專利名稱：液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝。
背景技術(shù)：
中國是最早利用真菌來防病治病的國家，真菌是我國傳統(tǒng)中藥的重要組成部分。近年來研究表明，真菌多糖是藥用真菌的主要活性物質(zhì)，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，同時還在抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、護(hù)肝、降血脂、降血糖等方面具有廣泛的生物學(xué)功效。真菌多糖主要是從擔(dān)子菌與子囊菌子實體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出的代謝產(chǎn)物。到目前為此，國內(nèi)外已從近300種真菌中獲取到200余種具生物活性的多糖物質(zhì)，其中我國發(fā)現(xiàn)有重要價值的真菌多糖如:云芝多糖、蟲草多糖、猴頭菇多糖、平菇多糖、豬苓多糖、灰樹花多糖、茶樹菇多糖、白樺茸多糖、姬松茸、靈芝多糖等約30多種。真菌多糖是公認(rèn)的有較高效應(yīng)的免疫增強(qiáng)劑，國內(nèi)外對多糖做了大量的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真菌多糖可通過多個層面、多條途徑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。大量免疫實驗證實，多糖能激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)等免疫細(xì)胞的活性，此外其還有促進(jìn)細(xì)胞因子的生成和活化補(bǔ)體等各方面的功效。真菌多糖是通過增強(qiáng)機(jī)體免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子3個層次的免疫系統(tǒng)實現(xiàn)免疫增強(qiáng)作用的[1]。來源于藥用真菌和酵母的β_1，3/1，6-葡聚糖是一種有效的免疫增強(qiáng)劑，人們已經(jīng)知道了它們在免疫系統(tǒng)中的作用方式。此外，β_1，3/1，6-葡聚糖是無毒性的，且它們在所有動物(從無脊椎動物到人)的免疫系統(tǒng)中的作用機(jī)制是相同的。β -1, 3/1，6-葡聚糖不單可以通過注射起作用，還可通過混入飼料投喂起作用。樣褐孔菌，又名白樣鸞，學(xué)名obiiquus,Fuscoporia歐洲人稱之為“chaga”，是一種多孔菌科褐臥孔菌屬食藥用真菌。樺褐孔菌主要生長于白樺、銀樺、榆樹、赤楊等活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存達(dá)6年之久。它主要分布于俄羅斯北部、北歐、中國黑龍江、吉林長白山、日本北海道等北緯45-50°極寒地區(qū)。樺褐孔菌子實體一般呈瘤狀，直徑約25-40 cm，外表堅硬，有深的裂痕，較硬，干時脆，顏色呈黃褐色或更深。從16世紀(jì)以來，樺褐孔菌在俄羅斯、北歐一些國家被廣泛用于惡性腫瘤氣糖尿病、心血管疾病、肝病M和艾滋病M等疾病的治療。在俄羅斯，樺褐孔菌被廣泛用作日常保健品。日本的研究人員則稱樺褐孔菌為一種“萬能藥”。在日本，樺褐孔菌的粉末狀沖劑經(jīng)常作為保健茶來飲用。1955年莫斯科醫(yī)科院(The Medical Academy of Science in Moscow)宣布將樺褐孔菌列為抗癌物質(zhì)，政府批準(zhǔn)樺褐孔菌可用于醫(yī)藥品開發(fā)。美國把樺褐孔菌列入“特殊的天然物質(zhì)”。樺褐孔菌子實體中富含β-D-葡聚糖和超氧化歧化酶，其含量分別是名貴菌類-紅樟菌的30和23倍，超氧化歧化酶的含量是靈芝的55倍。多年來，樺褐孔菌一直作為純中藥在民間用于治療疾病，樺褐孔菌亦被認(rèn)為是21世紀(jì)的功能性保健食品。臨床實驗表明:樺褐孔菌沒有任何毒副作用，且在治療糖尿病、預(yù)防艾滋病、增強(qiáng)免疫力等方面具有明顯的作用[3]。目前的研究報道表明，樺褐孔菌的主要活性成份有多糖、多酚、留體、樺褐孔菌素、黑色素、三萜、鞘胺酯類化合物、生物堿、葉酸衍生物、香草酸、丁香酸及Y-羥基苯甲酸等，最近還有報道指出有學(xué)者已分離出單寧化合物、類固醇、低分子多酚類及木質(zhì)素類化
合物[5]。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌的重要藥理活性成分之一，樺褐孔菌的菌絲和菌核中的多糖主要由葡聚糖、雜多糖和蛋白復(fù)合物組成[6]。研究表明，樺褐孔菌子實體多糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和樹膠醛糖等單糖組成。而葡萄糖是主要的單糖，占到了所有單糖組成的70%以上m。單糖間是通過β -(1，3)糖苷鍵或者β -(1，4)糖苷鍵連接而成。主鏈與側(cè)鏈間以β_(1，6)糖苷鍵連接。木糖和鼠李糖是樺褐孔菌多糖生物活性貢獻(xiàn)最大的單糖Μ。樺褐孔菌多糖的功能特性主要表現(xiàn)在其子實體多糖能夠抑制S180肉瘤的生長[9]，其菌絲體多糖能有效刺激巨噬細(xì)胞分泌IL21、IL26、TNF2A、N0等細(xì)胞因子，細(xì)胞因子通過調(diào)整機(jī)體的免疫狀態(tài)間接地殺傷腫瘤細(xì)胞[1°]。此外，樺褐孔菌的水溶性和非水溶性多糖對糖尿病小鼠具有降低血糖的作用，尤其是樺褐孔菌多糖的粗提取液，它的降血糖作用可持續(xù)48h。樺褐孔菌多酚主要由黑色素類物質(zhì)和牛奶樹堿同系物組成[11]，樺褐孔菌子實體中主要有4-羥基-3，5 二甲氧基苯甲酸-2’ -羥基-1’ -羥甲基乙酸乙酯，原兒茶酸(PCA)，咖啡酸(CA)，3，4-二羥基苯甲醛(DB)，2，5-二羥基-1,3-苯二甲酸(DTA)，紫丁香酸(SA)和3，4- 二羥基苯乙烯基丙酮(DBL)[11]等小分子酚類，Lee[12]等人通過對樺褐孔菌子實體進(jìn)行提取純化后，得到了六種大分子多酚類化合物，分別是Phelligridin D，Phelligridin E, Phelligridin G, Inonoblin A, Inonoblin B, Inonoblin C。Zheng[13]等人用發(fā)酵罐對樺褐孔菌菌絲體進(jìn)行液體深層發(fā)酵，經(jīng)過提取分析后發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌菌絲體中主要有小分子酚類、糖苷化黃酮、黃酮苷元、多酚等4大類物質(zhì)。樺褐孔菌多酚具有抗氧化[13’14]、抗腫瘤_、護(hù)肝[3]、免疫促進(jìn)[11]等功能。近年來報道指出，從樺褐孔菌子實體中提取的兒茶酚，具有顯著的基因保護(hù)和抗氧化功能[17]，對一些自由基尤其是DPPH自由基、02_自由基和OH自由基均具有較強(qiáng)的清除活性，樺褐孔菌多酚清除氧自由基的清除率達(dá)到80%以上，相比D-VC鈉和沒食子酸丙酯等常用的抗氧化劑具有明顯的優(yōu)勢，作為一種天然抗氧化劑具有廣闊的應(yīng)用前景。樺褐孔菌寄生于樺樹上，是極其耐寒的菌種，能在零下69°C的環(huán)境下生長，生長期達(dá)15年。野生的樺褐孔菌成年菌會吸干樺樹的精華，導(dǎo)致樹木干枯，故而其自然資源十分稀缺，其價格在國際市場上遠(yuǎn)勝珍貴藥用真菌桑黃。而且目前尚沒有有效的方法人工培育菌核和子實體，因此采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體獲得活性成分是一個可行的代替方法。采用液體深層發(fā)酵的方法，和傳統(tǒng)的真菌培育方法相比，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)品可以控制等優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在發(fā)明人前期公開的技術(shù)CN102108371A基礎(chǔ)上提供一種優(yōu)化的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝，獲得的免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)含量更高，活性更好，產(chǎn)品更利于工業(yè)化應(yīng)用。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝，所述的工藝步驟如下:
(1)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種,接種至斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得活化菌種；
(2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期得液體菌
種；
(3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:8-10，所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖30-32g/L，木質(zhì)纖維素 32-38g/L，促進(jìn)劑 0.9-lg/L，誘導(dǎo)劑 3X10_5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH2PO4 lg/L,ZnSO4.2H20 0.0lg/L, K2HPO4 0.4g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/L,CuSO4.5H20 0.02 g/L, CoCl2 0.01 g/L, MnSO4.H2O 0.08 g/L, pH 值 6.0 ;
液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度27-28°C，發(fā)酵罐空氣流量0.5-1.0 vvm，發(fā)酵罐內(nèi)部壓力0.1-0.25 kg/cm3，攪拌轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期12-14天；
(4)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾,獲得菌絲體和發(fā)酵液,將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的30%-40%后得發(fā)酵濃縮液，按I g菌絲體粉加30-40 ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，干燥后得粉狀的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。隨著研究的進(jìn)行，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人前期公開的技術(shù)(CN102108371A)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)即多糖、多酚的產(chǎn)量及其活性不是很理想，同時對木質(zhì)纖維素的分解也不是很徹底，因此，發(fā)明人對工藝進(jìn)行了再優(yōu)化創(chuàng)造，主要體現(xiàn)在培養(yǎng)基的創(chuàng)新上:
在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加促進(jìn)劑，通過增加細(xì)胞的通透性和/或直接影響多糖和多酚合酶的產(chǎn)生，達(dá)到提高樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖、多酚、黑色素產(chǎn)量的目的，即提高了樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的產(chǎn)量。在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中同時添加促進(jìn)劑和木質(zhì)纖維素，在促進(jìn)劑的增加細(xì)胞透性及多糖、多酚合酶產(chǎn)生的基礎(chǔ)上，促進(jìn)了胞內(nèi)合成的木質(zhì)纖維素分解酶(漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶)的分泌，從而加強(qiáng)對培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素的分解，木質(zhì)纖維素分解更徹底，達(dá)到進(jìn)一步提高多糖和多酚(樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì))產(chǎn)量的目的。特別是使多酚類化合物中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、phelligridin G、davallialactone、inoscavin B 的產(chǎn)率大巾畐提高。在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，促進(jìn)了樺褐孔菌多酚類物質(zhì)(樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的一種)的生物合成。本發(fā)明利用誘導(dǎo)劑提高樺褐孔菌發(fā)酵多酚、特別是高活性多酚如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)的產(chǎn)量。在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中同時添加促進(jìn)劑和誘導(dǎo)劑，并與木質(zhì)纖維素配合，在促進(jìn)劑的增加細(xì)胞透性及多酚合酶產(chǎn)生的基礎(chǔ)上，添加多酚生物合成的誘導(dǎo)劑，相互協(xié)同促進(jìn)，從而極大促進(jìn)了樺褐孔菌發(fā)酵多糖、多酚類物質(zhì)的生物合成，木質(zhì)纖維素分解更徹底達(dá)到進(jìn)一步提高多糖、多酚，特別是高活性多酚如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)產(chǎn)量的目的，使得獲得的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的活性更好。菌絲體富含胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)多酚，發(fā)酵液富含胞外多糖及胞外多酚，發(fā)明人前期公開的技術(shù)(CN102108371A)是對菌絲體、發(fā)酵液分別提取處理，從而獲得不同的活性物質(zhì)，這樣不但處理復(fù)雜，且成本高，不適合工業(yè)化應(yīng)用，且不能發(fā)揮胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)多酚與胞外多糖及胞外多酚的協(xié)同功效，本發(fā)明對菌絲體破壁后做干燥粉碎處理，對發(fā)酵液做濃縮處理，并控制菌絲體粉與發(fā)酵濃縮液的配比，這樣菌絲體粉與發(fā)酵濃縮液混合均勻度好，干燥獲得樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)，以到達(dá)胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)多酚與胞外多糖及胞外多酚的最佳配比，且混合均勻度好，發(fā)揮最佳的功效，這樣不但產(chǎn)品的活性、功效好，且處理簡單，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可直接用作各類動物飼料的添加劑使用。作為優(yōu)選，所述促進(jìn)劑為油酸、甲醇或Tween-80。作為優(yōu)選，所述誘導(dǎo)劑為苯并噻二唑或茉莉酸甲酯。苯并噻二唑是植物內(nèi)源性激素類似物水楊酸的功能類似物，能促進(jìn)多酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，茉莉酸甲酯是天然存在的植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)花青素的生物合成。作為優(yōu)選，所述木質(zhì)纖維素選自農(nóng)作物秸桿、木屑、花生殼、甘蔗渣中的一種。最優(yōu)選的方案是在花生殼、甘蔗渣中選擇一種作為木質(zhì)纖維素原料，發(fā)明人通過大量研究發(fā)明，農(nóng)作物秸桿、木屑等在作為木質(zhì)纖維素原料時效果并不理想，這是因為材料本身的特質(zhì)的限制，然后再經(jīng)過研究探索后發(fā)現(xiàn)，花生殼、甘蔗渣作為木質(zhì)纖維素原料，其發(fā)酵產(chǎn)物中多糖和多酚的活性會較高，木質(zhì)纖維素的降解也更徹底，推其原因:主要是花生殼、甘蔗渣中木質(zhì)纖維素的3個組分纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的比例構(gòu)成更適合樺褐孔菌的降解。作為優(yōu)選，所述斜面菌種培養(yǎng)基的配方為:麥芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4g/1OOmL,瓊脂 10 g/1OOmL, pH 值為 5.4-5.6。作為優(yōu)選，斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的參數(shù)為:溫度27_28°C，培養(yǎng)200-250小時。作為優(yōu)選，所述液體種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖5g/100mL，蛋白胨
0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/1OOmL, KH2PO4 0.1g/1OOmL, MgSO4 0.15 g/1OOmL, CaCl2 0.01g/100mL。作為優(yōu)選，液體菌種培養(yǎng)的參數(shù)為:溫度27-28 °C，培養(yǎng)3.5-4.5d，搖床轉(zhuǎn)速80-140轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明的有益效果是:
1、在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加促進(jìn)劑，通過增加細(xì)胞的通透性和/或直接影響多糖和多酚合酶的產(chǎn)生，達(dá)到提高樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖、多酚、黑色素產(chǎn)量的目的，即提高了樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的產(chǎn)量。2、在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中同時添加促進(jìn)劑和木質(zhì)纖維素，在促進(jìn)劑的增加細(xì)胞透性及多糖、多酚合酶產(chǎn)生的基礎(chǔ)上，促進(jìn)了胞內(nèi)合成的木質(zhì)纖維素分解酶(漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶)的分泌，從而加強(qiáng)對培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素的分解，木質(zhì)纖維素分解更徹底，達(dá)到進(jìn)一步提高多糖和多酚(樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì))產(chǎn)量的目的。特別是使多酚類化合物中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、phelligridin G、davallialactone、inoscavin B 的產(chǎn)率大巾畐提高。3、在液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑，促進(jìn)了樺褐孔菌多酚類物質(zhì)(樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的一種)的生物合成。本發(fā)明利用誘導(dǎo)劑提高樺褐孔菌發(fā)酵多酚、特別是高活性多酚如表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)的產(chǎn)量。4、產(chǎn)品的活性、功效好，且處理簡單，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可直接用作各類動物飼料的添加劑使用。


圖1是本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物提取的多糖的促生細(xì)胞因子作用圖，其中圖1 (a) TNF:腫瘤壞死因子，圖1 (b) IFN:干擾素，圖1 (c)IL-2:白細(xì)胞介素-2，圖1 (cOlL-Ιβ:白細(xì)胞介素- β。圖2是本發(fā)明發(fā)酵產(chǎn)物提取的多糖的促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖效果圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。樺褐孔菌市售，購自徐州師范大學(xué)。實施例1
(I)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種，劃線接種至斜面菌種培養(yǎng)基上27°C，培養(yǎng)250小時，獲得活化菌種；斜面菌種培養(yǎng) 基的配方為:麥芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，瓊脂10 g/1OOmL, pH 值為 5.4-5.6。(2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基27°C，搖床上培養(yǎng)4.5d至對數(shù)期得液體菌種，搖床轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘。液體種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖5g/100mL,蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/1OOmL, KH2PO4 0.1 g/1OOmL, MgSO4 0.15 g/100mL, CaCl2
0.01 g/100mL。(3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入裝有液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:8，液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度27 °C，發(fā)酵罐空氣流量0.5vvm,發(fā)酵罐內(nèi)部壓力0.1 kg/cm3，攪拌轉(zhuǎn)速70轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期14天；所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖30g/L，玉米秸桿32g/L，油酸lg/L，苯并噻二唑 3X 10_5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH2PO4 lg/L, ZnSO4.2H20 0.01g/L, K2HPO4 0.4g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/L, CuSO4.5H20 0.02 g/L, CoCl2 0.01 g/L，MnSO4 -H2O 0.08 g/L, pH值6.0 ;發(fā)酵終點確立的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開始衰老。(4)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾,獲得菌絲體和發(fā)酵液,將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的30%后得發(fā)酵濃縮液，按Ig菌絲體粉加30ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，真空干燥后得粉狀的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。實施例2
(I)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種，劃線接種至斜面菌種培養(yǎng)基上28°C，培養(yǎng)200小時，獲得活化菌種；斜面菌種培養(yǎng)基的配方為:麥芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，瓊脂10 g/1OOrnL, pH 值為 5.4-5.6。(2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基28 V，搖床上培養(yǎng)3.5d至對數(shù)期得液體菌種，搖床轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分鐘。液體種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖5g/100mL,蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/1OOmL, KH2PO4 0.1 g/1OOmL, MgSO4 0.15 g/100mL, CaCl2
0.01 g/100mL。
(3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入裝有液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1: 10，液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵罐空氣流量1.0vvm,發(fā)酵罐內(nèi)部壓力0.25 kg/cm3,攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期12天；所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖32g/L，花生殼38g/L，甲醇0.9g/L，茉莉酸甲酯 3X10—5 g/L，蛋白胨 3g/L, KH2PO4 lg/L, ZnSO4.2H20 0.0lg/L, K2HPO40.4g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/L, CuSO4.5H20 0.02 g/L, CoCl20.01 g/L, MnSO4.H2O 0.08 g/L, pH值6.0 ;發(fā)酵終點確立的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開始衰老。(4)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾,獲得菌絲體和發(fā)酵液,將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的40%后得發(fā)酵濃縮液，按Ig菌絲體粉加40ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，冷凍干燥后得粉狀的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。
實施例3
(I)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種，劃線接種至斜面菌種培養(yǎng)基上28°C，培養(yǎng)220小時，獲得活化菌種；斜面菌種培養(yǎng)基的配方為:麥芽浸膏40 g/100mL，蛋白胨4 g/100mL，瓊脂10 g/1OOrnL, pH 值為 5.4-5.6。(2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基28 V，搖床上培養(yǎng)4d至對數(shù)期得液體菌種，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。液體種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖5g/100mL,蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.1g/1OOmL, KH2PO4 0.1 g/1OOmL, MgSO4 0.15 g/100mL, CaCl2
0.01 g/100mL。(3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入裝有液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:9，液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度28°C，發(fā)酵罐空氣流量0.8vvm,發(fā)酵罐內(nèi)部壓力0.2 kg/cm3,攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期13天；所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖31g/L,甘鹿洛35g/L, Tween-80lg/L，苯并噻二唑 3X10_5 g/L，蛋白胨 3g/L, KH2PO4 lg/L，ZnSO4.2H20 0.0lg/L, K2HPO40.4g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/L, CuSO4.5H20 0.02 g/L, CoCl20.01 g/L, MnSO4.H2O 0.08 g/L, pH值6.0，發(fā)酵終點確立的標(biāo)準(zhǔn)為還原糖含量低于2%，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體開始衰老。(4)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾,獲得菌絲體和發(fā)酵液,將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的35%后得發(fā)酵濃縮液，按Ig菌絲體粉加35ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，冷凍干燥后得粉狀的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。
按照發(fā)明人前期公開的技術(shù)CN102108371A的實施例1記載的對于胞外多糖(提取自發(fā)酵液)、胞內(nèi)多糖(提取自菌絲體)、胞外多酚(提取自發(fā)酵液)的提取方法，胞內(nèi)多酚提取方法為:菌絲體加入70%丙酮，用超聲波細(xì)胞破碎儀破壁。將破壁后的漿液過濾、離心，上清液濃縮、干燥后的產(chǎn)品即為胞內(nèi)多酚。對本發(fā)明工藝獲得的發(fā)酵液和菌絲體進(jìn)行分析，并與CN102108371A (對比例)的數(shù)據(jù)對比，結(jié)果見下表。
權(quán)利要求
1.一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝，其特征在于:所述的工藝步驟如下: (1)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種，接種至斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得活化菌種； (2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期得液體菌種； (3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:8-10，所述液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖30-32g/L，木質(zhì)纖維素 32-38g/L，促進(jìn)劑 0.9-lg/L，誘導(dǎo)劑 3X10_5 g/L，蛋白胨 3g/L，KH2PO4 lg/L，ZnSO4.2H20 0.0lg/L, K2HPO4 0.4g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L, MgSO4.7H20 0.5 g/L,CuSO4.5H20 0.02 g/L, CoCl2 0.01 g/L, MnSO4.H2O 0.08 g/L, pH 值 6.0 ; 液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度27-28°C，發(fā)酵罐空氣流量0.5-1.0vvm,發(fā)酵罐內(nèi)部壓力0.1-0.25 kg/cm3，攪拌轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期12-14天； (4)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾,獲得菌絲體和發(fā)酵液,將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的30%-40%后得發(fā)酵濃縮液，按Ig菌絲體粉加30-40ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，干燥后得粉狀的樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于:所述促進(jìn)劑為油酸、甲醇或Tween-80。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于:所述誘導(dǎo)劑為苯并噻二唑或茉莉酸甲酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于:所述木質(zhì)纖維素選自農(nóng)作物秸桿、木屑、花生殼、甘蔗渣中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的工藝，其特征在于:所述斜面菌種培養(yǎng)基的配方為:麥芽浸膏 40 g/100mL，蛋白胨 4 g/100mL，瓊脂 10 g/100mL，pH 值為 5.4-5.6。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的工藝，其特征在于:斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的參數(shù)為:溫度27-28°C，培養(yǎng) 200-250 小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的工藝，其特征在于:所述液體種子培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖 5g/100mL，蛋白胨 0.5g/100mL，酵母浸膏 0.lg/100mL，KH2PO4 0.1 g/1OOmL,MgSO4 0.15 g/1OOmL, CaCl2 0.01 g/100mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的工藝，其特征在于:液體菌種培養(yǎng)的參數(shù)為:溫度27-28°C，培養(yǎng)3.5-4.5d，搖床轉(zhuǎn)速80-140轉(zhuǎn)/分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝。本發(fā)明包括菌種活化、液體菌種培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵及樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備等主要步驟。本發(fā)明提供一種優(yōu)化的液體深層發(fā)酵生產(chǎn)樺褐孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝，獲得的免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)含量更高，活性更好，產(chǎn)品更利于工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號A01G1/04GK103156052SQ201310055029
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者徐向群 申請人:徐向群