專利名稱：一種繡球菌抗腫瘤免疫活性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種繡球菌抗腫瘤免疫活性的檢測方法，用于標(biāo)示繡球菌的抗腫瘤免疫活性。
背景技術(shù)：
:本發(fā)明主要針對繡球菌進(jìn)行抗腫瘤免疫活性的檢測和標(biāo)示，同時適用于其他食用菌或藥用菌的抗腫瘤免疫活性的檢測和標(biāo)示。繡球菌是藥食兩用大型真菌，生活條件苛刻，資源蘊(yùn)藏量比較稀少，是一種非常珍稀名貴的食用菌，在食用菌中僅次于冬蟲夏草、羊肚菌、塊菌等珍品。因野生繡球菌稀少，而人工培養(yǎng)難度大，因此有“夢幻之菇”之稱。直至近幾年才實(shí)現(xiàn)繡球菌的人工栽培。繡球菌營養(yǎng)豐富，含多種維生素、氨基酸等成分，最突出的特點(diǎn)是葡聚糖含量高，其葡聚糖含量是菇類之最。已有實(shí)驗(yàn)表明，繡球菌葡聚糖含量占繡球菌干重的40%以上，是靈芝、姬松茸葡聚糖含量的數(shù)倍，其中P -1, 3-D葡聚糖含量占葡聚糖總量的70%左右，而大多具有抗腫瘤活性的多糖都是帶有1，6分支的P -1, 3-D葡聚糖。專家們通過X-射線繞射分析得知，^ -1, 3-D-glucan呈現(xiàn)的獨(dú)特螺旋結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈上的多肽、脂類基團(tuán)是發(fā)揮抗腫瘤功能的重要成因，其分子結(jié)構(gòu)含有蛋白組分，屬于繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體(Sparassiscrispa(ffulf.)Fr.Glucan Protein, SGP)。研究發(fā)現(xiàn)，與多數(shù)食用菌多糖一樣，SGP具有抗腫瘤活性，且該活性較其他多糖活性高。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)SGP對于肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種癌癥有很好的抑制效果。SGP不僅有抗腫瘤活性，而且可以提高機(jī)體造血功能。目前，關(guān)于繡球菌的研究多集中在培養(yǎng)條件的優(yōu)化、繡球菌葡聚糖的提取工藝、繡球菌葡聚糖及其他成分的活性研究，但對于繡球菌的活性檢測方法尚未見報(bào)道。隨著生活質(zhì)量的提高，食品及保健品行業(yè)的迅速發(fā)展，繡球菌也將應(yīng)用到各領(lǐng)域中。因此，建立一種繡球菌的活性檢測方法，并且用通俗易懂的方式直觀地表示出來，對于繡球菌類產(chǎn)品的推廣應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。所述繡球菌的活性檢測方法也適用于其它食用菌或藥用菌的抗腫瘤免疫活性檢測
發(fā)明內(nèi)容
:針對繡球菌現(xiàn)有研究，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種繡球菌抗腫瘤免疫活性檢測方法的技術(shù)方案，用于標(biāo)示和區(qū)分繡球菌產(chǎn)品，使其生物活性直觀通俗地表達(dá)出來，便于人們選用此類產(chǎn)品。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，SGP對腫瘤、糖尿病、心血管疾病等有驚人的效果，被譽(yù)為“免疫黃金”。SGP經(jīng)過化學(xué)方法處理后其生物學(xué)功能消失殆盡，原因在于破壞了 SGP的螺旋結(jié)構(gòu)、分支及側(cè)鏈上的活性基團(tuán)。由此可知，SGP的生物活性與葡聚糖的分子量、分子構(gòu)型、支鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。 由于繡球菌生物活性成分SGP，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，純化困難，過度純化的SGP，天然結(jié)構(gòu)被破壞，從而失去其固有的生物活性。純化的SGP，葡聚糖含量高，而沒有天然生物活性，因而檢測繡球菌產(chǎn)品的葡聚糖含量，對評價繡球菌產(chǎn)品的生物活性意義不大，開發(fā)一種能標(biāo)示繡球菌生物活性的檢測方法，直接檢測繡球菌產(chǎn)品的生物活性，非常有必要。SGP的抗腫瘤免疫活性可用抗腫瘤免疫活性因子水平(Anticancer ImmuneFactor, ACIF)標(biāo)示。SGP具有抗腫瘤免疫活性，但其提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力并非直接作用于腫瘤細(xì)胞和病原微生物，而是通過刺激、激活免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子發(fā)揮作用。IFN-Y是由活性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，具有抗病毒、抗腫瘤活性，參與免疫調(diào)節(jié)。因此，IFN-Y濃度的高低可作為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力的一種評價指標(biāo)。刀豆素A (ConA)，是一種植物凝集素，可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y等細(xì)胞因子。本發(fā)明采用單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞，通過該細(xì)胞經(jīng)繡球菌刺激后所產(chǎn)生細(xì)胞因子INF- y的表達(dá)量，與ConA誘導(dǎo)產(chǎn)生的INF- y的表達(dá)量比較，用相應(yīng)ConA的濃度評價繡球菌的生物活性，標(biāo)示為ACIF值,直觀標(biāo)示繡球菌產(chǎn)品的生物活性。本發(fā)明的有益效果是:實(shí)現(xiàn)了繡球菌抗腫瘤免疫活性的高通量檢測，直觀標(biāo)示繡球菌產(chǎn)品的抗腫瘤免疫活性，檢測過程簡潔，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且本發(fā)明為定量測定食用菌或藥用菌生物活性提供了基礎(chǔ)。一種繡球菌抗腫瘤免疫活性的檢測方法，其特征在于包括以下工藝步驟:I)取繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體(SGP)樣品，配制成溶液；2)取THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IO5 IO6個/ml ；3)向步驟2)中培養(yǎng)得到的細(xì)胞中加入步驟I)的SGP溶液至終濃度達(dá)到IOii g
2.0mg/ml,然后進(jìn)行培養(yǎng)；4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細(xì)胞上清液；5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測IFN- Y濃度，在SGP作用濃度為IOiig 2.0mg/ml范圍內(nèi)，IFN-y濃度與SGP濃度具有明顯的正相關(guān)。6)取ConA，按上述步驟檢測IFN- y濃度，控制ConA終濃度為1_3 u g/ml，用ConA濃度值的10倍,作為抗腫瘤免疫活性因子水平(Anticancer Immune Factor, ACIF)值。在一個實(shí)施方式中，所述的一種繡球菌抗腫瘤免疫活性的檢測方法，包括以下工藝步驟:I)取SGP樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基配制成溶液；2)取THP-1細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至IO5 IO6個/ml，在37°C下培養(yǎng)24h ；3)向步驟2)培養(yǎng)的細(xì)胞中加入步驟I)的SGP溶液并使SGP終濃度達(dá)到10 y g
2.0mg/ml，然后置于37°C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h ；4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物以IOOOg離心20min后收集細(xì)胞上清液；5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測IFN- Y濃度，即用人IFN- y酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測IFN-Y濃度:(人IFN-Y酶聯(lián)免疫分析試劑盒為現(xiàn)有產(chǎn)品)。在SGP作用濃度為10 ii g 2.0mg/ml范圍內(nèi)，IFN- y濃度與SGP具有明顯的正相關(guān)。6)取ConA，按上述步驟檢測IFN- y濃度，控制ConA終濃度為1_3 U g/ml，用ConA濃度值的10倍，作為ACIF值。
本發(fā)明的檢測方法也適用于其它食用菌或藥用菌的抗腫瘤免疫活性檢測。所述食用菌或藥用菌還包括灰樹花、香菇、冬蟲夏草等。


圖1為繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體生物活性檢測圖；圖2為灰樹花多糖生物活性檢測圖；圖3為香菇多糖生物活性檢測圖；圖4為蟲草多糖生物活性檢測圖。圖中:** 表示 P<0.05, *** 表示 P〈0.01。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1:繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體(SGP)生物活性檢測用RPMI1640培養(yǎng)基配制lmg/ml的SGP溶液；用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-1O6個/ml ；將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h ；培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml SGP溶液，至SGP溶液終濃度分別為0 y g/ml、10 u g/ml、100 u g/ml>200u g/ml ；37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；以IOOOg離心20min收集細(xì)胞上清液；用ELASA法檢測IFN- Y濃度，即用人IFN- y酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測IFN- y濃度:(人IFN-Y酶聯(lián)免疫分析試劑盒為現(xiàn)有產(chǎn)品)標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣本分別取100 U I加入到酶標(biāo)板孔中，做好標(biāo)記；分別向孔中加50 ill酶聯(lián)親和物，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；酶標(biāo)板覆膜于37°C孵育反應(yīng)60min，充分棄盡孔內(nèi)液體并扣干孔內(nèi)剩余殘液，用預(yù)先稀釋好的清洗液反復(fù)沖洗5次，并扣干孔內(nèi)剩余液體；每孔依照次序分別加入底物I和II各50 ill，充分混勻。室溫下避光反應(yīng)15min ；反應(yīng)后每孔加終止液50 U I,充分混勻，終止反應(yīng)；30min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm下讀取OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖1初步確定此方法對繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體生物活性檢測是有效的。實(shí)施例2:灰樹花多糖活性檢測取灰樹花多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基或蒸懼水配制lmg/ml的灰樹花多糖溶液；用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞密度調(diào)整至IO5 IO6個/ml ；將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h或36h ；培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml灰樹花多糖，至灰樹花多糖終濃度分別為Oii g/ml、10 u g/ml、100 u g/ml、200 u g/ml ；37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)36或48h ；
以IOOOg離心20min收集細(xì)胞上清；ELASA法檢測IFN- y濃度，方法同實(shí)施例1。已有研究表明灰樹花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖2所示結(jié)果與已有研究成果基本一致，同樣可證明灰樹花多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，因此可以驗(yàn)證此檢測方法的有效性。實(shí)施例3:香菇多糖活性檢測取香菇多糖烘干樣品，用RPMI1640培養(yǎng)基配制5mg/ml的香菇多糖溶液；用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-1O6個/ml ；將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h ；培養(yǎng)碟中加入適量5mg/ml香燕多糖,至香燕多糖終濃度分別為Oii g/ml>500 U g/ml、lmg/ml、2mg/ml ；37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24或36h ；以IOOOg離心20min收集細(xì)胞上清；ELISA法檢測IFN- y濃度:方法同實(shí)施例1。已有大量研究表明香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖3所示結(jié)果與已有的動物及原代細(xì)胞檢測結(jié)果基本一致，因此可以驗(yàn)證此檢測方法的有效性。實(shí)施例4:冬蟲夏草多糖活性檢測。用RPMI1640培養(yǎng)基配制lmg/ml的冬蟲夏草多糖溶液；用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-1O6個/ml ；將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)36h ；培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml冬蟲夏草多糖，至冬蟲夏草多糖終濃度分別為0 y g/ml、10 u g/ml、100 u g/ml、200 u g/ml ；37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；以IOOOg離心20min收集細(xì)胞上清；ELISA法檢測IFN- y濃度:方法同實(shí)施例1。已有研究表明蟲草多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，圖4所示結(jié)果與已有研究結(jié)果基本一致，因此可以驗(yàn)證此檢測方法的有效性?；覙浠ǘ嗵恰⑾x草多糖和香菇多糖經(jīng)此方法檢測，檢測結(jié)果均進(jìn)一步證明該方法的有效性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明也能夠檢測出除上述實(shí)驗(yàn)例之外的其它多糖的生物活性。實(shí)施例5:繡球菌樣品抗腫瘤免疫活性的檢測用RPMI1640培養(yǎng)基配制lmg/ml的繡球菌樣品溶液；用RPMI1640培養(yǎng)基將THP-1細(xì)胞密度調(diào)整至IO5-1O6個/ml ；將調(diào)整好密度的細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)碟中，在37°C下培養(yǎng)24h ；培養(yǎng)碟中加入適量lmg/ml繡球菌樣品，至繡球菌樣品終濃度為100 U g/ml ；37 °C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ；以IOOOg離心20min收集細(xì)胞上清液；ELISA法檢測IFN- y濃度:方法同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-Y濃度與濃度為1.5 ii g/ml的ConA相當(dāng)，所以確定此繡球菌樣品的ACIF值為15+。以上實(shí)施例僅僅是為了輔助理解本發(fā)明，并非因此限定本發(fā)明的范圍，凡是不脫離說明書中描述的本發(fā)明精神和范圍下所做任何等效培養(yǎng)基、步驟替換或改變，或直接或間接見本發(fā)明運(yùn)用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均包括在本發(fā)明專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種繡球菌抗腫瘤免疫活性的檢測方法，其特征在于包括以下工藝步驟: 1)取繡球菌葡聚糖蛋白復(fù)合體(SGP)樣品，配制成溶液； 2)取THP-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IO5 IO6個/ml； 3)向步驟2)中培養(yǎng)得到的細(xì)胞中加入步驟I)的SGP溶液至終濃度達(dá)到IOiig 2.0mg/ml,然后進(jìn)行培養(yǎng)； 4)取步驟3)得到的培養(yǎng)物離心后收集細(xì)胞上清液； 5)取步驟4)得到的細(xì)胞上清液用ELASA法檢測IFN-Y濃度，在SGP作用濃度為IOiig 2.0mg/ml范圍內(nèi)，IFN-y濃度與SGP濃度具有明顯的正相關(guān)。
6)取ConA，按上述步驟檢測IFN-y濃度，控制ConA終濃度為1_3 u g/ml，用ConA濃度值的10倍,作為抗腫瘤免疫活性因子水平(Anticancer Immune Factor, ACIF)值。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的步驟I)中RPMI1640培養(yǎng)基配制SGP溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整THP-1細(xì)胞密度。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中調(diào)整細(xì)胞密度的THP-1細(xì)胞置于37°C下進(jìn)行培養(yǎng)24 36h。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的步驟3)中加入SGP溶液后的細(xì)胞液置于37°C、CO2濃度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于抗腫瘤免疫活性水平用ACIF值來標(biāo)示。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于ACIF值是ConA濃度值的10倍。
8.如權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的檢測方法，其特征在于該檢測方法也適用于其它食用菌或藥用菌的抗腫瘤免疫活性檢測。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于所述食用菌或藥用菌還包括灰樹花、香菇、冬蟲夏草等。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種繡球菌抗腫瘤免疫活性檢測方法，用于標(biāo)示和區(qū)分繡球菌產(chǎn)品，使其生物活性直觀通俗地表達(dá)出來，便于人們選用此類產(chǎn)品。本發(fā)明檢測方法通過用繡球菌刺激單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞后所產(chǎn)生細(xì)胞因子INF-γ的表達(dá)量，與ConA誘導(dǎo)產(chǎn)生的INF-γ的表達(dá)量比較，用相應(yīng)ConA的濃度評價繡球菌的生物活性，標(biāo)示為ACIF值，直觀標(biāo)示繡球菌產(chǎn)品的生物活性。
文檔編號G01N33/569GK103197065SQ20131013903
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者呂正兵, 董淮海, 葉甫云 申請人:上?？茞凵锛夹g(shù)有限公司