MiR-17,miR-20a,miR-29c和miR-223作為鼻咽癌分子標(biāo)志物的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了MiR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223作為鼻咽癌分子標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明提出利用血清中4個(gè)微小RNA作為鼻咽癌的分子標(biāo)志物并提出了檢測(cè)方法：抽取外周血血清中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR法獲得4個(gè)微RNA Ct值，通過(guò)公式A＝(CtmiR-29c+CtmiR-223)-(CtmiR-17+CtmiR-20a)計(jì)算A值。A值＞-3.30為陽(yáng)性，可提示鼻咽癌；A值＜-3.30為陰性，可提示非鼻咽癌。本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)各種人群外周血中4個(gè)微小RNA的表達(dá)狀況，從而預(yù)測(cè)鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，用于鼻咽癌高危人群的篩查，對(duì)鼻咽癌患者做出快速無(wú)創(chuàng)的診斷。
【專(zhuān)利說(shuō)明】M i R-1 7, mi R-20a，mi R-29c和mi R-223作為鼻咽癌分子標(biāo)志 物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤分子標(biāo)志物，特別涉及微小RNA在鼻咽癌高危人群篩查和早期診 斷中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 鼻咽癌具有明顯的地域和種族分布特征，我國(guó)是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，特別是在我國(guó) 南方地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，男性鼻咽癌發(fā)病率15?50/10萬(wàn)，排在惡性腫瘤第三位，臺(tái)灣也是鼻咽 癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率男女分別為8. 3/10萬(wàn)和3. 5/10萬(wàn)，而在歐美等西方國(guó)家，鼻咽癌罕 見(jiàn)，鼻咽癌也被形象的稱(chēng)為"中國(guó)癌"。鼻咽癌發(fā)病隱秘，早期沒(méi)有明顯臨床表現(xiàn)，不容易發(fā) 現(xiàn)，且鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生早。因此，鼻咽癌早期診斷相當(dāng)困難。目前，臨床上針對(duì)鼻咽癌 的篩查主要是檢測(cè)血液中EB病毒感染情況，如EBV-DNA、EBV-VCA-IgA等。但鼻咽癌與EBV 并非完全相關(guān)，且許多疾病（如淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、咽炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等）都 可伴有EBV感染，健康人群也有一定比例感染者，大量的臨床實(shí)踐證明，EBV相關(guān)檢測(cè)診斷 鼻咽癌的靈敏度與特異性都不高，達(dá)不到作為早期診斷標(biāo)志物的要求。良好的分子標(biāo)記物 篩選方法，應(yīng)當(dāng)是創(chuàng)傷小而重復(fù)性好，此外，篩選技術(shù)應(yīng)足夠靈敏，既可檢測(cè)出早期癌癥，又 可準(zhǔn)確地將未患癌癥者進(jìn)行區(qū)分。因此，最為理想的是通過(guò)簡(jiǎn)單的血樣檢測(cè)即可檢測(cè)出腫 瘤組織特異性分子。
[0003] 血液在人體各個(gè)組織和器官中循環(huán)，并與周?chē)膬?nèi)環(huán)境發(fā)生著密切的物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng) 和信息交換，機(jī)體的生理及病理變化都會(huì)被"記錄"在血液內(nèi)，血液天然的反映著機(jī)體各個(gè) 部位的生理和病理狀態(tài)。在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血液中相關(guān)成分的改變往往早于形態(tài)學(xué) 的改變。而且，血液樣品具有容易獲取、基本無(wú)創(chuàng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是理想的臨床檢測(cè)材料。因 此，血液是腫瘤標(biāo)志物篩選的理想材料，疾病血液標(biāo)志物也是最方便臨床直接應(yīng)用的研究 成果。
[0004] 多個(gè)研究小組也報(bào)道了在血清和血漿中存在大致等量的微RNA。由于這些血漿/ 血清微RNA存在于血液循環(huán)內(nèi)，因此稱(chēng)作循環(huán)微RNA。循環(huán)微RNA十分穩(wěn)定，其穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于循環(huán)mRNA。循環(huán)微RNA不容易被血液內(nèi)源性和外源性RNases降解，在室溫下放置24h 和反復(fù)凍融8?10次后，其中的微RNA量沒(méi)有明顯變化，并且還能耐受較酸和較堿的環(huán)境。 有人認(rèn)為可能是因?yàn)槠渑c某些蛋白結(jié)合或包裹在囊泡內(nèi)而得到保護(hù)。此外，不同健康個(gè)體 的血清和血漿微RNA表達(dá)水平相當(dāng)一致，沒(méi)有明顯個(gè)體差異，而腫瘤能明顯影響血清和血 漿中微RNA的表達(dá)。循環(huán)微RNA的穩(wěn)定性和人群一致性是具有良好的重復(fù)性和可比性的基 礎(chǔ)；微RNA分子很小，相對(duì)其他類(lèi)型RNA，微RNA比較容易從細(xì)胞內(nèi)保留并釋放至血循環(huán)內(nèi)， 更能夠反映疾病的特征，可能具有較好的疾病特異性。循環(huán)微RNA的這些優(yōu)勢(shì)說(shuō)明，它具有 成為疾病分子標(biāo)記物的極佳條件。
[0005] 綜上所述，血清微RNA具有成為鼻咽癌診斷標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，本發(fā)明公開(kāi)了 一種新型鼻咽癌分子標(biāo)志物，其檢測(cè)方法也具有快速、無(wú)創(chuàng)的特點(diǎn)，具有重要的臨床意義和 價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提出MiR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223能作為鼻咽癌發(fā)生 風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)待檢測(cè)者血清中的表達(dá)水平，用于鼻咽癌高危人群的篩查。
[0007] 發(fā)明人在前期研究工作中通過(guò)篩查正常人和鼻咽癌人群的血清miRNA表達(dá)譜，發(fā) 現(xiàn)miR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223的表達(dá)水平存在明顯的差異，通過(guò)大樣本病例分 析，證明miR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223能聯(lián)合作為鼻咽癌的分子標(biāo)志物。
[0008] 本發(fā)明檢測(cè)外周血中miR-17, miR-20a，miR-29c，和miR-223的方法為：（1)收集 待測(cè)個(gè)體外周血，促凝，收集血清；（2)抽提血清中總RNA，以總RNA為模板將miRNAs逆轉(zhuǎn)錄 為 cDNA ; (3)用 miR-17, miR-20a，miR-29c 和 miR-223stem-loop 引物進(jìn)行 Real-Time PCR 擴(kuò)增，獲得 4 個(gè) miRNAs(miR-17，miR-20a，miR-29c 和 miR-223)表達(dá) Ct 值；（4)計(jì)算 A 值= (CtmiK_29c;+CtmiK_223)-(Ct miK_17+CtmiK_2J，判斷 A 值> -3. 30 為陽(yáng)性，可提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性；A 值< -3. 30為陰性，可提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陰性。
[0009] 本發(fā)明定量的檢測(cè)外周血中miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223表達(dá)狀況，從而 預(yù)測(cè)鼻咽癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，用于鼻咽癌高危人群的篩查，并對(duì)鼻咽癌患者做出快速、無(wú)創(chuàng)性診 斷。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1 :Real-Time PCR法檢測(cè)4個(gè)miRNAs在鼻咽癌病人和非癌人群血清中的差異 表達(dá)
[0011] 圖2 :A :4個(gè)miRNA在鼻咽癌病人與非癌人群血清中聚類(lèi)分析；B :基于4個(gè)miRNA 在血清中的表達(dá)水平，利用公式A = (Ct^m+Ct^m) - (Ct^m+Ct^i)計(jì)算A值，A =-3. 3能較準(zhǔn)確區(qū)分鼻咽癌病人和非癌病人

【具體實(shí)施方式】
[0012] 在前期工作中，發(fā)明人利用miRNA芯片和SPSS15. 0軟件分析篩查20例正常人和 2〇例鼻咽癌患者血清中差異表達(dá)的miRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNAs具有明顯的表達(dá)差異，其中 miR-17, miR_20a明顯上調(diào)，miR_29c和miR-223明顯下調(diào)。通過(guò)進(jìn)一步的組織研究發(fā)現(xiàn)， 4個(gè)miRNAs在不同病理分期中，在腫瘤組織中的表達(dá)狀況與癌旁鼻咽組織也存在明顯的差 異，這些提示，4個(gè)miRNAs可以作為鼻咽癌的分子診斷標(biāo)志物。
[0013] 實(shí)施例一外周血血清樣本中miR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223的檢測(cè)
[0014] 1.血清采集
[0015] (1)使用BD5ml血清采集管采集靜脈空腹血，盡量滿(mǎn)管，約4ml，輕輕顛倒3次；
[0016] ⑵室溫靜置lh ;
[0017] (3)離心，X1600g，10min，4°C ;
[0018] (4)冰上小心吸取上層血清至1. 5ml Tube，約600 μ 1/管，編號(hào)、標(biāo)記，-80°C保存；
[0019] 2.血清總RNA的提取
[0020] (1)將血清樣品冰上解凍
[0021] ⑵取血清樣品（500 μ 1/管）加等體積2 X變性液，震蕩混勻，冰上孵育5分鐘
[0022] (3)加等體積（1000 μ 1/管）酸性酚：氯仿，震搖60sec
[0023] (4)離心（12000g，室溫，5min),吸取上層水相至一新Tube
[0024] (5)重復(fù)2、3步驟2次
[0025] (6)將上層水相小心吸至新管，計(jì)算體積，加入1. 25倍乙醇（100% )，充分混勻
[0026] (7)將吸附柱放置收集管之上，吸取上述樣品與乙醇的混合液至吸附柱，每次體積 不超過(guò)700 μ 1，將吸附柱和收集管同時(shí)離心過(guò)濾（5000g，室溫，15sec)，倒掉Collection Tube中的濾液，用相同的方法將同一個(gè)樣品剩余的液體過(guò)濾
[0027] (8)加700μ 1 miRNA Solutionl至已結(jié)合樣品的吸附柱，離心（6000g，室溫， 15sec)，倒去收集管內(nèi)的濾液
[0028] (9)加入 500 μ 1 miRNA Solution2/3 至吸附柱 g，離心（6000g，室溫，15sec)，倒去 收集管內(nèi)的濾液
[0029] (10)重復(fù)8步驟1次
[0030] (11)離心甩干吸附柱內(nèi)殘余液體（8000g，室溫，2min)
[0031] (12)在吸附柱下接一新收集管，在吸附柱加入95°C預(yù)熱的無(wú)酶水60 μ 1，立即蓋 上蓋子，靜置2min
[0032] (13)將吸附柱和收集管同時(shí)離心（8000g，室溫，2min)，離心后收集管內(nèi)的液體即 為總RNA樣品溶液
[0033] (14)樣品如用于芯片檢測(cè)，需將RNA樣品這空抽干濃縮至約15 μ 1
[0034] (15)將樣品立即保存與-80°C。
[0035] 3.細(xì)胞總RNA的鑒定和定量
[0036] (1)打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，設(shè)置為260/280nm檢測(cè)0D值；
[0037] (2)向含有2 μ 1樣品的管中加入無(wú)酶水198 μ 1至200 μ 1 (稀釋100倍）；
[0038] (3)用無(wú)酶水洗滌比色杯；
[0039] (4)甩干比色杯內(nèi)水分，并用擦鏡紙吸干水分；
[0040] (5)向比色杯中加入200μ 1無(wú)酶水，作為空白，并放入紫外分光光度計(jì)測(cè)定空白 0D值（注意比色杯有字的一面朝外）；
[0041] (6)甩干比色杯內(nèi)水分，并用擦鏡紙吸干水分，然后將200μ 1樣品加入比色杯，測(cè) 0D值，記錄Α260及Α260/Α280比值；
[0042] (7)無(wú)酶水洗滌比色杯，甩干比色杯內(nèi)水分，繼續(xù)測(cè)下一個(gè)樣品；
[0043] (8)濃度計(jì)算：Α260Χ4 =總 RNA 濃度（μ g/ μ 1) ;Α260/Α280 比值在 1. 8-2. 0 之間 最佳。
[0044] 4. miRNA 逆轉(zhuǎn)錄
[0045] (1)按照以下準(zhǔn)備試劑，所有操作在冰上進(jìn)行。
[0046] 20 μ 1 體系：
[0047] 5*miScript RT 緩沖液 4ul 無(wú) Rnase水 適量 逆轉(zhuǎn)錄酶 lul Template RNA 適量
[0048] (2)PCR 儀進(jìn)行 RT 反應(yīng)（16°C，60min ;95°C，5min ;4°C保存）
[0049] (3)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20°C
[0050] 5.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA
[0051] (1)按照以下表格準(zhǔn)備試劑，所有操作在冰上進(jìn)行：
[0052] 20 μ 1 體系
[0053] 2XSYBR Green PCR Master Mix 10 μ 1 lOXmiScript 通用引物 2μ1 lOXmiScript 特異引物 2μ1 無(wú) Rnase水 適量體積 cDNA模板 適量體積
[0054] (2)加樣至PCR管，在熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。
[0055] Cyclel ： (IX)
[0056] Stepl ：95. 0°C forl5:00.
[0057] Cycle2 ： (40X)
[0058] Stepl ：94. 0°C for00:15.
[0059] Step2 ：55. 0°C for00:30.
[0060] Step3 ：70. 0°C for00:30.
[0061] Cycle3 ：(67X)
[0062] Stepl ：55. 0°C -95. 0°C forOO: 15.
[0063] 6.數(shù)據(jù)分析
[0064] 本發(fā)明中，獲取 4 個(gè) miRNAs 的 Ct 值，按照判別方程 A = (CtmiK_29e+CtmiK_223) - (CtmiK -17+CtmiK_2(J，進(jìn)行判斷，當(dāng)A > -3. 30為陽(yáng)性，提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性。
[0065] 實(shí)施例2miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223判別方程在正常人和鼻咽癌患者血 清中的臨床驗(yàn)證
[0066] 按照上述方法，檢測(cè)了 57例正常人血清和74例鼻咽癌患者血清中4個(gè)miRNAs的 表達(dá)。與正常人血清中的A值相比，其中72例患者外周血中miR-17，miR-20a，miR-29c和 miR-223表達(dá)明顯差異，其A > -3. 30,為陽(yáng)性，提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性，同時(shí)被病理組織檢測(cè) 證實(shí)均為鼻咽癌患者，55例正常人的血清計(jì)算A值均< -3. 30,其特異性為96. 5%，敏感度 為 97. 3%。
[0067] 以上研究表明，外周血血清中4個(gè)miRNAs可以作為鼻咽癌患者診斷的分子標(biāo)志 物，當(dāng)判別方程A值> -3. 30為陽(yáng)性，提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性，預(yù)示鼻咽癌發(fā)生的可能性為 97. 3%。檢測(cè)外周血血清4個(gè)miRNAs的表達(dá)，具有很好的穩(wěn)定性，可以用于鼻咽癌高危人 群篩查和無(wú)創(chuàng)輔助診斷。
【權(quán)利要求】
1. MiR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223作為鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物的醫(yī)藥用 途。
2. -種檢測(cè)血清中MiR-17, miR-20a，miR-29c和miR-223的表達(dá)水平的方法，其特征 在于包括步驟：（1)收集待測(cè)個(gè)體外周血，促凝，收集血清；（2)抽提血清中總RNA，以總RNA 為模板將 miRNAs 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA ; (3)用 miR-17，miR-20a，miR-29c 和 miR-223stem-loop 引 物進(jìn)行 Real-Time PCR 擴(kuò)增，獲得 4 個(gè) miRNAs(miR-17, miR-20a，miR-29c，和 miR-223)表 達(dá) Ct 值；(4)計(jì)算 A 值=(CtmiK_29c;+Ct miR-223 )-(CtmiR-17+Ct miR-20a^ °
3. 判斷標(biāo)準(zhǔn)為：A值> -3. 30,提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性；A值< -3. 30,提示鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陰 性。
4. 按照權(quán)利要求書(shū)2中方法，其特征在于檢測(cè)外周血血清中4個(gè)miRNA分子即miR-17， miR-20a，miR-29c 和 miR-223 表達(dá)水平。
5. 按照權(quán)利要求書(shū)2中方法，其特征在于判別標(biāo)準(zhǔn)為A值> -3. 30提示患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn) 陽(yáng)性；A值< -3. 30提示患鼻咽癌風(fēng)險(xiǎn)陰性。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104232741SQ201310224968
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月7日
【發(fā)明者】李桂源, 彭淑平, 曾希, 李夏雨, 牛蔓, 韋娉嬪 申請(qǐng)人:中南大學(xué)