評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的方法，其中所述細(xì)胞是配子、胚胎、核體、推定的干細(xì)胞群體、干細(xì)胞前體群體或者干細(xì)胞群體。該方法包括將解凍細(xì)胞在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育和測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。
【專(zhuān)利說(shuō)明】評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的方法
[0001]本申請(qǐng)是2007年I月26日提交的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN200780010271.3的分案申請(qǐng)，后者是PCT/GB2007/000277的中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)。
[0002]為了 IVF過(guò)程中的成功率，刺激卵巢以產(chǎn)生多于一個(gè)的卵母細(xì)胞(oocyte)。結(jié)果，大多數(shù)IVF周期導(dǎo)致胚胎(embryo)的總數(shù)超過(guò)了用于在單個(gè)周期中轉(zhuǎn)移至個(gè)體患者的最適量(optimum)。對(duì)此問(wèn)題合乎倫理和經(jīng)濟(jì)的方法是胚胎冷藏(cryopreservation)。胚胎冷藏允許儲(chǔ)藏特大數(shù)量的(supernumeracy)優(yōu)質(zhì)胚胎直至它們能在后面的周期中被轉(zhuǎn)移，從而減少了達(dá)到懷孕所需的刺激卵巢藥物處理周期的數(shù)目，并因此減少了患卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome)的風(fēng)險(xiǎn)(Trounson, 1986),且提供了對(duì)多胎妊娠的防止。冷藏還允許在自發(fā)排卵周期或者雌激素和孕酮激素水平不超過(guò)天然存在的水平的周期中替換(replacement)解凍的胚胎，因此增加了每個(gè)患者的懷孕率。大多數(shù)的輔助受孕單位常規(guī)地提供前核的或早期卵裂期(early cleavage stage)的胚胎的冷藏。
[0003]利用了速度受控冷凍技術(shù):在冷凍保護(hù)劑流體中緩慢冷卻胚胎，從體溫降至-196°C (此處所有的細(xì)胞過(guò)程停止)，在該溫度將它們儲(chǔ)藏于液氮容器中。所述的冷凍保護(hù)劑用于保護(hù)細(xì)胞免受損害。當(dāng)將這些細(xì)胞解凍時(shí)，從液氮中取出它們，解凍，除去冷凍保護(hù)劑，和培養(yǎng)細(xì)胞。導(dǎo)致細(xì)胞損害以及危害解凍后功能和發(fā)育的幾個(gè)因素與冷卻和冷藏有關(guān)。細(xì)胞損害可由細(xì)胞內(nèi)冰(intracellular ice)的形成然后該細(xì)胞內(nèi)冰的快速冷卻引起；細(xì)胞外冰的形成也導(dǎo)致在未結(jié)冰部分電解質(zhì)濃度的增加以及細(xì)胞脫水。利用膜溶質(zhì)相互作用(membrane solute interaction)的體外模型檢測(cè)到:脫水和復(fù)水(re-hydration)導(dǎo)致脂質(zhì)膜上的機(jī)械應(yīng)力并引起物理變形和相(Phase)行為的改變。這些物理改變可在多種程度影響細(xì)胞:可改變細(xì)胞膜和細(xì)胞器；已顯示圍繞胚胎的透明帶(zona pellucida)在冷藏過(guò)程中遭受(一定量的)硬化，以及紡錘體進(jìn)而染色體分離會(huì)受到損害。近來(lái)，已顯示一些基因受到冷凍和解凍過(guò)程的誘導(dǎo)，這說(shuō)明該細(xì)胞積極響應(yīng)刺激(insult)。與冷凍保護(hù)劑組合的緩慢冷凍允許通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)冰和減少溶質(zhì)濃度增加的影響來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于上述有害的機(jī)制(mechanism)。所述細(xì)胞外冰驅(qū)動(dòng)細(xì)胞經(jīng)由平衡過(guò)程脫水。更快速的方法，即玻璃化(vitrification),使用高濃度(high level)的冷凍保護(hù)劑和非常快速的冷卻，以使細(xì)胞內(nèi)冰的形成最小化。它是非平衡方法。
[0004]冷凍和冰形成導(dǎo)致雙層(即兩層)脂質(zhì)膜的脫水。借助冷凍(with freezing)液體結(jié)晶至凝膠的相變導(dǎo)致磷脂的烴尾部的有序化成為更加緊密的和平行的陣列，這可引起對(duì)水和陽(yáng)離子的滲透性增加、整合膜蛋白的分離、膜結(jié)合酶的活性降低、蛋白質(zhì)的徑向擴(kuò)散的降低。精子和卵母細(xì)胞很可能經(jīng)歷類(lèi)似的作用，盡管它們的脂質(zhì)構(gòu)成非常不同。成熟卵母細(xì)胞具有位于減數(shù)分裂的紡錘體處的微管。將溫度降至25°C于10分鐘使微管破裂，而且完全分裂(dissolution)發(fā)生于0°C。在小鼠中重新升溫導(dǎo)致微管的重建，但是這不發(fā)生于人中，因?yàn)槿狈Τ珊思?xì)管聚合(nucleate tubule polymerization)所需的中心粒旁物質(zhì)。因紡錘體解體，所得的卵母細(xì)胞往往可以具有非整倍性(aneuploidy)(即染色體數(shù)目異常)。冷凍還可通過(guò)降低透明帶的胰凝乳蛋白酶敏感性和皮質(zhì)顆粒(cortical granule)而影響受精。實(shí)際上殼可能太“堅(jiān)硬”。Linford和Meyers使用單細(xì)胞凝膠電泳顯示精子可能受到損傷。線粒體也易受冷藏?fù)p傷。在冷藏和隨后的培養(yǎng)過(guò)程中，卵母細(xì)胞DNA的退化似乎涉及細(xì)胞凋亡(apoptosis)過(guò)程,并檢測(cè)到典型標(biāo)記(classic markers)和胱天蛋白酶(caspase)。因此細(xì)胞經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡。感興趣的是，還激活了與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的基因，包括與熱休克蛋白、氧化應(yīng)激清除劑(scavenger)和涉及葡萄糖代謝的酶有關(guān)的基因。
[0005]盡管胚胎冷藏通常被認(rèn)為是安全的方法(Wood)，仍然存在關(guān)于該技術(shù)的長(zhǎng)期安全性的爭(zhēng)議(Winston和Hardy，2002)。這主要是小鼠中進(jìn)行的研究的結(jié)果，其中已顯示胚胎冷凍可影響植入前后期發(fā)育(late preimplantation development)中的新陳代謝(Emiliani等,2000)和具有只在發(fā)育后期顯示的更精細(xì)的(subtle)長(zhǎng)期效果(Dulioust等，1995)。也有報(bào)道人胚胎的冷凍改變了基因表達(dá)模式(Tachataki等，2003)。這些研究者發(fā)現(xiàn)第2天冷凍胚胎比第2天新鮮胚胎含有更少的結(jié)節(jié)性硬化基因(tuberous sclerosisgene)TSC2 的 mRNA。
[0006]對(duì)于冷藏技術(shù)用途的主要關(guān)注是凍傷造成的可能的胚胎損失，這意味著一些健康胚胎可以不存活于冷凍和解凍的應(yīng)激。凍傷造成的胚胎損失的精確數(shù)目可變化，但非?？赡艿氖抢鋬鰰?huì)引起一些胚胎的損失，可能與冷藏的那些胚胎的25-50%—樣多。對(duì)此的一種解釋是冷藏甚至可以作為更有活力的胚胎的“選擇門(mén)(selection gate) ”，盡管這尚未得到證實(shí)。
[0007]對(duì)于冷藏的另一關(guān)注是由冷凍/解凍胚胎產(chǎn)生的兒童中先天缺損的潛在風(fēng)險(xiǎn)。在家畜工業(yè)中，大規(guī)模的胚胎冷凍和移植未導(dǎo)致先天缺損的增加。到目前為止，對(duì)那些出身于解凍胚胎的人后代(human offspring)的研究,未顯示相比于此群體的其余者懷孕結(jié)果出現(xiàn)異常性方面任何顯著的增加。
[0008]總的說(shuō)來(lái)，冷藏導(dǎo)致植入可能性30?40 %的下降(Edgar等，2000和2005 ；El-Toukhy等，2003)。其它研究已顯示類(lèi)似的冷凍解凍胚胎的臨床懷孕和植入率的范圍為10 至 30%和 5 至 15% (Van der Elst 等，1997 ;Kowalik 等，1998 ;Ubaldi 等，2004)。在冷凍周期中的胚胎轉(zhuǎn)移成功率的降低歸因于這樣的事實(shí):冷藏胚胎必須另外忍受冷凍和解凍過(guò)程，該過(guò)程通常在本領(lǐng)域中被認(rèn)為會(huì)改變內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(homeostasis)、新陳代謝、細(xì)胞完整性和發(fā)育潛能(developmental potential)。已知新陳代謝是早期胚胎健康所固有的,且當(dāng)胚胎受到應(yīng)激時(shí)新陳代謝立即擾亂(Houghton和Leese, 2004 ；Lane和Gardner, 2005綜述)。限制冷藏的成功的最重要因素之一是歸因于冷凍過(guò)程中冰晶形成的解凍后胚胎存活率(Liebermann等,2002),所述冰晶形成被認(rèn)為損傷細(xì)胞膜和導(dǎo)致裂球(blastomere)裂解(Pal 等，2004)。
[0009]考慮到以上所述毫無(wú)疑義的是，盡管第一例冷藏之后成功的懷孕報(bào)導(dǎo)于1983，但冷藏的方法依然是相對(duì)新的且對(duì)胚胎和后續(xù)的后代的長(zhǎng)期影響是未知的。冷藏的主要缺點(diǎn)是利用冷凍/解凍胚胎引起懷孕的成功率通常低于在“新鮮周期”中的成功率，植入可能性大體上下降30至40%。這些差異說(shuō)明胚胎的冷凍和解凍會(huì)對(duì)胚胎的存活能力具有有害的影響。當(dāng)處于冷凍狀態(tài)時(shí)冷藏胚胎可保持其存活能力的時(shí)間長(zhǎng)度也是未知的。
[0010]IVF的成功取決于用于轉(zhuǎn)移入子宮的最好胚胎的選擇。在轉(zhuǎn)移前，解凍胚胎，并檢查每個(gè)胚胎從而確定它是否醫(yī)學(xué)上適于轉(zhuǎn)移(能生存的，正常發(fā)育的胚胎)。沒(méi)有用于胚胎質(zhì)量的準(zhǔn)確試驗(yàn)，且"優(yōu)質(zhì)的胚胎"的區(qū)別是主觀的評(píng)估。目前使用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)選擇胚胎。形態(tài)學(xué)評(píng)估包括計(jì)數(shù)胚胎中的細(xì)胞數(shù)和建立其“等級(jí)”;通常在I至4或者I至5級(jí)。然后可將等級(jí)和細(xì)胞數(shù)的測(cè)量組合從而給出具體胚胎的“得分”。對(duì)胚胎的評(píng)分是高度技巧性的工作，且花費(fèi)一般臨床胚胎學(xué)家約3個(gè)月去學(xué)習(xí)。形態(tài)學(xué)評(píng)估的主要問(wèn)題是其涉及的高度主觀性。它不提供發(fā)育潛能的穩(wěn)健檢驗(yàn)(robust test)，因?yàn)槊總€(gè)啟動(dòng)的處理周期只有23%的平均成功率(REF，HFEA)。在解釋該低成功率(盡管是形態(tài)學(xué)上良好的胚胎的轉(zhuǎn)移)的可能原因中有子宮內(nèi)膜的接受能力(Bourgain和Devroey, 2003 ;Devroey等,2004 ；Lukassen等，2004)以及導(dǎo)致連接區(qū)收縮增加的創(chuàng)傷性胚胎轉(zhuǎn)移(Lesny和Killick的綜述，2004)。很多的數(shù)據(jù)表明:在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的胚胎的基因表達(dá)圖式發(fā)生改變但是其形態(tài)學(xué)上顯示正常(Ho 等，1995 ；Rizos 等，2003 ；Rinaudo 和 Schultz, 2004 ；Lee 等，2004)。因此胚胎可能具有正常的形態(tài)但在其生物化學(xué)方面具有改變，這使得目前胚胎學(xué)家不可能選擇絕對(duì)最好的胚胎用于轉(zhuǎn)移。
[0011]在顯微鏡分析之后，只有約50%的冷凍胚胎符合轉(zhuǎn)移的要求。據(jù)認(rèn)為，未能存活于冷藏和解凍過(guò)程的那些胚胎可能產(chǎn)自活力較差的卵母細(xì)胞或精子。冷凍胚胎轉(zhuǎn)移過(guò)程的實(shí)際周期與在IVF周期中獲得的“新鮮”胚胎的實(shí)際周期相同。
[0012]共同未決的專(zhuān)利申請(qǐng)W001/53518顯示在分裂過(guò)程中氨基酸的消耗/出現(xiàn)(“轉(zhuǎn)化”)預(yù)示備用的“新鮮”人胚胎體外發(fā)育至胚泡期(blastocyst stage)的能力(Houghton等，2002)以及導(dǎo)致轉(zhuǎn)移后懷孕和產(chǎn)生活的后代的能力(Brison等，2004)。這些發(fā)現(xiàn)是與一般理論一致的:在發(fā)育的早期決定了發(fā)育能力，且植入前發(fā)育的早期中的擾動(dòng)可具有長(zhǎng)期的牽連(implication) ο
[0013]因?yàn)槔洳丶夹g(shù)能提供輔助避孕的實(shí)際優(yōu)點(diǎn)，所以存在著對(duì)可靠地評(píng)估解凍后的卵或胚胎的發(fā)育能力的需求。
[0014]冷藏不是良性的方法，且細(xì)胞的許多功能可受到影響。因而對(duì)已經(jīng)歷冷藏過(guò)程的胚胎的選擇標(biāo)準(zhǔn)不同于在“新鮮”胚胎的選擇中所使用的那些標(biāo)準(zhǔn)。冷凍過(guò)的胚胎一般生長(zhǎng)較慢，因此形態(tài)學(xué)上非常不同于新鮮胚胎。當(dāng)有著大量的胚胎可用于轉(zhuǎn)移時(shí)，對(duì)用于選擇最好胚胎的有效參數(shù)的需求是極為重要的。植入多胚胎已導(dǎo)致無(wú)法接受的高比率的多胞胎(multiple birth)。輔助受孕的目的是制造健康嬰兒，因此減少多胎妊娠率是主要目的，且轉(zhuǎn)移單個(gè)胚胎是理想的。鑒定具有高植入潛能的胚胎的能力將允許更有效地選擇胚胎用于胚胎轉(zhuǎn)移和在不降低總的懷孕率的條件下降低多胎妊娠的可能性。對(duì)用于選擇最有可能發(fā)育至足月的解凍胚胎的有效參數(shù)的需求是極其重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]根據(jù)本發(fā)明，本文提供了一種評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的方法，其中所述細(xì)胞為配子(gamete)、胚胎(embryo)、核體(karyoplast)、推定的干細(xì)胞群體、干細(xì)胞前體群體或者干細(xì)胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育解凍細(xì)胞和測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。
[0016]出人意料的是，已發(fā)現(xiàn)單個(gè)人胚胎在氨基酸方面的解凍后新陳代謝可用于預(yù)測(cè)發(fā)育至胚泡期的能力。
[0017]本發(fā)明的方法同樣適用于其它哺乳動(dòng)物物種諸如牛和豬。牛胚胎是人的良好模型:牛和人一樣通常為單排卵(monovulator)。牛胚胎的直徑還與人胚胎(?140 μ )大約相同，且具有作為氧、丙酮酸和葡萄糖消耗和/或乳酸生成測(cè)量的大致相似的能量代謝模式。體外生成(IVP)牛受精卵(zygote)在體外達(dá)到胚泡期的比例(20-40% )與人受精卵(20-50% )大約相同，且受精卵基因組激活啟動(dòng)于緊密相關(guān)的階段(在人中4-8細(xì)胞；在牛中8-16細(xì)胞階段)。在桑椹胚(morula):胚泡轉(zhuǎn)變過(guò)程中，豬胚泡的氨基酸新陳代謝模式(profile)在質(zhì)量上和數(shù)量上類(lèi)似于由人胚胎給出的，這說(shuō)明豬胚泡也是人的良好模型。
[0018]該方法同樣容易適用于不同細(xì)胞類(lèi)型，例如配子(處于任意發(fā)育階段)、核體、推定的干細(xì)胞群體、干細(xì)胞前體群體或者干細(xì)胞群體。這些細(xì)胞類(lèi)型都可被冷凍，且適用本發(fā)明的普通原理。以最廣的意義使用術(shù)語(yǔ)存活能力(viability)，其中包括胚胎發(fā)育至胚泡期，胚胎的成功植入和植入前篩選方法。
[0019]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如果變化滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)，則該方法包括選擇所述的用于進(jìn)一步發(fā)育的解凍細(xì)胞的步驟。優(yōu)選該預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)是至少一種氨基酸的增加或減少。
[0020]優(yōu)選培養(yǎng)基包含補(bǔ)充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸和氨基酸的生理混合物的Earle' s平衡鹽溶液。優(yōu)選使用HPLC然后是以鄰苯二甲醒(o-phthaldialdehyde)的衍生化來(lái)測(cè)量已用(spent)培養(yǎng)基中的氨基酸的濃度。
[0021]在該方法的一種實(shí)施方案中，產(chǎn)生氨基酸消耗或生成模式。優(yōu)選氨基酸消耗或生成模式整體上用作評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的選擇標(biāo)記。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，最有活力的(most viable)解凍細(xì)胞的選擇基于一組氨基酸(通常包括2至7種氨基酸)，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的解凍細(xì)胞的指示?；蛘撸钣谢盍Φ慕鈨黾?xì)胞的選擇基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的細(xì)胞的指示。
[0022]優(yōu)選解凍細(xì)胞源于任何的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任何家畜或稀有和受脅(threatened)物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于人。
[0023]優(yōu)選用于選擇標(biāo)記的氨基酸包括包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。
[0024]優(yōu)選該方法包括評(píng)估解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力，所述方法包括:
[0025](i)將解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育，以及；
[0026](ii)測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度的增加和/或減少以測(cè)定氨基酸轉(zhuǎn)化(turnover)，其中有著較小范圍的氨基酸轉(zhuǎn)化的解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎與發(fā)育至胚泡期和/或成功植入關(guān)聯(lián)。
[0027]優(yōu)選該方法還包括選擇所述的解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎用于進(jìn)一步發(fā)育至胚泡期和/或植入的步驟。
[0028]優(yōu)選解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入是在將解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基之后24小時(shí)、10小時(shí)、6小時(shí)或更少時(shí)間內(nèi)完成的。
[0029]優(yōu)選使用該方法評(píng)估解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎用于植入和引起臨床懷孕的能力。通過(guò)植入之后15天的血清hCG檢測(cè)胚胎轉(zhuǎn)移后的臨床懷孕并通過(guò)在5周時(shí)胎心的存在來(lái)確認(rèn)(Brison等，2004)。
[0030]優(yōu)選從發(fā)育的第I天直至第4天來(lái)評(píng)估解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎。
[0031]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括基于氨基酸模式選擇解凍的植入胚胎和將所選的解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎引入生物體的子宮(uterine tract)中。[0032]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎是源于體外成熟的卵的哺乳動(dòng)物植入前胚胎。或者，解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎是源于體內(nèi)成熟的卵的哺乳動(dòng)物植入前胚胎。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)制備解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎。
[0034]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)定至少一種氨基酸(包括利用包含2至7種氨基酸的氨基酸組)的濃度的增大和/或減少，其氨基酸的轉(zhuǎn)化是該物種的解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。
[0035]因此，本發(fā)明提供一種評(píng)估解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的方法，所述方法包括將單個(gè)解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎在包含眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育，測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化，其中該濃度變化是解凍的哺乳動(dòng)物植入前胚胎發(fā)育至胚泡期和/或成功植入的能力的指示。
[0036]本發(fā)明還提供一種區(qū)別有發(fā)育能力(developmentally competent)和發(fā)育停止的(arresting)等級(jí)I胚胎的方法，其包括將等級(jí)I胚胎在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育和測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度的變化。
[0037]發(fā)明詳述
[0038]只通過(guò)實(shí)施例并參考【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】了本發(fā)明:
[0039]圖1從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現(xiàn)。對(duì)于發(fā)育至胚泡期的胚胎η = 21 ;而對(duì)于在胚泡期前發(fā)育停止的胚胎η = 25。*Ρ < 0.05 ;**Ρ< 0.01 ;***Ρ < 0.001不同于O的顯著性(significance from zero)。具有相同上標(biāo)的豎條是顯著不同的；a 和 b，P = 0.001 ；c, P = 0.0025 ；d, P = 0.016 ；e, P = 0.032 ；f, P =
0.0448。
[0040]圖2從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎的總氨基酸的生成、消耗、轉(zhuǎn)化和余額(balance)。*P < 0.05 < 0.01 < 0.001顯著不同于發(fā)育停止的胚胎。
[0041]圖3從發(fā)育的第2天至第3天冷凍解凍的人胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。***p < 0.001顯著不同于發(fā)育胚胎。
[0042]圖4發(fā)育停止或發(fā)育至胚泡期的單獨(dú)的冷凍解凍的胚胎所利用的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和。
[0043]圖5從發(fā)育的第2天至第3天等級(jí)I解凍的人胚胎的氨基酸消耗和出現(xiàn)。對(duì)于發(fā)育至胚泡期的胚胎η = 6 ;對(duì)于在胚泡期前發(fā)育停止的胚胎η = 13。*Ρ < 0.05 < 0.01 ；***Ρ < 0.001不同于O的顯著性。具有相同上標(biāo)的豎條是顯著不同的；a, P = 0.014 ；b, P=0.024 ；c, P = 0.029 ；d, P = 0.035 ；e, P = 0.0493 ；f, P = 0.050。
[0044]圖6從發(fā)育的第2天至第3天等級(jí)I解凍的人胚胎的總氨基酸生成、消耗、轉(zhuǎn)化和余額。*P <0.05顯著不同于發(fā)育停止的胚胎。
[0045]方法
[0046]獲得被告知的患者同意捐贈(zèng)用于研究的備用冷凍人胚胎得自在St James’ sHospital, Leeds的輔助受孕單位進(jìn)行體外受精(IVF)的患者。該工作得到了 HumanFertilisation and Embryology Authority (人受孕和胚胎管理局)(HFEA)以及合作機(jī)構(gòu)的倫理委員會(huì)(Ethics Committees)的完全倫理批準(zhǔn)。[0047]如前所述(Balen，2001)進(jìn)行卵巢刺激和卵母細(xì)胞收集。通常，使用長(zhǎng)期垂體脫敏規(guī)程(long pituitary desensitisation protocol),以及鼻內(nèi)那法瑞林(nafarelin)給藥，然后是用人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG, Menogon, Ferring Pharmaceuticals Ltd)或者重組FSH(Puregon, Organon Laboratories Ltd)進(jìn)行促性腺激素刺激。簡(jiǎn)而言之，在hCG給藥36h后通過(guò)卵泡吸引術(shù)收集卵母細(xì)胞并于37°C在5% CO2中在Med1-Cult IVF培養(yǎng)基浸油(Med1-Cult)中培養(yǎng)。在hCG后約40小時(shí)，用最終濃度為70，000活動(dòng)精子每毫升來(lái)授精卵母細(xì)胞-丘復(fù)合體(oocyte-cumulus complex),并培育過(guò)夜直至通過(guò)兩前核的存在來(lái)確認(rèn)受精(授精后第I天)。在受精卵用于研究前，將受精卵同上在70μ I的Med1-Cult IVF培養(yǎng)基浸油的液滴中培育。在授精后第2天轉(zhuǎn)移最多3個(gè)胚胎，將任何剩余的胚胎冷凍并存儲(chǔ)于液氮中用于可能的將來(lái)用途。根據(jù)HFEA的指導(dǎo)，胚胎只可存儲(chǔ)5年，因此每年(on ayearly basis)聯(lián)系患者以確定他們是否愿意將他們的胚胎繼續(xù)存儲(chǔ)、放棄或捐贈(zèng)用于研究。將這些捐贈(zèng)用于研究的胚胎以干式運(yùn)輸(in a dry shipper)運(yùn)輸至York以用于本研究。
[0048]使用Sydney IVF解凍試劑盒(Cook, Queensland, Australia)將胚胎解凍并置于浸礦油的10 μ IEBSS培養(yǎng)基液滴中約3小時(shí)，該EBSS培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.5%的HSA，ImM的葡萄糖,0.47mM的丙酮酸(pyruvate)，5mM的乳酸(lactate)和氨基酸的接近生理的混合物(aclose to physiological mixture of amino acid) (Tay 等，1997)。每個(gè)患者的胚胎在治療組和所評(píng)估的胚胎的發(fā)育等級(jí)和階段之間隨機(jī)化(Houghton等，2002)。然后將這些胚胎在空氣中于37°C在含有5%的0)2和20%或者5%的O2的增濕氣氛中在4μ I的相同培養(yǎng)基液滴中單獨(dú)地培養(yǎng)24h (從第2天至第3天)。在培育后，評(píng)估胚胎的形態(tài)學(xué)，并將胚胎單獨(dú)置于10 μ I預(yù)平衡的培養(yǎng)基液滴中，并在5%或20%的O2下培育直至發(fā)育的第5天。將已用的培養(yǎng)基儲(chǔ)存于-80°C。又一次評(píng)估發(fā)育階段和等級(jí)，然后將胚胎在5%或20%的O2下的4μ I預(yù)平衡的培養(yǎng)基液滴中單獨(dú)放置24h直至發(fā)育的第6天。在將胚胎從液滴中移出之前，評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育階段和等級(jí)。將已用的培養(yǎng)基儲(chǔ)存于_80°C。
[0049]氨基酸分析
[0050]將無(wú)胚胎的對(duì)照液滴在與含有胚胎的那些液滴相同的培養(yǎng)皿(dish)中培育，從而允許在整個(gè)培養(yǎng)周期中氨基酸濃度的任何非特異性變化。解凍已用培養(yǎng)基，并用23 μ I的HPLC級(jí)水稀釋2 μ I等分試樣。利用附接于Jasco F920熒光探測(cè)儀和4.5x250mm的Hypersil 0DS-16 柱(Jones Chromatography)的 Kontron500 通過(guò)反相 HPLC 進(jìn)行氨基酸分析，如前所述(Houghton等,2002)。簡(jiǎn)單地說(shuō),通過(guò)使25 μ I樣品與等體積的試劑(10 μ I的2-巰基乙醇和5ml的鄰苯二甲醛(OPA)試劑)自動(dòng)反應(yīng)來(lái)完成衍生化。以1.3毫升/分鐘的流速操作洗脫梯度。溶劑A由18ml的四氫呋喃(Fisher Chemicals), 200ml的甲醇和800ml的乙酸鈉(83mmol/l, ρΗ5.9)組成。溶劑B由800ml的甲醇和200ml的乙酸鈉(83mmol/l,pH5.9)組成。利用該方法不可能檢測(cè)到脯氨酸和半胱氨酸。
[0051]統(tǒng)計(jì)分析
[0052]利用Anderson-Darling正態(tài)檢驗(yàn)來(lái)分析所有的數(shù)據(jù)以確定它們是否為正態(tài)分布。利用1-樣品t-檢驗(yàn)或I樣品Wilcoxon檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)氨基酸消耗/出現(xiàn)的數(shù)據(jù)不同于O的顯著性，這取決于該數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布的。利用Student’ s t_檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析發(fā)育停止的胚胎和發(fā)育中的胚胎的氨基酸模式間的差異。通過(guò)Student’ s t-檢驗(yàn)分析氨基酸消耗、出現(xiàn)、轉(zhuǎn)化和余額之間的差異。
[0053]結(jié)果
[0054]第2天至第3天解凍胚胎的氨基酸轉(zhuǎn)化
[0055]培養(yǎng)基顯著地消耗了絲氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(圖1)，同時(shí)出現(xiàn)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。隨后未能發(fā)育至胚泡期的解凍胚胎消耗了谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸，而生成了天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸。發(fā)育至胚泡期的那些解凍胚胎和胚泡形成前發(fā)育停止的那些胚胎之間在谷氨酰胺(P = 0.001)、丙氨酸(P = 0.001)、甘氨酸(P = 0.0025)、谷氨酸(P = 0.016)、精氨酸(P = 0.032)和賴氨酸(P = 0.0448)的利用上存在顯著的差異(圖1)。
[0056]出乎意料的是，隨后未能發(fā)育至胚泡期的一群冷凍/解凍的第2天至第3天的胚胎比發(fā)育至胚泡期的那些含有更多的等級(jí)I胚胎(表I)，但是隨后發(fā)育至胚泡的等級(jí)I胚胎與胚泡形成前發(fā)育停止的等級(jí)I胚胎之間，在每胚胎的裂球平均數(shù)上不存在差異。同樣地，在這兩組之間不存在總平均裂球數(shù)之間的差異(表I)。
[0057]總的來(lái)說(shuō)，在胚泡期之前發(fā)育停止的胚胎在氨基酸轉(zhuǎn)化、消耗(P = 0.011)和生成(P = 0.009)顯著更多的氨基酸方面，比它們發(fā)育中的對(duì)等物(counterpart)在代謝上更活躍(圖2)。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)發(fā)育中的胚胎在它們的氨基酸轉(zhuǎn)化方面是平衡的，也就是說(shuō)，消耗量等于生成量；然而發(fā)育停止的胚胎具有負(fù)的余額，也就是說(shuō)，從培養(yǎng)基中消耗的氨基酸多于它們生成的氨基酸(圖2)。發(fā)育至胚泡期的那些胚胎和在胚泡形成前發(fā)育停止的那些胚胎之間，在從第2天到第3天谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和上存在著顯著的差異(P < 0.001)(圖3)。使用單獨(dú)胚胎的谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸的總和，可能以91%準(zhǔn)確性預(yù)測(cè)哪些胚胎將發(fā)育至胚泡期(圖4)。
[0058]當(dāng)確定了等級(jí)I胚胎的氨基酸模式時(shí)，隨后發(fā)育至胚泡期的那些胚胎與在胚泡形成前發(fā)育停止的那些等級(jí)I胚胎相比，在氨基酸消耗/出現(xiàn)上存在顯著差異(圖5)。兩組間具體的差異存在于賴氨酸(P = 0.014)、甘氨酸(P = 0.024)、色氨酸(P = 0.029)、精氨酸(P = 0.035)、谷氨酸(P = 0.0493)和谷氨酰胺(P = 0.050)的利用上。應(yīng)注意的是:等級(jí)I發(fā)育停止的胚胎和發(fā)育中的胚胎之間，在裂球平均數(shù)上不存在顯著的差異(表I)。在總氨基酸的消耗、出現(xiàn)或者氨基酸的余額上，等級(jí)I胚胎不顯示顯著的差異(圖6)。然而，發(fā)育停止的等級(jí)I胚胎在氨基酸轉(zhuǎn)化方面比發(fā)育至胚泡期的那些胚胎在代謝上更活躍。
[0059]表1:解凍后胚胎的等級(jí)分布和平均裂球數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的方法，其中所述細(xì)胞是配子、胚胎、核體、推定的干細(xì)胞群體、干細(xì)胞前體群體或者干細(xì)胞群體，所述方法包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育解凍細(xì)胞和測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其還包括如果所述變化滿足預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)則選擇所述的解凍細(xì)胞用于進(jìn)一步發(fā)育的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中培養(yǎng)基包含Earle's平衡鹽溶液，所述Earle' s平衡鹽溶液補(bǔ)充有葡萄糖、L-乳酸、丙酮酸以及氨基酸的生理混合物。
4.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的方法，其中使用HPLC然后是以鄰苯二甲醛的衍生化來(lái)測(cè)量在已用的培養(yǎng)基中氨基酸的濃度。
5.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的方法，其中產(chǎn)生了氨基酸消耗或生成模式。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評(píng)估解凍細(xì)胞的存活能力的選擇標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中最有活力的解凍細(xì)胞的選擇是基于通常包括2至7種氨基酸的一組氨基酸，這組氨基酸的消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的解凍細(xì)胞的指示。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中最有活力的解凍細(xì)胞的選擇是基于單一的氨基酸，其消耗或生成模式是該物種的健康、發(fā)育中的細(xì)胞的指示。
9.根據(jù)任意前述權(quán)利要求的方法，其中所述解凍細(xì)胞源于任意的生物體，該生物體包括人、牛、豬、羊、任意家畜或者稀有和/或受脅物種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中該方法用于人。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中用于選擇標(biāo)記的氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、賴氨酸中的一種或它們的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中用于選擇標(biāo)記的氨基酸是谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。
13.—種區(qū)分有發(fā)育能力的和發(fā)育停止的等級(jí)I胚胎的方法，其包括在含有眾多氨基酸的培養(yǎng)基中培育等級(jí)I胚胎和測(cè)定該培養(yǎng)基中至少一種氨基酸的濃度變化。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其還包括如果所述變化滿足預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)則選擇所述的等級(jí)I胚胎用于進(jìn)一步發(fā)育的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的方法，其中產(chǎn)生了氨基酸消耗或生成模式。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述氨基酸消耗或生成模式整體上用作評(píng)估細(xì)胞的存活能力的選擇標(biāo)記。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中最有活力的細(xì)胞的選擇是基于一組氨基酸，優(yōu)選賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103529218SQ201310225929
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2006年1月27日
【發(fā)明者】亨利·J·利斯, 弗蘭切斯卡·D·霍頓 申請(qǐng)人:諾沃塞勒斯有限公司