一種Si02基大孔材料固定化漆酶及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種8102基大孔材料固定化漆酶及其制備方法，屬于固定化酶制備【技術(shù)領(lǐng)域】。該固定化漆酶是以表面改性的塊體Si02大孔材料為載體，將漆酶通過(guò)靜電和配位作用固定在該載體上。其制備方法包括兩個(gè)步驟：載體的制備和漆酶的固定。載體制備：先將塊體8102大孔材料在水熱條件下用鋁酸鈉改性，再經(jīng)離子交換得到表面固定多價(jià)金屬離子的載體成品。漆酶的固定：將載體浸入漆酶溶液，在室溫下振蕩吸附，經(jīng)洗滌、干燥，得固定化漆酶成品。本發(fā)明提供了一種新型固定化漆酶，具有制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，漆酶活力回收率高，性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種SiO2基大孔材料固定化漆酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于固定化酶制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種SiO2基大孔材料固定化漆酶及 其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶（Laccase，E. C. 1. 10. 3. 2)是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于多種生物體 內(nèi)。漆酶具有寬泛的底物專(zhuān)一性和較好的穩(wěn)定性，能催化氧化多種難降解有機(jī)污染物，包括 酚類(lèi)化合物、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯及其衍生物、除草劑、殺蟲(chóng)劑等，它在廢水處理、生物傳感 器構(gòu)建、生物制漿、食品加工以及有機(jī)合成等方面有重要應(yīng)用價(jià)值。因此，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家在 生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域?qū)ζ崦搁_(kāi)展了廣泛的研究工作。
[0003] 游離的漆酶因在使用過(guò)程中易隨環(huán)境的變化變性失活、易混入產(chǎn)品和不易循環(huán)利 用等使其應(yīng)用受到限制。對(duì)漆酶進(jìn)行固定化是實(shí)現(xiàn)其重復(fù)利用、改善其穩(wěn)定性的有效方法。 固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無(wú)機(jī)載體上，形成不溶于 水的具有酶活性的衍生物，在催化反應(yīng)中，它以固相狀態(tài)作用于底物，反應(yīng)完成后，容易與 水溶性反應(yīng)物分離，可反復(fù)使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專(zhuān)一性和高催化效率的特 點(diǎn)，且比水溶性酶穩(wěn)定，可較長(zhǎng)期使用，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004] 自20世紀(jì)60年代，固定化酶技術(shù)的研究得到了蓬勃發(fā)展，迄今為止，已研究開(kāi)發(fā) 了多種酶的固定化方法，包括物理吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法等。近年來(lái)國(guó)際上 對(duì)漆酶的固定化進(jìn)行了較為廣泛的研究，使用的載體包括殼聚糖、親水性微濾膜、SiO 2納米 顆粒、介孔SiO2和介孔碳等多種材料。但是現(xiàn)有的固定化漆酶普遍存在著生產(chǎn)成本高、力口 工工藝復(fù)雜、分離效果差等缺點(diǎn)，很難工業(yè)化應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以大尺寸塊體SiO2基大孔材料 為載體的固定化漆酶的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的固定化漆酶的制備方法是，以我們前期制備的薄板狀（長(zhǎng)10cm、 寬3cm、厚0· 3cm) SiO2大孔材料（參見(jiàn)專(zhuān)利200910095419. 9)為原料，將其切割成長(zhǎng)、寬、 高為0. 2?0. 4cm的塊體；利用該大孔材料機(jī)械強(qiáng)度高、水熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，先在水熱條 件下用鋁酸鈉對(duì)其進(jìn)行表面改性，再經(jīng)離子交換得到表面固定多價(jià)金屬離子的改性大孔材 料；以表面固定多價(jià)金屬離子的大孔材料為載體，將漆酶通過(guò)靜電和配位作用固定在該載 體上。具體制備方法如下：
[0007] (1)載體的制備：稱(chēng)取所需的干燥的塊體SiO2大孔材料置于含濃度為0. 1? 0. 5mol噸4鋁酸鈉溶液的水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中，在120?180°C下反應(yīng)2?24小 時(shí)，濾出大孔材料，用去離子水反復(fù)沖洗、干燥，浸入金屬鹽水溶液中振蕩4?6小時(shí)，濾出、 用去離子水反復(fù)沖洗、干燥，即得固定化酶所用的載體；
[0008] (2)漆酶的固定：將步驟（1)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在 5?30°C下振蕩5?12小時(shí)，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測(cè)不到蛋白，然后真空干燥即 得固定化漆酶成品。
[0009] 步驟（1)中所述的金屬鹽選自在水中易解離出多價(jià)金屬離子的水溶性金屬鹽，如 醋酸銅、醋酸鋅、三氯化鐵、二氯化錳、硫酸鎂等。
[0010] 步驟⑵中所述的漆酶溶液的濃度為〇· 05?2. Omg 值為4?8 ;緩沖溶 液可以是醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或兩種。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：（1)本發(fā)明提供的固定化漆 酶，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉；（2)本發(fā)明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高，可以達(dá)到 95%以上；（3)本發(fā)明通過(guò)靜電和配位作用吸附固定漆酶，固定化漆酶性質(zhì)穩(wěn)定；(4)本發(fā) 明使用大尺寸的塊體材料固定化漆酶，便于從反應(yīng)體系中分離出來(lái)、重復(fù)使用、應(yīng)用于實(shí)際 生產(chǎn)中。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的范圍不受實(shí)施例的限制。
[0013] 實(shí)施例1 :
[0014] (1)稱(chēng)取Ig塊狀SiO2大孔材料于80°C下干燥2h，置于含50ml、0.3mol · I/1鋁酸 鈉溶液的水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中，在120°C下反應(yīng)12小時(shí)，自然冷卻后，用8?10目 的篩網(wǎng)濾出，用去離子水反復(fù)沖洗，干燥后得到改性SiO 2大孔材料Al-Si02。
[0015] (2)將Al-SiO2浸入飽和醋酸銅溶液中振蕩4小時(shí)，濾出、用去離子水反復(fù)沖洗、干 燥，即得固定化酶用的載體Cu 2+-Al-Si02。
[0016] (3)稱(chēng)取Ig Cu2+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 5緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. Img · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉(zhuǎn)速為50r · rniiT1的搖床中振蕩5小時(shí)、用8?10 目的篩網(wǎng)濾出，用緩沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，即得固定化漆酶。該固定化漆酶的 酶活回收率為100. 4%，酶活為59. 2U · g4(定義一分鐘使1 μ mol的ABTS氧化所需的酶量 為一個(gè)酶活單位U)，固定化漆酶具有良好的操作穩(wěn)定性，與底物ABTS反應(yīng)反復(fù)操作10批次 后剩余酶活為初始酶活的72. 7%。
[0017] 實(shí)施例2:
[0018] ⑴同實(shí)施例1(1)。
[0019] (2)將Al-SiO2浸入0.5mol i1醋酸鋅溶液中振蕩5小時(shí)，濾出、用去離子水反復(fù) 沖洗、干燥，得固定化酶用的載體Zn2+-Al-Si0 2。
[0020] (3)稱(chēng)取0· Ig Zn2+-Al-SiO2，浸入5ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. 05mg · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉(zhuǎn)速為50r · rniiT1的搖床中振蕩5小時(shí)、濾出，用 緩沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率為95. 4%，酶活為 20. OU · g'與底物ABTS反應(yīng)反復(fù)操作10批次后剩余酶活為初始酶活的71. 2%。
[0021] 實(shí)施例3:
[0022] (1)同實(shí)施例 1(1)。
[0023] (2)將Al-SiO2浸入0.5mol噸―1三氯化鐵溶液中振蕩4小時(shí)，濾出、用去離子水反 復(fù)沖洗、干燥，得固定化酶用的載體Fe 3+-Al-Si02。
[0024] (3)稱(chēng)取Ig Fe3+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 0. 05mg · mr1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉(zhuǎn)速為50r · mirr1的搖床中振蕩5小時(shí)、濾出，用 緩沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率為96. 8%，酶活為 27. 5U · g'與底物ABTS反應(yīng)反復(fù)操作10批次后剩余酶活為初始酶活的77. 4 %。
[0025] 實(shí)施例4 :
[0026] (1)同實(shí)施例 1(1)。
[0027] (2)同實(shí)施例 2 (2)。
[0028] (3)稱(chēng)取Ig Zn2+-Al-SiO2，浸入50ml用pH = 4. 0緩沖溶液配置的蛋白濃度為 2. Omg · πιΓ1的粗漆酶溶液中，在25°C、轉(zhuǎn)速為50r · HiirT1的搖床中振蕩6小時(shí)、濾出，用緩 沖液洗滌至上清液中檢測(cè)不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活為76. 2U · g'
【權(quán)利要求】
1. 一種SiO2基大孔材料固定化漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 載體的制備：稱(chēng)取所需的干燥的塊體SiO2大孔材料置于含濃度為0. 1? 0. 5mol噸4鋁酸鈉溶液的水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)襯中，在120?180°C下反應(yīng)2?24小 時(shí)，濾出大孔材料，用去離子水反復(fù)沖洗、干燥，浸入金屬鹽水溶液中振蕩4?6小時(shí)，濾出、 用去離子水反復(fù)沖洗、干燥，即得固定化酶所用的載體； (2) 漆酶的固定：將步驟（1)中得到的載體浸入用緩沖溶液配置的漆酶溶液中，在5? 30°C下振蕩5?12小時(shí)，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測(cè)不到蛋白，然后真空干燥即得固 定化漆酶成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)中所述的金屬鹽選自在水中 易解離出多價(jià)金屬離子的水溶性金屬鹽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（2)中所述的漆酶溶液濃度為 0· 05 ?2. Omg · ml 工、pH 值為 4 ?8。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK104212789SQ201310226114
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】梁云霄, 張群, 張瑞豐, 張育淇, 劉曉貞, 劉燕, 金林鈴 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)