專利名稱：與替莫唑胺治療膠質(zhì)母細胞瘤相關的分子標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及疾病診斷領域，特別是涉及用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的分子標志物及其相關試劑盒。
背景技術：
神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，約占成人顱內(nèi)腫瘤的40 50%。膠質(zhì)母細胞瘤 (GBM)約占所有膠質(zhì)瘤臨床病例的50%左右，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性度最高的腦腫瘤之一。 原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)約占所有膠質(zhì)母細胞瘤臨床病例的 90%以上，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性度最高的腦腫瘤之一。膠質(zhì)母細胞瘤呈侵襲性生長、手術切除困難、復發(fā)率和致死率極高，是當今神經(jīng)外科領域的國際性難題。針對膠質(zhì)母細胞瘤，目前強調(diào)最大程度手術切除、放射治療和化學治療等綜合治療策略，然而患者生存預后極差， 中位生存期約為12 14個月。大量臨床研究表明，常規(guī)病理學診斷相同的膠質(zhì)母細胞瘤， 對各種治療的效果及臨床預后存在顯著差異，其浸潤、復發(fā)、轉移情況也多有不同，有的患者僅僅存活數(shù)周，而有的患者卻可以存活幾年以上。因此，年齡等傳統(tǒng)臨床預后因素的預測價值極為有限。現(xiàn)代觀點認為，分子標志物廣泛應用于臨床可以改善對腫瘤患者的治療效果[1]。 近年來，腫瘤基因組學研究不斷進展，運用基因表達譜芯片等高通量的檢測方法已經(jīng)研究出大量具有臨床價值的腫瘤分子標志物。最新研究證實，微小RNA(microRNA，miRNA)表達譜芯片在腫瘤分類方面比蛋白編碼基因表達譜芯片更加準確和有效[2-4]。microRNA作為腫瘤分子標志物與mRNA相比具有更大的優(yōu)勢，因為對于數(shù)量在40000以上的人類基因，從大約1000個人類microRNA中尋找可靠標志物將會變得容易的多。而且microRNA相對更加穩(wěn)定而不易降解，可以用于長期保存的石蠟包埋標本。因此，我們從microRNA表達譜芯片中獲得的信息將可以作為普通基因表達譜芯片的有益補充。microRNA是長度在大約22nt左右的單鏈、非編碼RNA，其主要作用在于轉錄后水平調(diào)控成百上千個基因的表達，因而具有廣泛的生物學功能[5，6]。目前研究表明， microRNA與某些人類腫瘤的臨床預后顯著相關，如白血病[7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]、肝細胞癌[10]、結腸癌[11]以及卵巢癌[12]等等。然而，microRNA標志物能否預測膠質(zhì)母細胞瘤患者的臨床預后至今未見報道。一項膠質(zhì)母細胞瘤治療重大進展是發(fā)現(xiàn)烷化劑替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合放療有益于患者預后。盡管數(shù)據(jù)顯示只有10%的病人通過這種治療方案獲得5年生存期，但所有膠質(zhì)母細胞瘤患者都需接受這種治療方案，因為目前不能預測哪些患者可以從這種治療方案中受益。因此，具有預測作用的生物標記物的發(fā)現(xiàn)，成為了神經(jīng)腫瘤領域的主要挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療的分子標志物的發(fā)現(xiàn)，以及開發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者是否需要用替莫唑胺治療的試劑盒。
在本發(fā)明的一個實施方式中公開一種用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的試劑盒，試劑盒包括測定膠質(zhì)母細胞瘤患者的miR-lSld水平的試劑盒和任選地所述試劑盒使用說明書。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述試劑盒進一步包括從膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤組織樣品中提取RNA的試劑盒和任選地所述試劑盒使用說明書。在本發(fā)明的還另一個實施方式中，所述試劑盒是miRNA表達譜試劑盒；或者所述試劑盒是qRT-PCR試劑盒。在本發(fā)明更另一個實施方式中，所述測定膠質(zhì)母細胞瘤患者的HiiR-ISld水平與與膠質(zhì)母細胞瘤患者總生存期呈負相關。在本發(fā)明的一個實施方式中，公開了一種用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的分子標志物miR-181d。本發(fā)明在此報道m(xù)iR-181d作為膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療的分子標志物的發(fā)現(xiàn)，還提供了其在膠質(zhì)母細胞瘤治療中的應用。


圖1是miR-lSld表達水平與膠質(zhì)母細胞瘤患者總生存期呈負相關的圖(a)在 TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-lSld表達水平與患者總生存期呈負相關，藍色高于平均表達水平，紅色低于平均表達水平；(b)通過qRT-PCR評估在35個患者的獨立驗證組中miR_181d與總生存期相關，藍色高于平均表達水平，紅色低于平均表達水平；(c)在TMZ治療狀況的分層后，miA-181d與生存期相關性。圖2是miR-181d下調(diào)MGMT表達的圖(a)轉染miR_181d抑制了 mRNA(左圖)和 A1207神經(jīng)膠母細胞瘤細胞系中蛋白(右圖)的表達，對于qPCR，MGMT mRNA不是歸一化為 β-肌動蛋白就是歸一化為U6rRNA(具有相似的結果，數(shù)據(jù)沒有示出)，對于蛋白印跡法， β -肌動蛋白被用作為加樣對照；(b)MGMT 3’ UTR中的miR-181d結合位點在miR_181d存在情況下抑制了熒光素酶表達；(c)MGMT 3’UTR中預測的miR-181d結合位點；(d)miR-181d 與MGMT轉錄物物理地相互作用，β -肌動蛋白被用作為被用作為內(nèi)對照。圖3是miR-181d水平與MGMT mRNA水平呈負相關的圖(a)在具有表征的MGMT 啟動子、MGMT mRNA水平和miR181_d水平的223TCGA患者中miR_181d和MGMT轉錄物水平之間的相關性(P = 0. 004，R2 = 0. 13) ； (b)在具有未甲基化的MGMT啟動子的159患者中 miR-181d和MGMT轉錄物水平之間的相關性(p = 0. 004，R2 = 0. 13)，MGMT和miR_181d的相對豐度在χ-和I—軸上作圖；(c)在神經(jīng)膠母細胞瘤的獨立組中miR-181d和MGMT轉錄物水平之間的負相關性(P = 0. 04，R2 = 0. 62)。miR_181d和MGMT的表達水平通過qPCR 進行評估。每一個的相對豐度在χ-和y_軸上作圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。一.患者資料與標本來源本研究經(jīng)機構審查委員會批準，所有病人均簽署知情同意書，所有病人均接受手術治療，并且病理診斷為膠質(zhì)母細胞瘤。所有病人均接受放療治療。但只有部分病人接受TMZ治療?；颊叩奶卣髟谝韵卤碇辛谐?。所有樣本在切除后5分鐘內(nèi)冰凍，排除腫瘤組織小于80%的樣本。切除程度經(jīng)過2名放射科醫(yī)師術后72小時行核磁共振檢查，確定為全切除 (GTR)級和非全切除(non-GTR)級。表1所有入組本研究的117例原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者的臨床病理學資料
權利要求
1.一種用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括測定膠質(zhì)母細胞瘤患者的HiiR-ISld水平的試劑盒和任選地所述試劑盒使用說明書。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒進一步包括從膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤組織樣品中提取RNA的試劑盒和任選地所述試劑盒使用說明書。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒是miRNA表達譜試劑盒。
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒是qRT-PCR試劑盒。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于所述測定膠質(zhì)母細胞瘤患者的 miR-lSld水平與與膠質(zhì)母細胞瘤患者總生存期呈負相關。
6.一種用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的分子標志物，其是 miR-181d。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的試劑盒，所述試劑盒包括測定膠質(zhì)母細胞瘤患者的miR-181d水平的試劑盒和任選地所述試劑盒使用說明書。本發(fā)明還提供用于確定膠質(zhì)母細胞瘤患者用替莫唑胺治療療效的分子標志物miR-181d。
文檔編號C12Q1/68GK102329860SQ20111024664
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權日2011年8月24日
發(fā)明者張偉, 江濤 申請人:江濤