專利名稱：一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。建立具有模擬臨床異基因造血干細胞移植后慢性移植物抗宿主病特點的疾病模型，可為慢性移植物抗宿主病的發(fā)生機制和診治方法提供研究平臺。
背景技術(shù)：
慢性移植物抗宿主病是異基因造血干細胞移植后的主要并發(fā)癥和死亡原因，成為影響患者生活質(zhì)量和長期生存的關(guān)鍵因素。進一步明確cGVHD發(fā)生機制，研究積極有效的治療方法，降低或減輕其發(fā)生及病程，具有重要的實際意義。因此，cGVHD動物模型的建立，是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。目前大部分cGVHD動物模型建立在H-2抗原半相合或微小不合的小鼠間移植，主要表現(xiàn)為狼瘡樣(SLE-cGVHD)，受累靶器官主要為皮膚、腎臟、肝臟和小腸；及硬皮樣(Scl-cGVHD)，受累靶器官主要為皮膚。肺部cGVHD的模型曾有個別報道，因需要在預(yù)處理過程中使用環(huán)磷酰胺，考慮到藥物本身對肺部的損害作用，該模型還有待進一步優(yōu)化。本研究使用H-2抗原半相合小鼠，供鼠、受鼠均來源于國內(nèi)常用的小鼠品系，方法簡便；并且本研究中供受鼠配對模式與國內(nèi)外相似研究報道不同，輸注脾細胞數(shù)量較少，成模時間及癥狀符合臨床異基因造血干細胞移植后慢性移植物抗宿主病的發(fā)生發(fā)展特點，肺部及皮膚cGVHD的表現(xiàn)非常典型，肝臟亦有部分cGVHD的表現(xiàn)。本方法提供了研究cGVHD的新模型，為國內(nèi)大多數(shù)研究中心能夠開展cGVHD發(fā)病機制、藥物試驗、細胞免疫治療等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠異基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通過以下步驟實現(xiàn):
(I)以 C57BL/6 雌鼠(H_2b)與 BALB/c 雄鼠(H_2d)雜交出的 CB6F1 (H_2bxd)代雄性小鼠作為供鼠；(2)以BALB/c (H_2d)雌性小鼠作為受鼠；(3 )受鼠接受全身照射預(yù)處理后，將獲自供鼠的骨髓細胞BMC懸液及脾細胞SpC懸液注射至受鼠。優(yōu)選地，所述供鼠及受鼠均采用8周齡小鼠。具體地來說，所述步驟(3)中，供鼠骨髓細胞BMC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，無菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液制成單細胞懸液，過濾后用紅細胞裂解液破除紅細胞，RPMI1640洗滌若干次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至5X 10~7/mL細胞濃度備用。具體地來說，所述步驟(3)中，供鼠脾細胞SpC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3飛min，無菌取出脾臟，去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌若干次，碾磨，收集細胞沖洗液制成單細胞懸液，過濾后用紅細胞裂解液破除紅細胞，用RPMI1640洗滌若干次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至
2.5X10~7/mL細胞濃度備用。具體地來說，所述步驟(3)中，移植當(dāng)日受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射預(yù)處理，照射后立即補充飲水，休息4飛小時后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的骨髓細胞BMC懸液及脾細胞SpC懸液。優(yōu)選地，所述步驟(3)中，注射給受鼠的骨髓細胞BMC懸液的用量為1X10~7BMC，脾細胞SpC懸液的用量為5X10~6。本發(fā)明通過應(yīng)用H-2抗原半相合子代小鼠的骨髓及脾細胞，移植給致死劑量輻照后的父代但不同性別的小鼠，建立一種異基因骨髓移植后cGVHD模型。其具有如下特點:(O該模型具有模擬臨床上異基因造血干細胞移植后慢性移植物抗宿主病的特點；(2)建模型效率高，重復(fù)性好；(3)造模所需小鼠容易獲得，過程簡單易行；(4)肺部、皮膚、肝臟等多器官同時發(fā)生典型病理改變；(5)移植后的小鼠存活時間長，更接近人類cGVHD的病征表現(xiàn)，為在活體動物內(nèi)進行防治人類cGVHD的研究提供新的實驗平臺。


圖1是cGVHD實驗組小鼠的臨床評分示意圖(圖例中每個時間點的評分以均數(shù)土標準差表示，η = 5)圖2是cGVHD實驗組小鼠臨床表現(xiàn)；圖3是空白對照組和cGVHD實驗組小鼠移植后+135d染色體圖；圖4是移植對照組和cGVHD實驗組小鼠135d處死后分離的肺、皮膚和肝臟的病理活檢HE染色圖。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。本實驗所用小鼠均購自廣州市中山大學(xué)實驗動物中心。實施例一本例為本發(fā)明的小鼠異基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例，按以下步驟操作:一、供鼠準備1、無特定病原體(Specefic pathogen Free, SPF)級 C57BL/6 雌性小鼠(H_2b)8 —10周齡與SPF級BALB/c雄性小鼠(H_2d) 8—10周齡，2:1比例交配。2、選擇雜合子Fl代，雄性，飼養(yǎng)至8周齡，作為供鼠備用。二、受鼠準備SPF級BALB/c小鼠(H_2d),雌性,8周齡,作為受鼠。將受鼠隨機分為4組,每組5只;其中，A、正常對照組:同步飼養(yǎng)，無干預(yù)；B、放射對照組:TB I+RPMI1640，即對組內(nèi)小鼠進行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射PRMI1640培養(yǎng)液；C、移植對照組:TBI+1X 10~7BMC，即對組內(nèi)小鼠進行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)PRMI1640培養(yǎng)液處理的骨髓細胞BMC懸液；D、cGVHD組:TBI+1 X 10~7BMC + 5X 10~6SpC，即對組內(nèi)小鼠進行全身照射(TBI)處理，經(jīng)尾靜脈注射經(jīng)PRMI1640培養(yǎng)液處理的骨髓細胞BMC懸液及脾細胞SpC懸液。三、根據(jù)以上分組，采用下述步驟進行移植實驗操作:1、異基因骨髓移植前一周對各組受鼠在層流動物房內(nèi)接受添加抗生素(紅霉素250mg/L，慶大霉素32萬U/L)的滅菌飲水進行腸道準備，并維持至移植后3周。2、移植當(dāng)日(0d)，對B、C、D組受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射(TBI)預(yù)處理。照射后立即補充飲水，休息4飛小時后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的移植細胞懸液。對照組B組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640培養(yǎng)液0.4mL ；對照組C組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640細胞懸液0.4mL,包括1X10~7BMC ；D組小鼠中每只從尾靜脈輸注RPMI1640細胞懸液0.4mL，包括I X 10~7BMC和5X10~6SpC。其中，骨髓細胞(BMC)懸液制備操作如下:采用頸椎脫臼法處死供鼠，立即放入75%乙醇中浸泡3 5min ;超凈工作臺中無菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液通過4號針頭制成單細胞懸液，過濾，用紅細胞裂解液破除紅細胞，RPMI1640洗滌3次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至5X 10~7/mL細胞濃度備用。脾細胞(SpC)懸液制備操作如下:無菌取出脾臟，小心去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPM I1640培養(yǎng)液洗滌3遍，然后置于200目不銹鋼篩網(wǎng)中用2mL注射器內(nèi)芯輕輕碾磨，收集細胞沖洗液通過4號針頭制成單細胞懸液，過濾，用紅細胞裂解液破除紅細胞，用RPMI1640洗滌3次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至2.5 X 10~7/mL細胞濃度備用。移植后每天觀察小鼠一般狀態(tài)，包括體重、皮疹、脫毛、結(jié)痂、弓背、腹瀉等，移植14天后每3天進行一次臨床評分，標準參見表I ;瀕死小鼠處死取材，其存活時間記至處死次日；實驗終點為移植后+135d。外周血白細胞計數(shù):每組小鼠于+7d、+10d和+14d計數(shù)WBC監(jiān)測造血重建情況。計數(shù)方法:斷尾取血10 μ L，加入190 μ L白細胞稀釋液中混勻，然后滴加到細胞計數(shù)板上，水平靜置Imin后計數(shù)4個大方格中細胞數(shù)(N)，WBC= (Ν+20)Χ10~9/L0移植觀察記錄表明:Α組小鼠正常存活至實驗終點；Β組小鼠中位存活12.5天，14天內(nèi)全部死亡；C、D組小鼠存活至實驗終點。以上記錄表明C、D組均移植成功，且存活時間達到100天以上，比現(xiàn)有的類似疾病動物模型建立的存活時間長。實施例2本例為小鼠異基因骨髓植入檢測例。取移植后+135d的受鼠進行檢測，按以下步驟進行:1、秋水仙素處理:在做實驗前3 4小時，向小鼠腹腔注射0.1 %的秋水仙素(2-4yg/g)。2、取股骨:實驗時，用頸椎脫臼法迅速將小鼠處死，立即用剪刀剪去后肢的皮膚和肌肉，連同關(guān)節(jié)一起取下兩側(cè)股骨，剔凈其上肌肉。3、取骨髓細胞:用注射器吸取6ml生理鹽水，將注射器針頭插入骨髓腔的一端，用生理鹽水沖出骨髓細胞至離心管，反復(fù)沖洗直至骨腔變白。將收集到的骨髓細胞溶液平衡后放入離心機，以1000r/min離心IOmin,吸去上清液。4、低滲:根據(jù)細胞量多少，加入0.075mol/L KCl低滲液5_6ml，用吸管輕輕吹打混勻，在37 °C恒溫水浴箱內(nèi)低滲20-30分鐘。5、預(yù)固定:低滲完畢,立即加l_2ml新配制的Carnoy固定液,輕輕吹打之后，以2000r/min離心IOmin,小心吸管吸去上清液。6、固定:沿離心管壁緩慢加入固定液7ml，用吸管吹打成細胞懸液。2000rpm的速度離心10分鐘,傾去上清。7、再固定:重復(fù)步驟6的操作至上清基本無色清晰。8、制備細胞懸液:沉淀物中加入適量固定液，用吸管輕輕吹打成細胞懸液。9、滴冰片:從冰箱里取出預(yù)冷的載玻片，手持吸管在載玻片上方約IOcm處向下滴片，2-3滴，使懸液均勻擴散與玻片之上,多余的液體可小心傾去。10、干燥、火焰 固定:玻片于酒精燈外焰迅速來回幾下。11、玻片老化:置于37° C溫箱1-2天后，于65° C烤箱中24h。12、染色:低濃度胰酶消化,清水洗凈,Giemsa染液室溫下染色10分鐘左右。清水沖洗，在室溫下自然干燥。13、鏡檢:先用低倍鏡找到一好的分裂相區(qū)域，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察。如圖3所示，為來自于A組(空白對照組)和D組(cGVHD組)小鼠的染色體圖，箭頭所示為Y染色體。圖中染色體的改變也進一步表明D組小鼠移植成功。實施例3本例為cGVHD組小鼠的臨床及病理檢測例。一、對D組小鼠進行慢性GVHD的臨床評分，其評分標準如表I所示:表I慢性GVHD的臨床評分標準
權(quán)利要求
1.一種小鼠異基因骨髓移植后CGVHD模型的建立方法，通過以下步驟實現(xiàn): (1)以C57BL/6小鼠(H-2b)與BALB/c小鼠(H_2d)雜交出的Fl代雄性小鼠作為供鼠； (2)以BALB/c(H-2d)雌性小鼠作為受鼠； (3)受鼠接受全身照射(TBI)預(yù)處理后，將獲自供鼠的骨髓細胞BMC懸液及脾細胞SpC懸液注射至受鼠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述供鼠及受鼠均采用8周齡小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，供鼠骨髓細胞BMC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，無菌剝離股骨和脛骨，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集含有骨髓的沖洗液制成單細胞懸液，過濾后用紅細胞裂解液破除紅細胞，RPMI1640洗滌若干次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至5X10~7/mL細胞濃度備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，供鼠脾細胞SpC懸液的制備如下:以頸椎脫臼法處死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡:T5min，無菌取出脾臟，去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌若干次，碾磨，收集細胞沖洗液制成單細胞懸液，過濾后用紅細胞裂解液破除紅細胞，用RPMI1640洗滌若干次，計數(shù)并用RPMI1640重懸細胞，調(diào)整至2.5X10~7/mL細胞濃度備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，移植當(dāng)日受鼠接受直線加速器700cGy單次全身照射預(yù)處理，照射后立即補充飲水，休息4飛小時后經(jīng)尾靜脈注射終體積為0.4mL的骨髓細胞BMC懸液及脾細胞SpC懸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，注射給受鼠的骨髓細胞BMC懸液的用量為1X10~7BM C，脾細胞SpC懸液的用量為5X10~6。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小鼠異基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)模型的建立方法，通過制備異基因CB6F1(H-2bxd)雄性供鼠的骨髓和脾細胞，尾靜脈輸注給BALB/c(H-2d)雌性受鼠造模而實現(xiàn)。該模型造模方法具有模擬臨床上異基因造血干細胞移植后慢性移植物抗宿主病的發(fā)生發(fā)展特點；過程簡單易行，建模效率高，重復(fù)性好，國內(nèi)外尚無相同報道；特別是肺部、皮膚的典型病理改變，為在活體動物內(nèi)進行防治人類cGVHD的研究提供實驗平臺。
文檔編號A01K67/027GK103114074SQ20131005522
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者杜欣, 翁建宇, 黃欣, 吳萍, 耿素霞, 賴沛龍 申請人:廣東省人民醫(yī)院