專利名稱：基因修飾以表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于治療癌癥的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療癌癥的藥物組合物和試劑盒，所述藥物組 合物和試劑盒含有表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤由于其轉(zhuǎn)移到其他位置而成為最難醫(yī)治的癌癥之 一，并且目前沒有有效的治療方法。在多數(shù)情況下不能安全地進(jìn)行常規(guī)的腦瘤切除，并且由于阻礙藥物滲透進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的血腦屏障(BBB)的原 因，也不能有效地使用抗癌藥物進(jìn)行化療。此外，當(dāng)涉及一些小腫瘤時(shí)，通過引入工程病毒使抗癌基因直接輸 送進(jìn)入腫瘤細(xì)胞來治療腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因療法也是無效的。而且， 反復(fù)注射病毒會引起嚴(yán)重的免疫排斥。據(jù)近期報(bào)導(dǎo)，神經(jīng)干細(xì)胞(Aboody等人，iVoc. A^/. ^cad 5W. 97， 12846-12851 (2000); Brown等人，/fwwa" Ge朋T7zera/:y， 14， 1777-1785(2003) ; Tang等人，i/wma" J7iera; 乂 14, 1247-1254, (2003)和Zhang等 人，T7^ra/ ;;， 23, 281-287 (2004))和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Nakamura等人，7Tzera; 乂 11, 1155-1164 (2004)和Zhang等人，7Vewra/mflge， 23, 281-287(2004) )對腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤顯示嗜性，因此已試圖利用所述干細(xì)胞作為基 因載體。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，表達(dá)胞嘧啶脫氨酶(CD)的神經(jīng)干細(xì)胞(五.co/Z的自殺 基因)的使用在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中顯示出極好的抗癌作用(Aboody 等人，同上；以及Brown等人，同上)。然而，因?yàn)楸仨殢牧鳟a(chǎn)胎兒腦組 織分離和培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，所以極難得到神經(jīng)干細(xì)胞。因此，上述實(shí)驗(yàn) 使用致癌基因的永生化細(xì)胞系，這會誘發(fā)癌癥和免疫排斥。據(jù)報(bào)導(dǎo)，將表達(dá)白細(xì)胞介素-2(IL-2)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)注射進(jìn)大鼠腦膠質(zhì)瘤模型中增大了抗腫瘤作用并延長了帶腫瘤大鼠的存活率(Nakamura等人，同上)。然而，上述方法的問題是免疫細(xì)胞很難穿過血 腦屏障，并且許多癌細(xì)胞常常不會受到免疫系統(tǒng)的顯著影響。因此，己需要開發(fā)新的治療劑和方法，它們能特異地靶向腫瘤細(xì)胞 而不傷害非腫瘤細(xì)胞，并且沒有免疫毒性，從而可以反復(fù)給予治療劑。MSC是能分化為諸如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞等中 胚層譜系細(xì)胞的多潛能骨髓基質(zhì)細(xì)胞。MSC還可以在保持其未分化狀態(tài) 下容易地增殖，這樣由于其對腫瘤細(xì)胞的嗜性而適于輸送針對腦膠質(zhì)母 細(xì)胞瘤的抗癌劑。自殺基因能將無毒的前藥轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的抗癌藥。例如，CD能將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性的抗癌劑5-氟尿嘧啶(5-FU)，而且分泌的 5-FU殺死臨近細(xì)胞，這稱為"旁觀者效應(yīng)"。直接給予5-FU會引起細(xì)胞毒性并導(dǎo)致不利副作用，但是以特定方式 聯(lián)合使用自殺基因和5-FC則有可能在腫瘤細(xì)胞周圍選擇性地產(chǎn)生5-FU (Bourbeau等人，7Tze /owma/ o/Ge"e 6, 1320-1332 (2004))。本發(fā)明者已努力開發(fā)使用MSC的安全而有效的抗癌劑；并且已發(fā)現(xiàn) 當(dāng)將表達(dá)自殺基因的MSC移植到腦癌動物模型的腦中，隨后給予抗癌劑 的前藥時(shí)，可以有效地治療腦瘤。發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種治療癌癥的組合物，所述組合物顯 示出對癌組織的高靶向效率、對正常細(xì)胞無毒性并且沒有免疫毒性，從 而可以反復(fù)給予。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于治療癌癥的試劑盒，所述試劑 盒包括所述組合物和抗癌劑的前藥。本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過使用所述組合物或試劑盒治療 受試者中的癌癥的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種用于治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于治療癌癥的試劑盒，所述 試劑盒包括含有自殺基因的表達(dá)載體、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗癌劑的前 藥。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于治療需要治療癌癥的受試 者中的癌癥的方法，所述方法包括給予所述受試者表達(dá)自殺基因的骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后給予抗癌劑的前藥。


從以下結(jié)合附圖的發(fā)明說明中，可以更清楚本發(fā)明的上述和其他目 的以及特征，附圖分別示出圖1:從人骨髓分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在體外培養(yǎng)1天、2 天、3天和7天后的光學(xué)顯微照片；圖2:顯示多潛能MSC的照片(A:用油溶紅O (oil red-O)染色的脂 肪細(xì)胞；B:用阿利新藍(lán)(alcianblue)染色的軟骨細(xì)胞；C:成骨細(xì)胞內(nèi)堿 性磷酸酶的活性；D:用馮庫薩(vonKossa)染色的成骨細(xì)胞)；圖3:含有作為自殺基因的五.co/z'胞嘧啶脫氨酶(CD)基因的逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體的構(gòu)建；圖4A至圖4C:顯示293T細(xì)胞內(nèi)CD表達(dá)的圖和照片(A:將卩H] 胞嘧啶轉(zhuǎn)化為[3司尿嘧啶的被表達(dá)的CD的活性；B:表達(dá)CD的293T 細(xì)胞根據(jù)作為5-FU前藥的5-FC的濃度變化的細(xì)胞死亡；C:在1，000pM 5-FC存在下培養(yǎng)的293T和293T/CD細(xì)胞的光學(xué)顯微照片)；圖5A和圖5B:顯示293T/CD細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)的照片和圖(圖5A: 在l,000^iM 5-FC存在下與C6/LacZ腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，293T和 293T/CD細(xì)胞的相對比顯微照片，以及用X-gal染色后的光學(xué)顯微照片 (放大倍數(shù)xl00);圖5B:顯示293T和293T/CD細(xì)胞內(nèi)P-半乳糖苷酶 (卩-gal)活性隨5-FC濃度變化的圖)；圖6A和圖6B:顯示經(jīng)用5-FC處理后，MSC和用含有CD基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的MSC (MSC/CD)的細(xì)胞死亡的照片和圖(圖6A: 光學(xué)顯微照片；圖6B: MTT分析結(jié)果的圖)；圖7A至圖7C:顯示MSC/CD細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)的照片和圖(圖7A: 在l，OO(HiM 5-FC存在下與C6/LacZ腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，MSC和 MSC/CD細(xì)胞的相對比顯微照片，以及用X-gal染色后的光學(xué)顯微照片(放 大倍數(shù)xi00);圖7B:顯示在(3-gal檢測中C6/LacZ細(xì)胞存活率的圖； 圖7C:全細(xì)胞的解剖顯微照片和數(shù)字顯微照片)；圖8A和圖8B:顯示在MSC和MSC/CD細(xì)胞內(nèi)前藥5-FC轉(zhuǎn)化為 5-FU的HPLC分析結(jié)果(圖8A: MSC和MSC/CD細(xì)胞的HPLC色譜圖； 圖8B:顯示5-FU的檢測量的圖)；圖9:顯示C6、 U373和U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞死亡率隨5-FU 濃度變化的圖； '圖10:顯示MSC對腦膠質(zhì)瘤嗜性的結(jié)果(A:顯示在一個腦半球中 移植的MSC/LacZ遷移到對側(cè)的帶腦膠質(zhì)瘤的腦半球的示意圖；B:顯示 MSC/LacZ遷移到帶腦膠質(zhì)瘤的腦半球的腦組織切片的顯微照片；C和D: 顯示在腦膠質(zhì)瘤邊緣處MSC/LacZ細(xì)胞分布分別在100和200放大倍數(shù) 時(shí)的顯微照片)；圖11:顯示表達(dá)CD的MSC抗癌作用的MRI圖像；以及圖12:腦瘤大鼠模型的腦切片的X-gal染色結(jié)果，顯示了表達(dá)CD 的MSC的抗癌作用。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明使用的自殺基因可以是將無毒的抗癌劑的前藥轉(zhuǎn)化為有毒的 抗癌劑的前藥激活酶。示例性的自殺基因包括編碼單純皰疹1型胸苷激 酶(HSV-TK)和胞嘧啶脫氨酶(CD)的基因。HSV-TK將無毒的丙氧鳥苷 (GCV)轉(zhuǎn)化為有毒的磷酸化代謝物，CD將無毒的5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化 為有毒的5-氟尿嘧啶(5-FU)。 CD基因優(yōu)選用于基因療法，因?yàn)?-FU顯 示強(qiáng)旁觀者效應(yīng)。根據(jù)將基因引入到細(xì)胞內(nèi)的任何公知的方法，通過使用包括基因的病毒載體，優(yōu)選使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可將自殺基因引入到骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞(MSC)中。例如，通過將自殺基因引入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)而得 到表達(dá)載體，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，過濾培養(yǎng)基得到逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液，并用逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液轉(zhuǎn)染MSC，可將自殺基因引入到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)。然后，通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有的選擇標(biāo)記可得到持續(xù)表達(dá)自殺基因的MSC。通過將自殺基因引入到干細(xì)胞中，并在適宜條件下選擇、擴(kuò)增所得 的干細(xì)胞，可在體外大量生產(chǎn)表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；或通 過充分增殖干細(xì)胞，將自殺基因引入到增殖的干細(xì)胞中，并采集所得的 干細(xì)胞，可在體外大量生產(chǎn)表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。能用于本發(fā)明的干細(xì)胞可以從包括人在內(nèi)的任何哺乳動物的骨髓、 外周血或臍帶血分離，優(yōu)選從人骨髓分離。包括表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的本發(fā)明組合物可用于癌癥 治療。示例性的癌癥包括腦癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌和 肺癌，但不限于此。本發(fā)明的組合物還可包括藥物可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。優(yōu) 選地，可將所述組合物配制成適于注射進(jìn)入組織或器官的注射劑。所述組合物還可包括潤滑劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法，例如Bjorklund和Stenevi CBra/" 7 e義， 177， 555-560 (1979))和Lindvall等人(AcA.腸ra/" 46, 615-31 (1989))公開的臨床方法，可將本發(fā)明的組合物注射進(jìn)入患者身體。實(shí)際給予的本發(fā)明的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的單位劑量應(yīng)該依據(jù)各種相 關(guān)因素而定，包括待治療的疾病、患者癥狀的嚴(yán)重程度、選擇的給藥途 徑以及患者自身的年齡、性別和體重。此外，本發(fā)明還提供用于治療癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括含有 自殺基因的表達(dá)載體、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗癌劑的前藥。在本發(fā)明的試劑盒中，可以單獨(dú)提供含有自殺基因的表達(dá)載體和骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞，或者以用含有自殺基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形式或用表達(dá)自殺基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形式 提供。優(yōu)選通過將自殺基因引入到病毒載體內(nèi)，優(yōu)選引入到逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體內(nèi)，來制備表達(dá)載體。本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括用于治療患有癌癥的受試者的方法，所述 方法包括給予所述受試者治療有效量的表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞，隨后給予抗癌劑的前藥。當(dāng)從患者自己的骨髓或從與患者有同型HLA (人白細(xì)胞抗原)的其他 人的骨髓得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，使用本發(fā)明組合物可使基因療法中 的免疫排斥最低。因此，為徹底防止癌癥復(fù)發(fā)，可以反復(fù)給予本發(fā)明的 組合物。而且，在基因療法中使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于，無需 使用致癌基因就可以容易地培養(yǎng)并得到足以用于移植到患者中的大量骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，本發(fā)明的組合物可用于治療免疫監(jiān)視未發(fā)現(xiàn)的癌癥，因?yàn)槠?作用不依賴于免疫應(yīng)答的改進(jìn)。因此，可以單獨(dú)使用本發(fā)明的組合物或與治療癌癥的其他治療聯(lián)用， 特別是針對難治療的癌癥。經(jīng)注射后，本發(fā)明組合物中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞顯示對癌組織的嗜 性。因此，通過將表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性地運(yùn)送到癌 組織，然后給予待由自殺基因激活的抗癌劑的前藥以使抗癌劑只在癌組 織周圍產(chǎn)生，則可使對正常細(xì)胞的不利副作用最低。而且，表達(dá)自殺基 因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對沒有直接引入自殺基因的周圍癌細(xì)胞顯示旁觀 者效應(yīng)，因此增強(qiáng)了其抗癌作用。以下實(shí)施例意圖對本發(fā)明作進(jìn)一步解釋，而不限制其范圍。此外，以下對于固體混合物中的固體、液體中的液體、液體中的固 體所給出的百分比分別按wt/wt、 vol/vol和wt/vol計(jì)，并且除非另有具體說明外，所有反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行。實(shí)施例l:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的分離和培養(yǎng)(步驟l)骨髓的提取和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離將4 ml HISTOPAQUE 1077 (Sigma, U.S.A.)和4 ml從骨髓庫(Korean Marrow Donor Program, KMDP)得到的骨髓加到經(jīng)滅菌的15 ml試管中。 在400xg下離心30分鐘后，收集界面上的0.5 ml淡黃色覆層并轉(zhuǎn)移到含 有10 ml經(jīng)滅菌的磷酸鹽緩沖鹽溶液的試管中。將所得懸浮液在250xg 下離心10分鐘除去上清液，并加入10 ml磷酸鹽緩沖溶液得到懸浮液， 在250xg下離心10分鐘。重復(fù)上述歩驟兩次并將含有10% FBS (Gibco) 的DMEM培養(yǎng)基(Gibco, U.S.A.)加到所得沉淀中。將所得溶液相當(dāng)于 lxl(^個細(xì)胞的那部分溶液置于100 mm皿中并在37°C下培養(yǎng)4小時(shí)， 同時(shí)供給5% C02和95%空氣。然后除去上清液并加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)。(步驟2) hMSC的培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)使用MSC培養(yǎng)基(10°/。 FBS (Gibco) + 10 ng/ml bFGF (Sigma) + 1%青 霉素/鏈霉素(Gibco) + 89% DMEM (Gibco))在保持于37°C的(302培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)步驟1所得的hMSC。每隔2天更換培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì) 胞達(dá)到80%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶/0.1 mMEDTA(Gibco)收集細(xì)胞并 用培養(yǎng)基稀釋20倍，然后，在新皿中傳代培養(yǎng)。將所得的剩余細(xì)胞在含 有10%DMSO (Sigma)的培養(yǎng)基中冷凍。圖1顯示從人骨髓分離的骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)l天、2天、3天和7天后的光學(xué)顯微照片。(步驟3) hMSC的多分化潛能以下檢驗(yàn)hMSC體外分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛能。(1) hMSC的成脂分化在MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSC，隨后在成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)充1 pM地塞米松(Sigma)、 0.5 mM甲基異丁基黃嘌呤(Sigma)、 10pg/ml胰島 素(Gibco)、 100 nM吲哚美辛(Sigma)和10% FBS (Gibco)的DMEM培養(yǎng) 基(Gibco))中培養(yǎng)48小時(shí)。隨后在成脂維持培養(yǎng)基(含有10 pg/ml胰島素 和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)所得的混合物1周，并用油溶紅O 染色。如圖2所示，用油溶紅0染色的脂肪細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)部明顯(圖2， A)。此結(jié)果表明hMSC可以成功地分化為脂肪細(xì)胞。(2) hMSC的成軟骨分化在MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSC。用胰蛋白酶收集2xl()S個細(xì)胞，離心， 然后，在0.5 ml無血清成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有0.5 ml 100><ITS (0.5 mg/ml牛胰島素、0.5 mg/ml人鐵傳遞蛋白、0.5 Mg/ml硒酸鈉(Sigma))和 10 ng/ml TGF-卩1 (Sigma)的50 ml高葡萄糖DMEM (Gibco))中再培養(yǎng)3周， 同時(shí)每3天更換培養(yǎng)基。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞群，用切片機(jī)切片， 然后，用阿利新藍(lán)染色。如圖2所示，細(xì)胞外軟骨基質(zhì)被染成藍(lán)色并且 觀察到在軟骨陷窩中存在軟骨細(xì)胞(圖2， B)。這些結(jié)果表明hMSC分化 為軟骨細(xì)胞。(3) hMSC的成骨分化在MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)hMSC，隨后在0.5 ml成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ) 充10 mM (3-磷酸甘油(Sigma)、 0.2 mM抗壞血酸-2-磷酸酯(Sigma)、 10 nM 地塞米松(Sigma)和10% FBS (Gibco)的DMEM)中培養(yǎng)2周，同時(shí)每3天 更換培養(yǎng)基。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，分別用堿性磷酸酶染色和使 用馮庫薩法染色。如圖2所示，堿性磷酸酶活性的增加和羥磷灰石形式 的鈣礦物質(zhì)的細(xì)胞外聚集表明hMSC分化為成骨細(xì)胞(圖2， C和D)。實(shí)施例2:表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建(步驟1)胞嘧啶脫氨酶的克隆以五.co// K12 MG1655的基因組DNA (ATCC 700926, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)為模板通過PCR反應(yīng)克隆胞嘧 啶脫氨酶(CD)基因。用寡核苷酸CD-F (5'-GAATTC AGGCTAGCAATG TCT CGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3': SEQ ID NO: l)和CD-R (5'-GGA TTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3'; SEQ ID NO: 2)在94°C、 5分 鐘；94°C、 30秒，60°C、 40秒和72°C、 1分鐘的27個循環(huán)；72°C、 7 分鐘的條件下進(jìn)行PCR。用pGEM-T Easy載體克隆試劑盒(Promega)克隆 PCR產(chǎn)物，并用X-gal和IPTG通過藍(lán)白斑克隆篩選分離含有CD基因的 載體pGEM-T-CD。通過使用SEQ ID NO: 3 (5'-CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3')和SEQ ID NO: 4 (5'-ACC GGG AAA CAC CTA TTG TG-3')的寡核苷酸對載體pGEM-T-CD進(jìn)行序列分析，驗(yàn)證CD基因 (gi298594)。(步驟2)表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建用五coRI (Roche， Germany)和(Roche)從載體pGEM扁T-CD中分 離CD cDNA，并用T4 DNA連接酶(Roche)將其插到載體pcDNA3.1 (Clontech， U.S.A.)的五coRI位點(diǎn)和WM位點(diǎn)中。用所得的載體轉(zhuǎn)化co// DH5a，并在含有50 pg/ml氨比西林的LB平板中培養(yǎng)和篩選所得的轉(zhuǎn)化 體，得到pcDNA3.1/CD。用5畫HI (Roche)從pcDNA3.1/CD中分離CD cDNA，并用T4 DNA連接酶(Roche)將其插到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMSCV-puro (Clontech)的(Roche)位點(diǎn)中。所得的被指定為 pMSCV-puro/CD的構(gòu)建示于圖3。(步驟3)逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備用磷酸鈣共沉淀法[Jordan, Nucleic Acid Research, 24, 569-601 (1996)] 將pMSCV-puro/CD載體轉(zhuǎn)染為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系PA317 (ATCC CRL-9078)或PG13 (ATCC CRL-10686),并在37°C、 5% C02的條件下培 養(yǎng)細(xì)胞。48小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，用0.45 ^M尼龍膜過濾，得到逆轉(zhuǎn)錄 病毒溶液。將逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液在-70。C下保存直至使用。實(shí)施例3: CD表達(dá)在293T細(xì)胞中的驗(yàn)證(步驟1)胞嘧啶脫氨酶活性的量化根據(jù)磷酸鈣共沉淀法將pMSCV-puro/CD轉(zhuǎn)染為293T細(xì)胞(ATCC CRL-11268)中。轉(zhuǎn)染48h后，在含有嘌呤霉素(4 pg/ml, Sigma, U.S.A.)的 選擇培養(yǎng)基中使細(xì)胞在2周內(nèi)以1: 10分裂。在磷酸鹽緩沖鹽溶液中采 集生長的細(xì)胞，在乙醇的干冰中冷凍2分鐘，然后在37°C下解凍5分鐘， 重復(fù)5次使細(xì)胞裂解。通過在4°C和12,000 rpm下離心細(xì)胞裂解物5分 鐘得到上清液，用Bradford法(」"a/72: 248-254, 1976)量化蛋白 濃度。將10 pl中的10 pg蛋白與5 |il的3 mM [6-3司胞嘧啶(0.14 mCi/mmo1, Moravek, USA)混合并在37°C下培養(yǎng)1 h。通過加入345 |nl的 1M乙酸終止反應(yīng)。使用SCXBond洗脫柱(Varian,U.S.A)，用1 ml的1 M 乙酸漂洗，洗脫混合物，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測定生成的[6」H]尿嘧啶。 pMSCV-puro轉(zhuǎn)化的293T細(xì)胞用作此實(shí)驗(yàn)中的陰性對照。如圖4A所示，用pMSCV-puro/CD轉(zhuǎn)化的293T實(shí)驗(yàn)組比陰性對照組高4倍。此結(jié)果顯 示pMSCV-puro/CD被功能性地表達(dá)。(步驟2) CD基因在293T細(xì)胞中的自殺作用將正常293T細(xì)胞和步驟1中制備的用pMSCV-puro/CD轉(zhuǎn)化的 293T/CD細(xì)胞以2,000個細(xì)胞/孔的密度在含有10%胎牛血清的DMEM的 24孔板中鋪板。24小時(shí)后，將5-FC以不同濃度(0-10mM)加到細(xì)胞內(nèi)。 1周內(nèi)每2天用含有5-FC的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。如圖4C所示，根 據(jù)相對比顯微鏡測定，在l，OOO 5-FC存在下，293T/CD的存活率降低。 通過使用溴化3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鹽(MTT)檢測法 測定線粒體NADPH活性來估計(jì)存活率。在200 ^的25 mg/ml MTT (Sigma， U.S.A)的PBS中培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。用200 pl無水二甲基亞砜 (DMSO， Sigma)更換溶液。在室溫下培養(yǎng)15分鐘后，用ELISA讀數(shù)機(jī) (Molecular Probe， U.S.A)測定540 nm下的吸光度。相對于在沒有5-FC存 在下生長的細(xì)胞的數(shù)據(jù)，圖4B中的數(shù)據(jù)表示為3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 土S.E.。從10 nM的5-FC開始檢測293T/CD的細(xì)胞死亡，其中IC5()為296 pM。與其相對照，在1，000 pM5-FC存在下，293T細(xì)胞沒有顯示出細(xì)胞 死亡。(步驟3) 293T/CD細(xì)胞的體外旁觀者效應(yīng)在6孔板中，將3xl()3個/孔的293T/CD和293T細(xì)胞分別與3"03 個C6/LacZ腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(ATCC CRL2199)共培養(yǎng)。C6/LacZ細(xì)胞最初通 過用五.co/ZLacZ基因轉(zhuǎn)化C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞得到，并用于測定293T/CD 細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)。24小時(shí)后，將所示濃度的5-FC加到細(xì)胞內(nèi)。l周內(nèi) 每2天用含有5-FC的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。對培養(yǎng)液進(jìn)行X-gal染色 或卩-半乳糖苷酶(P-gal)檢測。對于X-gal染色，用0.00625。/。戊二醛(Merck, U.S.A.)固定細(xì)胞10min，用PBS漂洗3次，并在2mMMgCl2、 5 mM亞 鐵氰化鉀/鐵氰化鉀和1 mg/ml X-gal (Koma， Korea)中培養(yǎng)8小時(shí)。如圖 5A所示，與親代293T細(xì)胞共培養(yǎng)的C6/LacZ細(xì)胞在數(shù)量上有所增加并 且用X-gal染成藍(lán)色。與其相對照，當(dāng)與293T/CD共培養(yǎng)時(shí)，在1,000 5-FC存在下，由于293T/CD的旁觀者效應(yīng)，C6/LacZ細(xì)胞死亡。通過用測定LacZ基因產(chǎn)物(P-半乳糖苷酶)的殘余酶活性的P-gal檢 測法進(jìn)一步證實(shí)C6/LacZ細(xì)胞的存活率。釆集細(xì)胞并在"passive裂解緩 沖溶液(Promega, U.S.A.)中裂解。在37°C下，于300 pl的0.88 mg/ml ONPG(Sigma)、 1 mMMgCl2和0.1 M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中培養(yǎng)10 pg細(xì)胞裂解物的蛋白約30分鐘。通過加入500 的1MNa2C03終止反 應(yīng)并在420 nm下測定混合物的吸光度。圖5B示出相對于未處理細(xì)胞的 相對比率。與圖5A顯示的結(jié)果相一致，在(3-gal檢測中，5-FC沒有改變 與293T共培養(yǎng)的C6/LacZ。與其相對照，在100-1 ，000 5-FC存在下， 通過與293T/CD共培養(yǎng)，C6/LacZ細(xì)胞的卩-半乳糖苷酶活性降低。此數(shù) 據(jù)表明，在5-FC存在下，由于旁觀者效應(yīng)，與293T/CD的共培養(yǎng)誘發(fā) 臨近C6/LacZ細(xì)胞的細(xì)胞死亡。實(shí)施例4:表達(dá)胞嘧啶脫氨酶的hMSC的制備(步驟1)將CD基因引入到hMSC中表達(dá)CD的逆轉(zhuǎn)錄病毒用于將CD基因運(yùn)送到MSC。將實(shí)施例1步 驟1中所得的MSC在37。C和5%(:02下，于生長培養(yǎng)基(含有10%FBS、 100單位/ml青霉素和100 ^ig/ml鏈霉素的DMEM)中生長，直至70。/。融合。 將實(shí)施例2中制備的表達(dá)CD的逆轉(zhuǎn)錄病毒以1: 1的稀釋比加到培養(yǎng)基 中，在8 ng/ml聚凝胺(polybrene) (Sigma)存在下在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 小時(shí)，并在新鮮生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)2次 以上后，細(xì)胞在含有4pg/ml嘌呤霉素(Sigma)的生長培養(yǎng)基中在14天內(nèi) 分以l: 3分裂。將存活的細(xì)胞匯集(pooled)，并用于隨后的實(shí)驗(yàn)中。(步驟2) CD基因在MSC/CD細(xì)胞中的自殺作用在與5-FC接觸的前一天，將MSC/CD或MSC細(xì)胞以5，000個細(xì)胞/ 孔的密度在6孔板中的生長培養(yǎng)基上鋪板。2周內(nèi)每2天用含有0-10 mM 5-FC的新鮮生長培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。如圖6A所示，用1,000 pM 5-FC 處理2周后MSC/CD細(xì)胞幾乎死亡。如以上對293T/CD細(xì)胞所述的那樣， 通過使用MTT檢測法測定線粒體NADPH活性來估計(jì)存活率。相對于未 處理細(xì)胞的數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)表示為3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的平均值土S.E.(圖6B)。 從100 的5-FC開始檢測MSC/CD的細(xì)胞死亡，其中IC5Q = 332 pM。與其相對照，直至高達(dá)1，000 pM5-FC， MSC沒有顯示出細(xì)胞死亡。(步驟3)表達(dá)CD基因的MSC的體外旁觀者效應(yīng)在6孔板中，將^104個/孔的MSC/CD和MSC細(xì)胞分別與3xl03 個C6/LacZ腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。24小時(shí)后，將5-FC 加到細(xì)胞內(nèi)，終濃度為1-1,000 ^M，并且1周內(nèi)每2天更換培養(yǎng)基。如 以上對293T/CD細(xì)胞所述的那樣，對剩余細(xì)胞進(jìn)行X-gal染色(圖7A和 圖7C)或p-半乳糖苷酶檢測(圖7B)。在1000 ^M5-FC存在下，MSC/CD 細(xì)胞誘發(fā)C6/LacZ的細(xì)胞死亡，而MSC不改變C6/LacZ細(xì)胞下降的增殖 (圖7A和圖7C)。因此，C6/LacZ細(xì)胞在與MSC/CD共培養(yǎng)時(shí)，其集落 形成頻率以劑量依賴方式下降(圖7C)。此數(shù)據(jù)表明，在5-FC存在下， MSC/CD細(xì)胞對C6/LacZ細(xì)胞起到旁觀者效應(yīng)。通過P-gal檢測法進(jìn)一步驗(yàn)證C6/LacZ細(xì)胞的存活率，通過此檢測法 可間接量化存活的細(xì)胞。使用10 pg細(xì)胞裂解物的蛋白，以類似于以上 對293T/CD細(xì)胞所述的方式進(jìn)行檢測。420 nm下的吸光度表示為相對于 未處理細(xì)胞的相對比率。如圖7B所示，當(dāng)細(xì)胞與MSC/CD細(xì)胞共培養(yǎng) 時(shí)，P-半乳糖苷酶活性在C6/LacZ細(xì)胞內(nèi)以濃度依賴方式急劇下降。與 其相對照，(3-半乳糖苷酶活性在與正常MSC共培養(yǎng)的C6/LacZ細(xì)胞內(nèi)未 改變。再次地，在5-FC存在下，MSC/CD細(xì)胞對C6/LacZ細(xì)胞起到旁觀 者效應(yīng)。(步驟4)通過MSC/CD驗(yàn)證5-FC向5-FU的轉(zhuǎn)化將MSC細(xì)胞和MSC/CD細(xì)胞以lxl(^個細(xì)胞/孔的密度在12孔板中 鋪板，并在1,000 jiM 5-FC存在下培養(yǎng)3天。用500 pl乙酸乙酯異丙 醇0.5mol/L乙酸(84:15:1 (v/v/v))和0.3pg 5-溴尿嘧啶(5-BU， Aldrich, U.S.A.)提取50 pl培養(yǎng)基。在用真空蒸發(fā)儀將有機(jī)餾分在4。C下干燥卯 分鐘后，在1120:甲醇(4:l)的500iLd混合物中重構(gòu)成小球。用XterraTM RP18 5pm C-18柱(4.6xl50 mm, Waters, U.S.A)進(jìn)行HPLC。使用由40 mM KH2P04構(gòu)成并用10% KOH調(diào)節(jié)到pH 7.0的等度流動相以0.6 ml/min的 流速進(jìn)行等度洗脫。5-FC和5-FU在3.1 min和3.9 min洗脫出來。作為 內(nèi)標(biāo)的5-BU在10.2 min洗脫出來(圖8A)。如圖8B所示，MSC/CD將1,000 nM 5-FC轉(zhuǎn)化為2.67 pM 5-FU，而MSC不能產(chǎn)生任何5-FU。結(jié)果 顯示，5-FC向5-FU的轉(zhuǎn)化對CD基因具有特異性。實(shí)施例5:通過MSC/CD生成的5-FU對各種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒 性作用的驗(yàn)證為驗(yàn)證MSC/CD生成的5-FU足以誘發(fā)各種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞死 亡，從KCLB (Korean cel line bank)得到新鮮的C6 (KCLB No. 10107)、 U373 (KCLB No. 30017)、 U87 (KCLB No. 30014)細(xì)胞，并在96孔板的生 長培養(yǎng)基中分別以100個細(xì)胞/ L、 100個細(xì)胞/孔和500個細(xì)胞/孔的密度 鋪板。24小時(shí)后，將0.01-100 的5-FU加到細(xì)胞中。1周后，用上述 MTT檢測法估計(jì)細(xì)胞存活率。如圖9所示，5-FU誘發(fā)所有腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 系的細(xì)胞死亡，其中對C6、 U373和U87的1<:5{)分別為0.93 jiM、 5.34 和5.65pM,并在10pM達(dá)到穩(wěn)定水平。此數(shù)據(jù)表明，作為通過MSC/CD 從5-FC轉(zhuǎn)化所得產(chǎn)物的5-FU的濃度足以誘發(fā)各種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞 死亡。實(shí)施例6: MSC對腦瘤的體內(nèi)嗜性(步驟1)移植通過將C6/LacZ細(xì)胞移植進(jìn)體重約為250 g的成年雄性 Sprague-Dawley白化鼠(Samtaco, Korea)的腦中誘發(fā)腦瘤。簡而言之，通 過腹腔注射400 mg/kg水合三氯乙醛(Sigma)使鼠麻醉。除去切口區(qū)的皮 毛后，將動物固定于立體定位架(Koepfer, Germany)上。用70%乙醇將頭 頂滅菌，并切開lcm的切口。在前囪-0.5、 ML + 3.0和DV + 4.0處鉆硬 腦膜形成孔，用Hamilton注射器以0.2 pl/min的速度注射在3 pl PBS中 的5xl()S個U373細(xì)胞。手術(shù)后，縫合切口并將動物放回籠內(nèi)。4天后， 將MSC/LacZ細(xì)胞的2xl()S個細(xì)胞移植到對側(cè)的前囪-0.5、ML - 3.0和DV + 4.0處，接種5 ^含有上述細(xì)胞的PBS。注射20分鐘后，移走注射器。 縫合切口。移植腦膠質(zhì)瘤2周后提取鼠腦。(步驟2)組織切片的制備第二次移植2周后，通過注射400 mg/kg水合三氯乙醛(Sigma)使鼠 麻醉。先用PBS然后用PBS中的O.l M多聚甲醛(pH 7.4)灌注鼠。提取 腦并在4。C下、PBS中的0.1 M多聚甲醛(pH 7.4)中保存16小時(shí)，進(jìn)行 后固定，接著在30%蔗糖中保存24小時(shí)。用厚度35 pm的滑動切片機(jī)切 片并固定在硅烷涂布的載玻片(Muto Purew Chemicals, Japan)上，在4°C 下、PBS中保存直至使用。(步驟3) X-gal染色10分鐘內(nèi)用PBS漂洗固定在載玻片上的腦切片3次，并在2 mM MgCl2、 5 mM亞鐵氰化鉀/鐵氰化鉀和1 mg/ml X-gal (Koma)中培養(yǎng)8小 時(shí)。為增強(qiáng)對比度，用曙紅復(fù)染切片、脫水并用香液覆蓋切片。如圖10B 所示，X-gal+藍(lán)色MSC/LacZ細(xì)胞從一個腦半球遷移到其中首先移植有 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的另一個腦半球。值得注意的是，有些細(xì)胞仍保留在移植 有MSC/LacZ細(xì)胞的針道處。在顯微鏡的較高倍數(shù)下觀察，MSC/LacZ 細(xì)胞滲透到腫瘤塊中(圖IOC)，同時(shí)沿著腫瘤邊緣滲透(圖IOD)。此數(shù)據(jù) 表明，MSC具有向腫瘤位置遷移并用作將自殺基因運(yùn)送到腦瘤的載體的 高潛能。實(shí)施例7:腦瘤動物模型中MSC/CD的抗腫瘤作用(步驟1)移植如實(shí)施例6的步驟1所述，麻醉成年Sprague-Dawley白化鼠(約250 g)。在前囪-0,5、ML + 3.0和DV + 4.0處，用Hamilton注射器以0.5 jxl/min 的速度移植在5 PBS中的5xl(^個C6/LacZ細(xì)胞以及5xl()S個MSC/CD 或5xl()5個MSC。從第二天開始，腹腔給予鼠5-FC， 500 mg/kg/天，給 予14天。(步驟2)通過MRI測定抗腫瘤作用細(xì)胞移植2周后進(jìn)行磁共振成像(MRI)以估計(jì)腦內(nèi)腫瘤體積。通過腹 腔注射400 pl水合三氯乙醛麻醉動物，并置于為研究鼠特別制作的表面 線圈上。用3.0 Tesla MRI系統(tǒng)(Magnum 3.0; Medinus Inc., Korea)和鳥籠 RF線圈(直徑30 cm)進(jìn)行MRI掃描。重復(fù)時(shí)間(TR)和回波時(shí)間(TE)分別為1400 ms和60 ms。切片厚度為1.5 mm，并且沒有切縫。MRI分析 表明，與含有PBS或未處理的MSC動物相比，移植MSC/CD減少了腫瘤體積。(步驟3) MRI與組織學(xué)方法相關(guān)性的驗(yàn)證為進(jìn)一步證實(shí)MSC/CD能減小腦瘤，除切片為100 pm厚和對其進(jìn) 行X-gal染色之外，按上述提取MRI所用的同一動物的腦。與用PBS或 用MSC處理的動物相比，接受MSC/CD的動物的腫瘤尺寸較小(圖12)。 用MRI和X-gal染色所得的數(shù)據(jù)均一致表明，由于移植MSC/CD和給予 5-FC，腦瘤的尺寸減少。盡管結(jié)合上述具體實(shí)施方式
已經(jīng)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)認(rèn)識到的是，在本發(fā)明所附權(quán)利要求書確定的范圍內(nèi)，可對本發(fā)明做 出各種修改和變化。
權(quán)利要求
1. 一種用于治療癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包括表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求l所述的藥物組合物，其中所述自殺基因是編碼胞嘧啶脫氨酶或單純皰疹1型胸苷激酶的基因。
3. 如權(quán)利要求l所述的藥物組合物，其中用含有所述自殺基因的逆 轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
4. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述癌癥選自腦癌、乳腺 癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌和肺癌。
5. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中通過將所述自殺基因引入 到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，并在適宜條件下選擇和擴(kuò)增所得的骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞，得到所述表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；或通過增殖骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞，將所述自殺基因引入到所述增殖的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中， 并采集所得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所述表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞。
6. —種用于治療癌癥的試劑盒，所述試劑盒包括含有自殺基因的表 達(dá)載體、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和抗癌劑的前藥。
7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述自殺基因是編碼胞嘧啶脫 氨酶的基因。
8. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述表達(dá)載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
9. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中以用含有所述自殺基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形式或用表達(dá)所述自殺基因的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形式提供所述含有自殺基因和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 的表達(dá)載體。
10. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述癌癥選自腦癌、乳腺癌、 肝癌、胰腺癌和肺癌。
11. 表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在制造用于治療癌癥的藥物 中的用途。
12. —種用于治療需要治療癌癥的受試者中的癌癥的方法，所述方 法包括給予所述受試者表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后給予抗 癌劑的前藥。
全文摘要
通過將抗癌劑的前藥選擇性地轉(zhuǎn)化為癌癥周圍的抗癌劑，表達(dá)自殺基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對癌組織顯示出優(yōu)異的和高度選擇性的抗癌作用。還公開了一種用于治療癌癥的藥物組合物，其包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；一種用于治療癌癥的試劑盒，其包括含有自殺基因的表達(dá)載體、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和前藥；以及一種用于治療癌癥患者的方法，包括相繼給予患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和前藥。
文檔編號A61K35/12GK101272798SQ200680035727
公開日2008年9月24日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者張多榮, 徐海榮, 李永敦, 柳承完, 金性洙 申請人:亞洲大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)