚΤ和CHYB在微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法，使用所述微藻表達(dá)載體制備生產(chǎn)蝦 青素的轉(zhuǎn)基因微藻的方法，所述微藻表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因微藻中的應(yīng)用，以及所述微藻 表達(dá)載體在生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。
[0012] 本申請的技術(shù)方案使用蛋白核小球藻的內(nèi)源性HSP70啟動子表達(dá)β-胡蘿卜素 酮化酶（ΒΚΤ)和β-胡蘿卜素羥化酶（CHYB)在蛋白核小球藻等藻株中生產(chǎn)蝦青素。與 現(xiàn)有技術(shù)中的蝦青素生產(chǎn)方法相比，本申請的技術(shù)方案有如下優(yōu)勢：（1)與雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis)和小球藻（Chlorella zofingiensis)相比，蛋白核小球藻已 被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FA0)列為21世紀(jì)人類的綠色營養(yǎng)源健康食品；（2)與雨生紅球藻相 比，蛋白核小球藻生長周期短、細(xì)胞密度高、并且既可以進行自養(yǎng)又可以進行兼養(yǎng)和異養(yǎng)等 多種培養(yǎng)方式；（3)與小球藻（Chlorella zofingiensis)相比，針對于蛋白核小球藻，本實 驗室創(chuàng)立了一項微藻培養(yǎng)領(lǐng)域嶄新的平臺技術(shù)一一"異養(yǎng)一稀釋一光誘導(dǎo)"技術(shù)（參見中國 專利申請?zhí)?00610025618. 9,《高密度高品質(zhì)培養(yǎng)小球藻的方法》，該專利通過引用全文并 入本申請），按照目前的培養(yǎng)工藝，蛋白核小球藻的平均生長速率不低于3g/L/h，即蛋白核 小球藻的培養(yǎng)工藝更加成熟；(4)與紅發(fā)夫酵母和海洋細(xì)菌Agrobacterium aurantiacum 相比，蛋白核小球藻理論上可以生產(chǎn)所需要的反式結(jié)構(gòu)酯化形式的蝦青素；（5)與轉(zhuǎn)基因 番茄、煙草、擬南芥相比，蛋白核小球藻具有光合效率高、生長速度快、生長周期短、對不同 的生態(tài)系統(tǒng)適應(yīng)能力強、"不與人爭糧，不與糧爭地"等優(yōu)勢[18]，并且蛋白核小球藻富含蛋 白、小球藻生長因子等其他高附加值產(chǎn)物可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，從而避免了轉(zhuǎn)基因食物的恐 慌；（6)本申請使用蛋白核小球藻的內(nèi)源性熱激蛋白（HSP)70啟動子，相對于外源性啟動子 (例如CaMV 35S啟動子、SV40啟動子或pCMV啟動子），內(nèi)源性啟動子的優(yōu)點是不利于導(dǎo)致 基因沉默，更加有利于外源基因的表達(dá)。
[0013] 根據(jù)本申請的一個方面，本申請?zhí)峁┝宋⒃灞磉_(dá)載體，所述微藻表達(dá)載體包含微 藻的內(nèi)源性啟動子，所述內(nèi)源性啟動子可以用于在微藻中控制表達(dá)蛋白。
[0014] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻表達(dá)載體選自pGreen、pGreenOOOO、 pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、或 pBlueScript SK/KS 系列載體。
[0015] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻表達(dá)載體為pGreen0029-HSP載體。
[0016] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻的內(nèi)源性啟動子是內(nèi)源性熱激蛋白（HSP) 啟動子、泛素啟動子、或N0S啟動子。
[0017] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻的內(nèi)源性啟動子是內(nèi)源性熱激蛋白70啟 動子。
[0018] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻的內(nèi)源性啟動子是蛋白核小球藻的內(nèi)源性 啟動子。
[0019] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻的內(nèi)源性啟動子是蛋白核小球藻的內(nèi)源性 熱激蛋白70啟動子。
[0020] 根據(jù)本申請的一個方面，本申請?zhí)峁┝宋⒃灞磉_(dá)載體，所述微藻表達(dá)載體包含 胡蘿卜素酮化酶基因（BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶基因（CHYB)，并且所述微藻表達(dá)載 體包含啟動子、終止序列和抗生素抗性基因。
[0021] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述ΒΚΤ基因是克隆自雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis)的 HpBKT 基因。
[0022] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述CHYB基因是克隆自雨生紅球藻 (Haematococcus pluvialis)的 HpCHYB 基因。
[0023] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻表達(dá)載體選自pGreen、pGreenOOOO、 pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、或 pBlueScript SK/KS 系列載體。
[0024] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻表達(dá)載體為pGreen0029-HSP載體。
[0025] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述啟動子選自熱激蛋白（HSP)啟動子、泛素啟動 子、或N0S啟動子。
[0026] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述啟動子是熱激蛋白啟動子。
[0027] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述熱激蛋白啟動子是熱激蛋白70啟動子。
[0028] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述啟動子是蛋白核小球藻的內(nèi)源性啟動子。
[0029] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述BKT基因和所述CHYB基因分別連接各自的啟動 子。
[0030] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻表達(dá)載體通過如下方法構(gòu)建而得：將BKT 基因插入到所述微藻表達(dá)載體中，得到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT);用CHYB基因 代替所述包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中的BKT基因片段，從而得到包含CHYB基 因的微藻表達(dá)載體（pCHYB)，再將所述載體上的啟動子：：CHYB::終止序列通過PCR擴增和 酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中，從而得到包含BKT基因和CHYB基 因的微藻表達(dá)載體。
[0031] 根據(jù)本申請的另一個方面，本申請?zhí)峁┝税缟暾埶龅奈⒃灞磉_(dá)載體的微 藻。
[0032] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述微藻包括小球藻（Chlorella spp.)、蛋白 核小球藻（Chlorella pyrenoidosa)、捕圓小球藻（Chlorella ellipsoidea)、普通小 球藻（Chlorella vulgaris)、原殼小球藻（Chlorella protothecoides)、嗜熱小球藻 (Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp·)、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)、微擬球藻（Nannochloropsis spp·)、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum)或概藻（Scenedesmus spp.) 〇
[0033] 根據(jù)本申請的另一個方面，本申請?zhí)峁┝耸褂煤}卜素酮化酶（BKT)和 胡蘿卜素羥化酶（CHYB)在微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法。
[0034] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述方法包括構(gòu)建包含ΒΚΤ和CHYB的微藻表達(dá)載 體，將所述微藻表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到微藻中表達(dá)，其中所述微藻表達(dá)載體包含啟動子、終止序列 和抗生素抗性基因。
[0035] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述ΒΚΤ包含經(jīng)修飾的ΒΚΤ，或者ΒΚΤ的嵌合蛋白、截 短蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，或者所述CHYB包含經(jīng)修飾的CHYB，或者CHYB的嵌合蛋白、截短蛋白 或蛋白結(jié)構(gòu)域。
[0036] 根據(jù)本申請的某些實施方式，所述BKT包含與BKT的相同性為至少約70 %的序列， 或者所述CHYB包含與CHYB的相同性為至少約70 %的序列