本發(fā)明涉及一種細(xì)胞選擇方法、細(xì)胞檢測方法、細(xì)胞選擇裝置及細(xì)胞檢測裝置。

背景技術(shù)：

專利文獻(xiàn)1中記述了一種將流式細(xì)胞儀等運(yùn)用于熒光原位雜交法(fish法)下的檢測時(shí)的細(xì)胞的處理方法。利用fish法，讓標(biāo)記探針結(jié)合到細(xì)胞中的檢測對象dna序列區(qū)并由此染色細(xì)胞，檢測出因標(biāo)記探針而產(chǎn)生的熒光，以此就能進(jìn)行異常細(xì)胞的檢測。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本專利（特表）2005-515408號公報(bào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

采用原位雜交法時(shí)，有時(shí)會出現(xiàn)標(biāo)記探針的染色性差的細(xì)胞或引起非特異性反應(yīng)的細(xì)胞。如此，如果分析對象細(xì)胞中混入染色不良的細(xì)胞，會導(dǎo)致無法精準(zhǔn)地檢測出異常細(xì)胞。因此，精確地檢測出異常細(xì)胞成為人們的普遍要求。

解決課題的手段

本發(fā)明第一技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞選擇方法。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞選擇方法包括以下步驟：試樣制備步驟，用第一熒光色素對細(xì)胞中的核酸染色，并使含第二熒光色素的評價(jià)用探針與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)雜交，以此制備試樣；受光步驟，用光照射試樣，并接收來自第一熒光色素的熒光和來自第二熒光色素的熒光；選擇步驟，根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的強(qiáng)度和來自第二熒光色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞。第一熒光色素是發(fā)出第一波長的熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素。

本發(fā)明第二技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞選擇方法。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞選擇方法包括以下步驟：試樣制備步驟，用第一熒光色素對細(xì)胞中的核酸染色，并使含第二熒光色素的評價(jià)用探針與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)雜交，以此制備試樣；拍攝步驟，用光照射試樣，并對試樣中的細(xì)胞進(jìn)行拍攝；亮度獲取步驟，根據(jù)在拍攝步驟拍攝的細(xì)胞圖像獲取來自第一熒光色素的熒光的圖像的亮度和來自第二熒光色素的熒光的圖像的亮度；選擇步驟，根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的圖像的亮度和來自第二熒光色素的熒光的圖像的亮度選擇分析對象細(xì)胞。第一熒光色素是發(fā)出第一波長的熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素。

本發(fā)明第三技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞檢測方法。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞檢測方法包括：試樣制備步驟，用第一熒光色素對細(xì)胞中的核酸染色，用含第二熒光色素的評價(jià)用探針與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)進(jìn)行雜交，并用含第三熒光色素的檢測用探針與細(xì)胞中dna的檢測對象區(qū)雜交，以此制備試樣；受光步驟，用光照射試樣，并接收來自第一熒光色素的熒光、來自第二熒光色素的熒光和來自第三熒光色素的熒光；選擇步驟，根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的強(qiáng)度和來自第二熒光色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞；檢測步驟，根據(jù)來自第三熒光色素的熒光從分析對象細(xì)胞檢測出異常細(xì)胞。第一熒光色素是發(fā)出第一波長熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素，第三熒光色素是發(fā)出不同于第一和第二波長的第三波長的熒光的色素。

本發(fā)明第四技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞選擇裝置。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞選擇裝置包括：試樣制備部件，其混合細(xì)胞、含用于染色細(xì)胞中的核酸的第一熒光色素的核酸染色用試劑、以及含有與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)雜交的且含第二熒光色素的評價(jià)用探針的試劑，以此制備試樣；流動室，供試樣流動；光源，用光照射在流動室流動的試樣；受光部件，接收來自第一熒光色素的熒光和來自第二熒光色素的熒光；處理部件。第一熒光色素是發(fā)出第一波長熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素。處理部件根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的強(qiáng)度和來自第二熒光色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞。

本發(fā)明第五技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞選擇裝置。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞選擇裝置包括：試樣制備部件，混合細(xì)胞、含染色細(xì)胞中核酸的第一熒光色素的核酸染色用試劑、以及含有與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)雜交的且含第二熒光色素的評價(jià)用探針的試劑，以此制備試樣；流動室，供試樣流動；光源，用光照射在流動室流動的試樣；拍攝部件，拍攝試樣中的細(xì)胞；處理部件。第一熒光色素是發(fā)出第一波長熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素。處理部件根據(jù)拍攝部件所拍攝的細(xì)胞圖像獲取來自第一熒光色素的熒光的圖像的亮度和來自第二熒光色素的熒光的圖像的亮度，根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的圖像的亮度和來自第二熒光色素的熒光的圖像的亮度選擇分析對象細(xì)胞。

本發(fā)明第六技術(shù)方案涉及一種細(xì)胞檢測裝置。本技術(shù)方案涉及的細(xì)胞檢測裝置包括：試樣制備部件，混合細(xì)胞、含染色細(xì)胞中核酸的第一熒光色素的核酸染色用試劑、含有與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)雜交的且含第二熒光色素的評價(jià)用探針的試劑、以及含有與細(xì)胞中dna的檢測對象區(qū)雜交的且含第三熒光色素的檢測用探針的試劑，以此制備試樣；流動室，供試樣流動；光源，用光照射在流動室流動的試樣；受光部件，接收來自第一熒光色素的熒光、來自第二熒光色素的熒光、以及來自第三熒光色素的熒光；處理部件。第一熒光色素是發(fā)出第一波長熒光的色素，第二熒光色素是發(fā)出不同于第一波長的第二波長熒光的色素，第三熒光色素是發(fā)出不同于第一和第二波長的第三波長的熒光的色素。處理部件根據(jù)來自第一熒光色素的熒光的強(qiáng)度和來自第二熒光色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞，并根據(jù)來自第三熒光色素的熒光從分析對象細(xì)胞中檢測出異常細(xì)胞。

發(fā)明效果

通過本發(fā)明能夠精確地檢測出異常細(xì)胞。

附圖說明

圖1為實(shí)施方式1涉及的細(xì)胞檢測方法的流程圖；

圖2（a）為實(shí)施方式1涉及的檢測用探針結(jié)合于檢測對象區(qū)的狀態(tài)圖；圖2（b）為實(shí)施方式1涉及的評價(jià)用探針結(jié)合于評價(jià)對象區(qū)的狀態(tài)圖；

圖3（a）為實(shí)施方式1的變更例涉及的從圖像的各像素獲取亮度值的說明圖；圖3（b）為實(shí)施方式1的變更例涉及的從亮度值獲取圖像的亮度的說明圖；

圖4（a）為實(shí)施方式1涉及的用于選擇分析對象細(xì)胞的散點(diǎn)圖和區(qū)域的示圖；圖4（b）為實(shí)施方式1涉及的用于計(jì)算中值的直方圖；

圖5（a）、（b）為實(shí)施方式1涉及的用于選擇分析對象細(xì)胞的區(qū)域的變更例；

圖6為實(shí)施方式1涉及的從用于選擇分析對象細(xì)胞的散點(diǎn)圖的三個(gè)不同區(qū)域中的細(xì)胞獲取的明視野圖像和熒光圖像的例示圖；

圖7（a）~（f）為實(shí)施方式1的驗(yàn)證中為除去不需要的粒子而繪制的散點(diǎn)圖和區(qū)域的示圖；

圖8（a）~（f）為實(shí)施方式1涉及的驗(yàn)證中繪制的散點(diǎn)圖和在散點(diǎn)圖中設(shè)定的用于篩選分析對象細(xì)胞的區(qū)域的示圖；

圖9（a）、（b）為實(shí)施方式1涉及的驗(yàn)證中用于選擇分析對象細(xì)胞的散點(diǎn)圖和區(qū)域的示圖；

圖10為實(shí)施方式1和比較例涉及的驗(yàn)證結(jié)果的示圖；

圖11（a）、（b）為實(shí)施方式2涉及的基于雙融合判斷易位時(shí)熒光標(biāo)記一例的示意圖；圖11（c）、（d）為實(shí)施方式2涉及的基于雙融合判斷易位時(shí)合并的熒光圖像一例的示意圖；

圖12（a）、（b）為實(shí)施方式2涉及的基于斷裂判斷易位時(shí)熒光標(biāo)記的一例的示意圖；圖12（c）、（d）為實(shí)施方式2涉及的基于斷裂判斷易位時(shí)合并的熒光圖像一例的示意圖；

圖13為實(shí)施方式1~4涉及的判斷各種基因組異常并檢測出異常細(xì)胞的說明圖；

圖14為實(shí)施方式5涉及的細(xì)胞檢測裝置的結(jié)構(gòu)框圖；

圖15為實(shí)施方式5涉及的光學(xué)檢測部件的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖16為實(shí)施方式5涉及的細(xì)胞分析裝置進(jìn)行的異常細(xì)胞檢測處理的流程圖；

圖17為實(shí)施方式5涉及的用于接受通過肉眼觀察來分類圖像所得到的結(jié)果的肉眼觀察結(jié)果輸入界面的結(jié)構(gòu)圖；

圖18為實(shí)施方式6涉及的細(xì)胞選擇裝置的結(jié)構(gòu)框圖；

圖19為實(shí)施方式6涉及的粒子甄別部件、存放部件和流動室的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖20為實(shí)施方式6涉及的細(xì)胞選擇裝置進(jìn)行分析對象細(xì)胞選擇處理的流程圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供的選擇方法將標(biāo)記探針的染色性差的細(xì)胞和產(chǎn)生了標(biāo)記探針的非特異性結(jié)合的細(xì)胞從分析對象中排除，選擇標(biāo)記探針恰當(dāng)?shù)嘏c檢測對象dna序列區(qū)雜交的細(xì)胞作為分析對象。本發(fā)明還提供一種從所選擇的細(xì)胞檢測出出現(xiàn)了基因組異常的異常細(xì)胞的檢測方法。

在此，在本說明書中，“基因組異?！敝赋霈F(xiàn)了與野生型dna序列不同的序列，包括如基因擴(kuò)增、缺失、倒位、易位等情況。

“基因擴(kuò)增”指基因組中特定的基因擴(kuò)增，“缺失”是染色體的一部分，如長臂或短臂等缺失，“易位”指染色體的一部分?jǐn)嚅_，并附著、融合于其他染色體，“倒位”指染色體上的dna的堿基序列的順序部分顛倒。

“基因”不區(qū)分功能區(qū)，例如包括表達(dá)調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)、外顯子或內(nèi)含子。因此，“基因”這一用語除了編碼區(qū)外還包括啟動子、增強(qiáng)子和終止信號等的調(diào)控序列?；虻恼{(diào)控序列也可以位于編碼區(qū)的近側(cè)、同區(qū)內(nèi)或同區(qū)的遠(yuǎn)側(cè)。

“異常細(xì)胞”指出現(xiàn)了基因擴(kuò)增、缺失、倒位和易位中的至少一種的基因組異常的細(xì)胞，“正常細(xì)胞”指未出現(xiàn)基因擴(kuò)增、缺失、倒位和易位中的任何一種情況的細(xì)胞。

“檢測用探針”包括與細(xì)胞中dna的檢測對象區(qū)的堿基序列互補(bǔ)的多核苷酸、以及標(biāo)記多核苷酸的熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)可以直接與多核苷酸結(jié)合，也可以間接與其結(jié)合。在此，所謂間接結(jié)合指熒光物質(zhì)通過抗體等其他物質(zhì)（以下稱中介物）與多核苷酸結(jié)合。中介物可以使用半抗原、抗半抗原抗體等，比如可以使用與多核苷酸結(jié)合的半抗原、抗半抗原第一抗體、與第一抗體結(jié)合的標(biāo)記第二抗體。也可以不用第二抗體而用標(biāo)記后的抗半抗原第一抗體。使用中介物時(shí)，在本說明書中將多核苷酸、中介物和熒光物質(zhì)的復(fù)合物統(tǒng)稱為“檢測用探針”。半抗原可列舉出生物素、脫硫生物素及其他衍生物、二硝基苯酚（dnp）、地高（dig）等?？拱肟乖谝豢贵w比如可以使用抗dnp抗體、抗dig抗體。與生物素結(jié)合的捕獲劑可以是親和素、鏈霉親和素（streptavidin）或抗體。抗體可以用作其他半抗原的捕獲劑。第二抗體只要能與第一抗體結(jié)合即可，比如可以是來自山羊的抗兔抗體、來自山羊的抗鼠抗體。

“評價(jià)用探針”包括與細(xì)胞中dna的評價(jià)對象區(qū)的堿基序列互補(bǔ)的多核苷酸、標(biāo)記多核苷酸的熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)可以直接與多核苷酸結(jié)合，也可以間接與其結(jié)合。在此，間接結(jié)合的含義同上所述。使用中介物時(shí)，在本說明書中將多核苷酸、中介物、熒光物質(zhì)的復(fù)合物統(tǒng)稱為“評價(jià)用探針”。半抗原、抗半抗原第一抗體、第二抗體同上所述。

檢測用探針包括中介物時(shí)，中介物必須是與檢測用探針的多核苷酸特異性結(jié)合，且實(shí)質(zhì)上不與評價(jià)用探針的多核苷酸結(jié)合的物質(zhì)。同樣，評價(jià)用探針包括中介物時(shí)，該中介物必須是與評價(jià)用探針的多核苷酸特異性結(jié)合，且實(shí)質(zhì)上不與檢測用探針的多核苷酸結(jié)合的物質(zhì)。

此外，檢測用探針和評價(jià)用探針分別包括與半抗原特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體時(shí)，在檢測用探針和評價(jià)用探針之間，與多核苷酸結(jié)合的半抗原必須是不同物質(zhì)，比如將dnp用作與檢測用探針的多核苷酸結(jié)合的半抗原時(shí)，需要用dig作為與評價(jià)用探針的多核苷酸結(jié)合的半抗原。

此外，檢測用探針和評價(jià)用探針分別包括與第一抗體結(jié)合的標(biāo)記第二抗體時(shí)，檢測用探針中所包括的標(biāo)記第二抗體必須是與檢測用探針用第一抗體特異性結(jié)合，且實(shí)質(zhì)上不與評價(jià)用探針用第一抗體結(jié)合的物質(zhì)。同樣，評價(jià)用探針中所包括的標(biāo)記第二抗體必須是與評價(jià)用探針用第一抗體特異性結(jié)合，且實(shí)質(zhì)上不與檢測用探針用第一抗體結(jié)合的物質(zhì)。比如，可以用不同種類的動物制作檢測用探針用的第一抗體和評價(jià)用探針用的第一抗體，并將針對該特定種類的動物的抗體的抗體用作第二抗體。比如可以用鼠抗體作為檢測用探針用第一抗體，將抗鼠抗體作為第二抗體，將兔抗體作為評價(jià)用探針用第一抗體，將抗兔抗體作為第二抗體。使用標(biāo)記第二抗體時(shí)，最好在檢測用探針與評價(jià)用探針之間使與多核苷酸結(jié)合的半抗原和第一抗體的結(jié)合方式不同。

檢測用探針和評價(jià)用探針中所包括的熒光物質(zhì)分別使用發(fā)出不同波長熒光的熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)如有熒光素（fluorescein）、或其衍生物（如異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate）（fitc））、藻紅蛋白（phycoerythrin）（pe）、texasred（注冊商標(biāo)）（tr）、cy染料（cydye）、羅丹明（rhodamine）、alexa色素（alexafluor（注冊商標(biāo)））等。

“抗體”包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體和含有抗體的抗原結(jié)合部分及非抗體蛋白質(zhì)的融合蛋白，其包括任意的同種型（isotype）抗體或免疫球蛋白（immunoglobulin）、能保持與抗原特異性結(jié)合的抗體片段?！翱贵w”還可以與其他部分結(jié)合，例如與生物素（生物素-親和素特異性結(jié)合體的成員）等特定結(jié)合體的成員結(jié)合?！翱贵w”中還包括fab’、fv、f(ab’)2、以及能保持與抗原特異性結(jié)合的其他抗體片段。

“多核苷酸”和“核酸”在本說明書通篇可互換使用，其包括dna分子（如cdna或基因組dna）、rna分子（如mrna）、使用核苷酸類似物（如肽核酸和非天然核苷酸類似物）生成的dna或rna的類似物、以及上述物質(zhì)的雜合體。核酸分子可以是單鏈或雙鏈。

“雜交”（hybridization或hybridize）指在互補(bǔ)性核苷（nucleoside）堿基間或互補(bǔ)性核苷酸堿基間形成氫鍵(可以是watson-crick氫鍵、hoogsteen氫鍵或逆向hoogsteen氫鍵)。比如，腺嘌呤（adenine）和胸腺嘧啶（thymine）是通過氫鍵的形成而配對的互補(bǔ)核酸堿基。“互補(bǔ)”在本說明書中使用時(shí)，指二個(gè)核苷酸間正確配對的能力。比如，當(dāng)多核苷酸的特定位置的核苷酸能夠在dna分子的相同位置與核苷酸進(jìn)行氫鍵結(jié)合時(shí)，可以認(rèn)為此多核苷酸與dna在該位置是互補(bǔ)的。此多核苷酸與此dna中，各分子中足夠數(shù)目的相對應(yīng)位置被能夠相互進(jìn)行氫鍵結(jié)合的核苷酸所占據(jù)時(shí)，兩者就是互補(bǔ)的。因此，“特異性雜交”和“互補(bǔ)”這些用語用于表示能夠在此多核苷酸與此dna目標(biāo)之間產(chǎn)生穩(wěn)定且特異性的鍵合的、足夠的互補(bǔ)性或正確的配對。

如果多核苷酸在嚴(yán)格（stringent）條件下能與檢測對象區(qū)或評價(jià)對象區(qū)的堿基序列雜交的話就是“互補(bǔ)的”。

“嚴(yán)格條件”指多核苷酸有選擇地與特定核酸序列雜交，且?guī)缀趸蛲耆慌c其他序列雜交的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇。比如，可以參照《molecularcloning,alaboratorymannual》（《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》）第二版中的[j.sambrook?coldspringharborlaboratorypress,1989]（[j.薩姆布魯克等人，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,1989年發(fā)行）上所記述的關(guān)于短鏈核苷酸雜交的條件等來設(shè)定“嚴(yán)格條件”。該“嚴(yán)格條件”例如可列舉出下述條件：在含有30~70質(zhì)量%甲酰胺（formamide）的ph7.4的溶液中，在44℃環(huán)境下進(jìn)行雜交后，用2×ssc(1×ssc的組成：0.15m氯化鈉、0.015m檸檬酸鈉（sodiumcitrate），ph7.0)在60℃以上條件下進(jìn)行清洗等條件。但本發(fā)明不僅限于這一例示。

“檢測對象區(qū)”指細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中要檢測有無基因擴(kuò)增、缺失、易位和倒位中的某種異常的dna序列區(qū)。

“評價(jià)對象區(qū)”是細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中，與細(xì)胞周期s期的dna復(fù)制一起增加，且不會發(fā)生起因于基因組異常的擴(kuò)增和序列變化的dna序列區(qū)。要檢測出現(xiàn)了基因擴(kuò)增的異常細(xì)胞時(shí)，評價(jià)對象區(qū)只要如下選擇即可：細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中，除產(chǎn)生擴(kuò)增的dna序列區(qū)的dna序列區(qū)的一部分。比如，要檢測出出現(xiàn)了her2基因擴(kuò)增的異常細(xì)胞時(shí)，只要將除her2基因的dna序列區(qū)的一部分作為評價(jià)對象區(qū)即可，比如，可以將17號染色體的著絲粒(centromere)區(qū)作為評價(jià)對象區(qū)。要檢測出出現(xiàn)了缺失的異常細(xì)胞時(shí)，只要將細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中除出現(xiàn)缺失的dna序列區(qū)的dna序列區(qū)中的一部分作為評價(jià)對象區(qū)即可。要檢測出出現(xiàn)了易位的異常細(xì)胞時(shí)，評價(jià)對象區(qū)可以是基因組上的任何區(qū)域?？梢詫⒁蛞孜欢D(zhuǎn)移到其他染色體的dna序列區(qū)作為評價(jià)對象區(qū)，也可以將包括易位造成的斷裂點(diǎn)在內(nèi)的dna序列區(qū)作為評價(jià)對象區(qū)。比如，9號染色體中的abl基因因易位而轉(zhuǎn)移到22號染色體并與22號染色體上的bcr基因融合而生成了bcr-abl融合基因，要檢測出出現(xiàn)了上述bcr-abl融合基因的異常細(xì)胞時(shí)，可以將bcr基因或abl基因作為評價(jià)對象區(qū)。要檢測出出現(xiàn)了倒位的異常細(xì)胞時(shí)，評價(jià)對象區(qū)可以是基因組上的任何區(qū)域。可以將因倒位而轉(zhuǎn)移的dna序列區(qū)作為評價(jià)對象區(qū)，也可以將包括倒位所造成的斷裂點(diǎn)在內(nèi)的dna序列區(qū)作為評價(jià)對象區(qū)。

“核酸染色用色素”是染色細(xì)胞中全體核酸的物質(zhì)，其發(fā)出的熒光波長不同于與dna特定區(qū)域雜交并進(jìn)行熒光標(biāo)記的檢測用探針的熒光物質(zhì)和評價(jià)用探針的熒光物質(zhì)。核酸染色用色素包括用于對核酸特異性染色的嵌入劑（intercalator）和結(jié)合于小溝(minorgroove)的熒光色素。上述嵌入劑可舉出花青類、吖啶（acridine）類和菲啶（phenanthridium）類的眾所周知的色素。比如，花青類的嵌入劑有sybr（注冊商標(biāo)）greeni、噻唑橙（thiazoleorange）。吖啶（acridine）類嵌入劑有吖啶橙（acridinorange）。菲啶（phenanthridium）類嵌入劑有碘化丙啶（propidiumiodide）、溴化乙錠（ethidiumbromide）。結(jié)合于小溝的色素如有dapi、赫斯特（hoechst）等眾所周知的色素。比如，赫斯特（hoechst）可列舉出赫斯特（hoechst）33342、赫斯特（hoechst）33258等。

“細(xì)胞”可以是天然存在的細(xì)胞，也可以是人工改造的細(xì)胞（如融合細(xì)胞、ips細(xì)胞）。細(xì)胞可以是體細(xì)胞也可以是生殖細(xì)胞。這類細(xì)胞包括但不限于：胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell）、成體干細(xì)胞(somaticstemcell)、分化（differentiation）細(xì)胞（如表皮細(xì)胞、胰實(shí)質(zhì)細(xì)胞、胰管細(xì)胞、肝細(xì)胞、血細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、色素細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等）等。動物物種的細(xì)胞以使用脊椎動物的細(xì)胞為宜，使用哺乳動物的細(xì)胞更好。使用靈長類（如黑猩猩、日本猴、人）的細(xì)胞則更佳。最好的是使用人的細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞時(shí)，最好將細(xì)胞塊分散成分散狀的細(xì)胞后進(jìn)行檢測。此外，使檢測用探針和評價(jià)用探針與dna的特定區(qū)域雜交前，最好用甲醇、乙醇等極性有機(jī)溶劑固定細(xì)胞。

“試樣”指的是：包括細(xì)胞的、檢測用探針和評價(jià)用探針與細(xì)胞中的dna雜交且細(xì)胞中全體核酸被染色的樣本。

在試樣制備步驟中，用核酸染色用色素對核酸染色，并讓評價(jià)用探針與基因組雜交，由此制備試樣。

核酸染色和評價(jià)用探針雜交前，最好先固定細(xì)胞以防止核酸降解等。固定細(xì)胞可以使用乙醇、甲醇、甲醛等眾所周知的固定液。

讓評價(jià)用探針與基因組dna雜交前，最好先通過加熱或利用表面活性劑的化學(xué)處理等眾所周知的方法使基因組dna變性并成為單鏈狀態(tài)。同時(shí)使用評價(jià)用探針和檢測用探針二者（以下有時(shí)統(tǒng)稱為“探針”）時(shí)也一樣。

探針雜交后，也可以通過清洗除去與dna非特異性雜交了的檢測用探針和評價(jià)用探針?？梢杂名}濃度低的溶液清洗探針。

探針包括標(biāo)記抗體時(shí)，在使抗體反應(yīng)前也可以先進(jìn)行封閉處理，以降低背景。封閉劑可以使用bsa、脫脂乳等。也可以在進(jìn)行了標(biāo)記抗體的反應(yīng)后，進(jìn)行b/f分離處理，b/f分離處理是指分離與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合了的標(biāo)記抗體以及未與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合并處于游離狀態(tài)的標(biāo)記抗體的處理，然后除去游離的標(biāo)記抗體。例如可以通過離心處理來進(jìn)行b/f分離處理。

探針包括第一抗體和標(biāo)記第二抗體時(shí)，可以在第一抗體與探針的多核苷酸的反應(yīng)中實(shí)施上述封閉處理和/或b/f分離處理。此外，在使標(biāo)記第二抗體反應(yīng)時(shí)也可以進(jìn)行上述封閉處理和/或b/f分離處理。

核酸染色和評價(jià)用探針的雜交可以同時(shí)進(jìn)行，也可以分別進(jìn)行。同時(shí)進(jìn)行時(shí)，可以通過使核酸染色用色素和含評價(jià)用探針的染色試劑與細(xì)胞混合來實(shí)現(xiàn)。評價(jià)用探針包括多核苷酸和抗體時(shí)，核酸染色可以與多核苷酸和基因組dna的雜交同時(shí)進(jìn)行，也可以與抗體反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。核酸染色和評價(jià)用探針的雜交分別進(jìn)行時(shí)，其順序無特別限定。

在受光步驟中，對制備的試樣照射激發(fā)光，并獲取所產(chǎn)生的熒光的信息。獲取染色細(xì)胞中的核酸的核酸染色色素在激發(fā)光的照射下所產(chǎn)生的熒光、以及評價(jià)用探針的熒光色素在激發(fā)光的照射下產(chǎn)生的熒光的信息。

在選擇步驟中，根據(jù)來自核酸染色用色素和評價(jià)用探針的熒光色素的熒光信息選擇分析對象細(xì)胞。

以檢測出有基因組異常的細(xì)胞為目的時(shí)，分析對象細(xì)胞可以選擇來自核酸染色用色素的熒光強(qiáng)度和來自評價(jià)用探針的熒光色素的熒光強(qiáng)度的比率在一定范圍內(nèi)的細(xì)胞。比如，可以選擇來自核酸染色用色素的熒光強(qiáng)度和來自評價(jià)用探針的熒光色素的熒光強(qiáng)度的比率在一定數(shù)值范圍內(nèi)的細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞。此外，也可以在以從試樣中各細(xì)胞獲得的上述比率為軸的直方圖數(shù)據(jù)中，確定其中值的比率，并選擇相對于所確定的中值的比率來說有一定幅度的范圍內(nèi)的細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞。

選擇分析對象細(xì)胞時(shí)，例如可以從測定試樣中各細(xì)胞所獲得的測定數(shù)據(jù)中只提取分析對象細(xì)胞的測定數(shù)據(jù)，也可以通過物理手段從試樣中所有細(xì)胞中只將分析對象細(xì)胞與其他細(xì)胞分離開來并將其回收。物理手段比如可以是：通過熱來產(chǎn)生氣泡，讓氣泡撞擊在流路流動的細(xì)胞，以此將其與其他細(xì)胞分離開來；物理手段還可以是：通過開關(guān)二條流路中的其中一者，改變在流路流動的液體的方向，只讓所需要的細(xì)胞流入其中一流路并將其收集起來。

根據(jù)從與所選擇的細(xì)胞中的dna結(jié)合的檢測用探針的熒光物質(zhì)獲得的熒光強(qiáng)度就能檢測出基因組異常。比如，可以算出來自檢測用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度和來自評價(jià)用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度之比，并由此檢測出基因組異常。例如，也可以檢測出來自檢測用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度除以來自評價(jià)用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度所得到的值超過閾值的細(xì)胞作為出現(xiàn)了基因組異常的細(xì)胞。還可以算出來自檢測用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度和來自評價(jià)用探針的熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度之差，檢測出差超過閾值的細(xì)胞作為出現(xiàn)了基因組異常的細(xì)胞。

（實(shí)施方式1）

實(shí)施方式1中，將本發(fā)明用在了基于fish法將僅細(xì)胞中特定dna序列區(qū)出現(xiàn)了擴(kuò)增的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來的方法中。實(shí)施方式1中將her2基因擴(kuò)增并癌變的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。

如圖1所示，用于檢測出異常細(xì)胞的細(xì)胞檢測方法包括試樣制備步驟、受光步驟、選擇步驟和檢測步驟。以下說明操作人員用流式細(xì)胞儀和能夠分析流式細(xì)胞儀獲取的熒光的強(qiáng)度的處理裝置實(shí)現(xiàn)圖1所示細(xì)胞檢測方法的情況進(jìn)行說明。

在步驟s11的試樣制備步驟中，操作人員進(jìn)行檢測用探針與細(xì)胞核中dna的檢測對象區(qū)的雜交、評價(jià)用探針與細(xì)胞核中dna的評價(jià)對象區(qū)的雜交、以及細(xì)胞中核酸的染色，以此制備試樣。試樣包括采自受檢者的細(xì)胞。

在實(shí)施方式1中，檢測對象區(qū)是her2基因，評價(jià)對象區(qū)是17號染色體中除her2基因的dna序列區(qū)的部分序列。以下稱17號染色體中除her2基因的dna序列區(qū)的部分序列為“ch17”。評價(jià)對象區(qū)只要是細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中與細(xì)胞周期s期的dna復(fù)制一起增加、且不會出現(xiàn)起因于基因組異常的擴(kuò)增和序列變化的dna序列區(qū)即可。比如，評價(jià)對象區(qū)只要是細(xì)胞核中dna序列區(qū)中的、除發(fā)生擴(kuò)增的dna序列區(qū)的區(qū)域即可。由此觀點(diǎn)出發(fā)，評價(jià)對象區(qū)例如可以列舉出17號染色體的著絲粒區(qū)。

如圖2（a）所示，檢測用探針包括與作為檢測對象區(qū)的her2基因特異性結(jié)合的多核苷酸（her2dna探針）、第一抗體（兔抗-dnp抗體）、第二抗體（山羊抗-兔抗體）、熒光色素（alexafluor（注冊商標(biāo)）647）。多核苷酸用二硝基苯酚（dnp）標(biāo)記。通過步驟s11的試樣制備步驟，多核苷酸與檢測對象區(qū)結(jié)合，熒光色素通過第一抗體和第二抗體結(jié)合到多核苷酸。如圖2（b）所示，評價(jià)用探針包括與作為評價(jià)對象區(qū)的ch17特異性結(jié)合的多核苷酸（ch17dna探針）、第一抗體（鼠抗-dig抗體）、第二抗體（山羊抗-鼠抗體）、熒光色素（alexafluor（注冊商標(biāo)）488）。多核苷酸由地高辛（dig）標(biāo)記。通過步驟s11的試樣制備步驟，多核苷酸與評價(jià)對象區(qū)結(jié)合，熒光色素通過第一抗體和第二抗體結(jié)合到多核苷酸。此外，通過步驟s11的試樣制備步驟，細(xì)胞核被特異性染色核酸的核酸染色用色素，具體而言，被與dna的at序列的小溝結(jié)合的熒光色素（hoechst33342）染色。細(xì)胞核中的全體核酸通過此色素得到染色。

檢測用探針中所含有的熒光色素、評價(jià)用探針中所含有的熒光色素、以及染色細(xì)胞核中全體核酸的熒光色素使用的是當(dāng)分別照射一定波長的光時(shí)產(chǎn)生互不相同的波長的熒光的不同種類的熒光色素。

返回圖1，在步驟s12的受光步驟中，操作人員使用流式細(xì)胞儀，讓在步驟s11制備的試樣流入流動室，用光照射流經(jīng)流動室的試樣，通過受光部件接收來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒?、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒狻⒁约皝碜院怂崛旧蒙氐臒晒?。在步驟s12，也可以用熒光顯微鏡取代流式細(xì)胞儀。熒光顯微鏡例如可以使用蔡司（zeiss）公司制造的axioimager。此時(shí)，操作人員將試樣置于基材(如載玻片)上，并操作顯微鏡來用光照射基材上的試樣。此外，基材不限于載玻片，也可以是金屬或其他任意適當(dāng)?shù)墓腆w支撐體，比如也可以是硅片（siliconwafer）制作的基板。

在步驟s12，受光部件接收熒光，由此就各細(xì)胞生成來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度、來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度。在此所說的“熒光的強(qiáng)度”是受光部件輸出的熒光信號波形（橫軸為時(shí)間，縱軸為強(qiáng)度）中的峰值。熒光的強(qiáng)度不限于熒光信號波形的峰值，也可以是熒光信號波形的面積。如上所述，與檢測對象區(qū)結(jié)合的檢測用探針?biāo)械臒晒馍?、與評價(jià)對象區(qū)結(jié)合的評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍睾腿旧?xì)胞核中核酸的熒光色素在光的照射下會產(chǎn)生互不相同波長的熒光。因此，例如，只要用不同受光部件接收波長各異的三種熒光，就能識別出檢測對象區(qū)、評價(jià)對象區(qū)和細(xì)胞核整體。

也可以實(shí)施拍攝步驟和亮度獲取步驟并由此取代步驟s12的受光步驟。在拍攝步驟中，操作人員使用能夠拍攝粒子圖像的流式細(xì)胞儀，讓在步驟s11制備的試樣流入流動室，用光照射流經(jīng)流動室的試樣，并通過拍攝部件拍攝來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒狻碜栽u價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒?、來自核酸染色用色素的熒光。以此就各?xì)胞獲取來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膱D像、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾貓D像、來自核酸染色用色素的熒光的圖像。然后在亮度獲取步驟，操作人員用處理裝置算出各圖像中的亮度。

下面參照圖3（a）、（b）就圖像中亮度的計(jì)算進(jìn)行說明。如圖3（a）所示，在熒光圖像中，就每個(gè)像素分別獲取表示明暗的亮度值。如果拍攝的圖像為黑白的，例如可以將基于灰度（gradation）的值作為亮度值。當(dāng)所拍攝的圖像為彩色時(shí)，例如可以在轉(zhuǎn)換為黑白后再獲取亮度值。針對圖像上的所有像素獲取亮度值。

接著，如圖3（b）所示，例如基于圖像上全部像素的亮度值繪制以亮度值為橫軸、以像素?cái)?shù)為縱軸的直方圖。在此直方圖上，與像素?cái)?shù)相應(yīng)地生成用虛線表示的曲線，算出此曲線所圍起的范圍的面積作為圖像的亮度。另外，圖像的亮度也可以是全部像素亮度值的總和。操作人員用處理裝置進(jìn)行上述演算，在各圖像中算出亮度。如此算出的圖像的亮度與通過受光部件接收熒光而生成的熒光的強(qiáng)度相對應(yīng)。因此，可以將以下處理中使用的熒光的強(qiáng)度置換為熒光圖像中的亮度。

接下來，在步驟s13的選擇步驟，處理裝置根據(jù)來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞。更詳細(xì)地說，在步驟s13，處理裝置將下述細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞：來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度之間存在著將評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)的雜交狀態(tài)評價(jià)為恰當(dāng)雜交的關(guān)系的細(xì)胞。然后，處理裝置從通過測定試樣中的各細(xì)胞所獲得的測定數(shù)據(jù)中提取從分析對象細(xì)胞獲得的、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度數(shù)據(jù)和來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度數(shù)據(jù)。

如圖4（a）所示，在步驟s13，繪制以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度為縱軸，以來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度為橫軸的散點(diǎn)圖100。在散點(diǎn)圖100中與試樣所含有的各細(xì)胞相應(yīng)地標(biāo)繪出點(diǎn)。散點(diǎn)圖100中設(shè)定了區(qū)域101，關(guān)于該區(qū)域101，來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度之比率被評價(jià)為位于一定范圍。

區(qū)域101比如如下設(shè)定。就各細(xì)胞算出來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度的比率。根據(jù)就所有細(xì)胞分別算出的比率，如圖4（b）所示繪制以比率為橫軸、以粒子數(shù)為縱軸的直方圖。在繪制的直方圖中確定其中值的比率。然后，設(shè)定區(qū)域101，使該區(qū)域能夠圈起相對于所確定的中值的比率來說有一定幅度的范圍內(nèi)的粒子。

在散點(diǎn)圖100中設(shè)定的區(qū)域101不限于圖4（a）所示形狀，也可以是圖5（a）、（b）所示形狀。圖5（a）的區(qū)域101是以直線101a為中心并具有一定幅度的區(qū)域。直線101a的傾斜度是如上算出的中值的比率，直線101a通過原點(diǎn)。即直線101a可以被視為縱軸與橫軸的值存在正比例關(guān)系的直線。圖5（b）的區(qū)域101是由曲線圍起來的、以直線101a為中心并具有一定幅度的區(qū)域。設(shè)定如圖5（a）、（b）所示的以直線101a為中心的區(qū)域101的幅度時(shí)只要保證能精確地選擇出恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行了雜交的細(xì)胞即可，比如，通過設(shè)定使其包括以直線101a為中心偏離3~5%的范圍內(nèi)的細(xì)胞。

在此，檢測對象區(qū)和評價(jià)對象區(qū)中通過雜交使熒光標(biāo)記探針進(jìn)行結(jié)合，但細(xì)胞核整體的染色不同，其是用核酸染色用色素進(jìn)行的。相對于用核酸染色用色素對細(xì)胞核中的全體核酸進(jìn)行染色來說，如her2基因那樣局部擴(kuò)增的基因相對于全體核酸而言極其少，因此，從全體核酸染色用色素獲得的熒光的強(qiáng)度大致上會隨著細(xì)胞周期s期中dna的復(fù)制所伴隨的細(xì)胞核中核酸量的增加而變化。

而如上所述，評價(jià)對象區(qū)是細(xì)胞核中存在的dna序列區(qū)中不發(fā)生起因于基因組異常的擴(kuò)增和序列變化的dna序列區(qū)。評價(jià)對象區(qū)會與細(xì)胞周期s期中的dna的復(fù)制一起增加，所以如果在步驟s11的試樣制備步驟中評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)的雜交恰當(dāng)進(jìn)行的話，來自評價(jià)用探針中所含有的熒光色素的熒光的強(qiáng)度就會與來自全部核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度相應(yīng)地變化。因此，恰當(dāng)進(jìn)行了雜交的細(xì)胞會包含在區(qū)域101中，關(guān)于該區(qū)域101，可以認(rèn)為來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度與來自核酸染色用色素的熒光強(qiáng)度之比率在一定范圍內(nèi)。

然而，實(shí)際上并不一定在全部細(xì)胞中都能恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行雜交。當(dāng)有細(xì)胞未恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行雜交時(shí)，來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度并非僅與來自核酸染色用色素的熒光強(qiáng)度相應(yīng)地變化，其還會因雜交的狀態(tài)而變化。即，雜交未恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞會包含在區(qū)域101上下的區(qū)域102、103中。

區(qū)域101上面的區(qū)域102和區(qū)域101下面的區(qū)域103均包含可視為評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)的雜交未恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞。區(qū)域102是來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒廨^大的區(qū)域，因此，區(qū)域102中包含被認(rèn)為出現(xiàn)了評價(jià)用探針的非特異性結(jié)合的細(xì)胞。評價(jià)用探針的非特異性結(jié)合例如是因評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)以外的dna序列區(qū)結(jié)合而產(chǎn)生的。區(qū)域103是來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒廨^小的區(qū)域，所以區(qū)域103中包含被認(rèn)為評價(jià)用探針染色效率下降的細(xì)胞。評價(jià)用探針的染色效率下降比如因評價(jià)用探針雜交不良而產(chǎn)生。

在步驟s13的選擇步驟，根據(jù)點(diǎn)繪在散點(diǎn)圖100的試樣中的所有細(xì)胞，即根據(jù)本次試樣所含有的全部細(xì)胞設(shè)定區(qū)域101。然后，選擇區(qū)域101內(nèi)的細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞。或者，區(qū)域101也可以是根據(jù)以前的試樣預(yù)先設(shè)定并儲存在處理裝置中的區(qū)域。在預(yù)先設(shè)定區(qū)域101的情況下，可以在就一個(gè)細(xì)胞獲取到熒光強(qiáng)度時(shí)便將其點(diǎn)繪在散點(diǎn)圖上，如果此細(xì)胞包含在區(qū)域101的話，便將該細(xì)胞選為分析對象細(xì)胞。

在上述步驟s13的選擇步驟中，為便于說明，在處理裝置中繪制了散點(diǎn)圖100。但實(shí)際上選擇細(xì)胞時(shí)不會使用散點(diǎn)圖100，處理裝置會在以來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度和來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度為軸的假想的坐標(biāo)空間上進(jìn)行處理，并選擇分析對象細(xì)胞。在以下說明中也不使用散點(diǎn)圖，而是在以熒光強(qiáng)度為二條軸的假想的坐標(biāo)空間上進(jìn)行處理并由此選擇細(xì)胞。另外，如上所述，處理裝置也可以繪制散點(diǎn)圖并選擇細(xì)胞。

通過步驟s13的選擇步驟，僅將評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)的雜交得以恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞選擇出來。當(dāng)評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)的雜交恰當(dāng)進(jìn)行時(shí)，可以認(rèn)為檢測用探針與檢測對象區(qū)的雜交也得以恰當(dāng)進(jìn)行。因此，通過步驟s13的選擇步驟選擇的是評價(jià)用探針和檢測用探針的雜交都得以恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞。

參照圖6所示細(xì)胞的例示圖說明來自圖4（a）所示散點(diǎn)圖100的區(qū)域101~103的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

“明視野”表示細(xì)胞的明視野圖像?！癱h17”是對來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒狻⒓碿h17所對應(yīng)的熒光進(jìn)行拍攝所得到的圖像。“細(xì)胞核”是拍攝來自核酸染色用色素的熒光所得到的圖像。“her2”是拍攝來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒?、即her2基因所對應(yīng)的熒光而得到的圖像。橫向排列的四幅圖像是從一個(gè)細(xì)胞獲取的圖像。圖6所示五個(gè)細(xì)胞均為正常細(xì)胞，所以是her2基因沒有擴(kuò)增且存在雙鏈dna的細(xì)胞。因此，可以設(shè)想，不論在哪個(gè)細(xì)胞中，只要雜交得以恰當(dāng)進(jìn)行的話，就能判別出ch17所對應(yīng)的二個(gè)光點(diǎn)和her2基因所對應(yīng)的二個(gè)光點(diǎn)。

參照區(qū)域101的細(xì)胞圖像可知，ch17的光點(diǎn)和her2基因的光點(diǎn)都是清晰地存在二個(gè)。參照區(qū)域102的細(xì)胞圖像可知，ch17的光點(diǎn)和her2基因的光點(diǎn)由于細(xì)胞整體都發(fā)出熒光而難以判別。參照區(qū)域103的細(xì)胞圖像可知，ch17的光點(diǎn)和her2基因的光點(diǎn)由于熒光強(qiáng)度不充分而難以判別。

如此，區(qū)域102、103的細(xì)胞無法恰當(dāng)?shù)卦u價(jià)光點(diǎn)，所以在后述檢測步驟中就不能精確檢測出異常細(xì)胞。即，區(qū)域102、103的細(xì)胞有可能產(chǎn)生假陽性或假陰性。然而，通過實(shí)施方式1，在步驟s13的選擇步驟中能夠只選擇散點(diǎn)圖100的區(qū)域101內(nèi)所含有的細(xì)胞——即被認(rèn)為恰當(dāng)進(jìn)行了雜交的細(xì)胞來作為分析對象細(xì)胞。因此，所選擇的分析對象細(xì)胞中很難混入染色不良的細(xì)胞，因此在檢測步驟中能夠精確地檢測出異常細(xì)胞。

返回圖1，在步驟s14的檢測步驟中，操作人員使用處理裝置并根據(jù)來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴姆治鰧ο蠹?xì)胞中檢測出異常細(xì)胞。更具體而言，在步驟s14，處理裝置根據(jù)來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度與來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度之比從分析對象細(xì)胞檢測出異常細(xì)胞。具體而言，在各細(xì)胞中，用來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度除以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度，當(dāng)除法所得到的結(jié)果超過一定閾值時(shí)，判斷該細(xì)胞中檢測對象區(qū)擴(kuò)增。再將檢測對象區(qū)擴(kuò)增的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。也可以僅根據(jù)來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度超過一定閾值這一依據(jù)來判斷檢測對象區(qū)擴(kuò)增。

另外，當(dāng)通過拍攝部件來拍攝來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒夂蛠碜栽u價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獠@取圖像時(shí)，也可以根據(jù)圖像中來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植己蛠碜栽u價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植紒頇z測出異常細(xì)胞。比如，也可以用檢測用探針的光點(diǎn)數(shù)除以評價(jià)用探針的光點(diǎn)數(shù)，當(dāng)除法所得到的結(jié)果超過一定閾值時(shí)，將該細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。還可以當(dāng)檢測用探針的光點(diǎn)數(shù)與評價(jià)用探針的光點(diǎn)數(shù)的差超過一定閾值時(shí)將該細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。還可以用來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒庠趫D像上的總面積除以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒庠趫D像上的總面積，當(dāng)除法所得到的結(jié)果超過一定閾值時(shí)，將該細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。

在步驟s13的選擇步驟中，選擇被認(rèn)為雜交得以恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞，在步驟s14的檢測步驟中，針對所選擇的各細(xì)胞判斷其是否為異常細(xì)胞。如此，經(jīng)過選擇步驟之后再進(jìn)行檢測步驟，這樣，只針對雜交得以恰當(dāng)進(jìn)行的細(xì)胞來判斷其是否為異常細(xì)胞，因此能夠提高檢測步驟中異常細(xì)胞的檢測精度。

如上所述，在實(shí)施方式1中能夠精確地將her2基因擴(kuò)增并癌變的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。因此，對于her2基因隨著病情發(fā)展而擴(kuò)增的乳腺癌等疾病，醫(yī)生等能夠根據(jù)檢測出的異常細(xì)胞來精確地判斷病情。另外，her2基因是乳腺癌預(yù)后因子之一，因此，醫(yī)生等人能夠根據(jù)檢測出的異常細(xì)胞恰當(dāng)?shù)嘏袛噌槍颊叩闹委煼结槨Ｔ趯?shí)施方式1中將her2基因作為充當(dāng)治療方針判斷指標(biāo)的檢測對象區(qū)，但不限于此，也可以以其他疾病作為治療對象，并與對象疾病相應(yīng)地將其他基因作為治療方針的判斷指標(biāo)，即檢測對象區(qū)。

（實(shí)施方式1的驗(yàn)證）

下面就發(fā)明人針對實(shí)施方式1進(jìn)行的驗(yàn)證進(jìn)行說明。

1.制備試樣

使用her2基因擴(kuò)增陰性的mcf7作為對照細(xì)胞。異常細(xì)胞使用了her2基因擴(kuò)增陽性的sk-br-3。

（1）固定

將2×10⁶個(gè)mcf7裝入1.5ml的管中，將2×10⁶個(gè)sk-br-3裝入1.5ml的管中。在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm將各管離心分離1分鐘，除去上清。在各管中加入700μl的pbs，再次使內(nèi)容物懸浮。一邊輕輕攪拌，一邊向各管添加300μl卡諾氏溶液（carnoy'ssolution），獲得最終濃度為30%的卡諾氏溶液。卡諾氏溶液是一種甲醇與醋酸之比為3：1的溶液。在4℃環(huán)境下通過攪拌各管來防止內(nèi)容物沉降，直至經(jīng)過20分鐘。

在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對各管進(jìn)行離心分離1分鐘，除去上清。在各管中加入300μl的pbs，再次使內(nèi)容物懸浮。一邊輕輕攪拌，一邊向各管添加700μl卡諾氏溶液，得到最終濃度為70%的卡諾氏溶液。在4℃環(huán)境下通過攪拌各管來防止內(nèi)容物沉降，直至經(jīng)過20分鐘。

（2）雜交

混合288μlhybready（ventana公司制，#780-4409）和12μl的her2dna雞尾酒探針（ventana公司制，#109509），制備出雜交用試劑。her2dna雞尾酒探針包括二硝基苯酚（dnp）標(biāo)記的her2dna探針、以及地高辛（dig）標(biāo)記的ch17dna探針。ventana公司制的dig標(biāo)記的ch17dna探針與17號染色體中除her2基因的dna序列區(qū)的部分序列雜交。

在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm將（1）的各管離心分離1分鐘，除去上清。在各管中加入1ml反應(yīng)緩沖液（reactionbuffer，ventana公司制，#950-300）并進(jìn)行清洗。這種清洗進(jìn)行二次。在各管中加入雜交用試劑120μl，使內(nèi)容物充分懸浮。將各管的內(nèi)容物分裝入二支0.2ml的管。即，制作二支含有mcf7的管，制作二支含有sk-br-3的管。用熱循環(huán)儀在95℃環(huán)境下加熱各管5分鐘，將dna解離成單鏈。在44℃環(huán)境下進(jìn)行過夜（約16小時(shí)）雜交。

（3）清洗探針

預(yù)先用恒溫儀(heatblock)將2×ssc（ventana公司制，#650-012）加熱到65℃。在（2）的各管中添加100μl的2×ssc。在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm將各管離心分離1分鐘。離心分離后，除去各管的上清。在各管添加100μl的2×ssc，用熱循環(huán)儀在65℃環(huán)境下加熱各管3分鐘，在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對各管進(jìn)行1分鐘離心分離，除去上清，這一作業(yè)共進(jìn)行三次。在各管中加入100μl反應(yīng)緩沖液，使用內(nèi)容物再次懸浮。

（4）封閉

制備3ml的1%bsa/反應(yīng)緩沖液作為封閉試劑。在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對（3）的各管進(jìn)行1分鐘離心分離，除去上清。在各管中添加100μl封閉試劑，懸浮內(nèi)容物。在37℃環(huán)境下封閉20分鐘。

（5）第一抗體反應(yīng)

混合24μl兔抗dnpab和216μl鼠抗digab，制備第一抗體反應(yīng)試劑。在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對（4）的各管進(jìn)行1分鐘離心分離，去上清。為制備檢測用試樣，在所有管中的二支管中添加第一抗體反應(yīng)試劑80μl，使內(nèi)容物懸浮。為制備后述區(qū)域設(shè)定用試樣而在剩下的二支管中添加反應(yīng)緩沖液而非第一抗體反應(yīng)試劑，使內(nèi)容物懸浮。在37℃環(huán)境下進(jìn)行20分鐘第一抗體反應(yīng)。

（6）第二抗體·細(xì)胞核染色反應(yīng)

混合熒光標(biāo)記抗體——即1μl抗-鼠igg-alexa488（cellsignalingtechnology公司制#4408s）、熒光標(biāo)記抗體——即1μl抗-兔igg-alexa647（cellsignalingtechnology公司制#4414s）、1μl的hoechst33342（同仁化學(xué)研究所制，#346-07951）、以及1000μl封閉試劑，制備第二抗體·細(xì)胞核染色反應(yīng)試劑。在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對（5）的各管進(jìn)行1分鐘離心分離，去上清。在各管中添加第二抗體·細(xì)胞核染色反應(yīng)試劑100μl，使內(nèi)容物懸浮。在37℃環(huán)境下保持遮光狀態(tài)并進(jìn)行20分鐘第二抗體·細(xì)胞核染色反應(yīng)。

（7）測定用樣本的制備

在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對（6）的各管進(jìn)行1分鐘離心分離，去上清。在各管中添加100μl的tbst，在24℃室溫環(huán)境下以1500rpm對各管進(jìn)行1分鐘離心分離，去上清，該作業(yè)共進(jìn)行三次。在各管加入100μl封閉試劑，再次使內(nèi)容物懸浮。

2.用流式細(xì)胞儀測定

用amnis公司制的成像流式細(xì)胞儀（imagestream^xmarkiiimagingflowcytometer）測定經(jīng)過（1）~（7）的處理后的四支管內(nèi)的試樣。對流經(jīng)流式細(xì)胞儀的流動室的試樣照射波長為405nm、488nm、642nm、785nm的激光。然后接收來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光、來自核酸染色用色素的熒光所對應(yīng)的光、以及明視野所對應(yīng)的光，獲取各熒光的強(qiáng)度和圖像。

3.設(shè)定區(qū)域以除去不需要的粒子

使用在上述（5）的步驟中添加了取代第一抗體反應(yīng)試劑的反應(yīng)緩沖液的二支管來設(shè)定用于除去不需要的粒子的區(qū)域。這二支管中分別裝有含未進(jìn)行第一抗體反應(yīng)的對照細(xì)胞的試樣和含未進(jìn)行第一抗體反應(yīng)的異常細(xì)胞的試樣。

讓未進(jìn)行第一抗體反應(yīng)的試樣流入流動室，就試樣中所含有的各個(gè)粒子分別獲取明視野圖像、來自評價(jià)用探針?biāo)臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度、來自檢測用探針?biāo)臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度、來自核酸染色用色素的熒光所對應(yīng)的光的強(qiáng)度。根據(jù)含對照細(xì)胞的試樣和含異常細(xì)胞的試樣，如圖7（a）、（b）所示，繪制以明視野圖像中粒子的球度為縱軸，以明視野圖像中粒子的面積為橫軸的散點(diǎn)圖110。球度越接近1，粒子形狀就越接近正圓球。能夠成為分析對象的細(xì)胞球度接近1，并具有一定面積。因此，將散點(diǎn)圖110的區(qū)域111設(shè)定為能成為分析對象的細(xì)胞分布的區(qū)域。

然后，根據(jù)散點(diǎn)圖110的區(qū)域111中所包含的粒子，如圖7（c）、（d）所示，繪制以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度為縱軸，以來自核酸染色用色素的熒光所對應(yīng)的光的強(qiáng)度為橫軸的散點(diǎn)圖120。因?yàn)槲⑿×Ｗ拥拇蟛糠种话l(fā)出微弱熒光，所以將具有一定強(qiáng)度以上熒光的物質(zhì)集團(tuán)作為分析對象。因此，將散點(diǎn)圖120的區(qū)域121設(shè)定為能成為分析對象的細(xì)胞所分布的區(qū)域，將散點(diǎn)圖120的區(qū)域122設(shè)定為不能成為分析對象的微小粒子所分布的區(qū)域。

然后，根據(jù)散點(diǎn)圖120的區(qū)域121中所含有的粒子，如圖7（e）、（f）所示，繪制以來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度為縱軸，以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度為橫軸的散點(diǎn)圖130。未進(jìn)行第一抗體反應(yīng)的試樣中的細(xì)胞雖然會產(chǎn)生微量的自身熒光，但不會產(chǎn)生大于一定強(qiáng)度的熒光。因此，在散點(diǎn)圖130中將包含此試樣中幾乎所有細(xì)胞的區(qū)域132設(shè)定為未進(jìn)行第一抗體反應(yīng)的細(xì)胞所分布的區(qū)域。然后，在散點(diǎn)圖130，將縱軸和橫軸的值都大于區(qū)域132的區(qū)域131設(shè)定為能成為分析對象的細(xì)胞所分布的區(qū)域。

4.選擇分析對象細(xì)胞

用上述步驟（5）中添加了第一抗體反應(yīng)試劑的二支管選擇出分析對象細(xì)胞。這二支管中分別裝有含對照細(xì)胞的試樣和含異常細(xì)胞的試樣。讓試樣流入流動室，就試樣所含有的各個(gè)粒子分別獲取明視野圖像、來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光的強(qiáng)度、來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒馑鶎?yīng)的光強(qiáng)度、來自核酸染色用色素的熒光所對應(yīng)的光的強(qiáng)度。

然后，根據(jù)含對照細(xì)胞試樣和含異常細(xì)胞的試樣，如圖8（a）、（b）所示，繪制與圖7（a）、（b）相同的散點(diǎn)圖110。在此時(shí)的散點(diǎn)圖110上設(shè)定與圖7（a）、（b）相同的區(qū)域111。然后根據(jù)圖8（a）、（b）的區(qū)域111中所包含的粒子，如圖8（c）、（d）所示，繪制與圖7（c）、（d）相同的散點(diǎn)圖120。在此時(shí)的散點(diǎn)圖120上設(shè)定與圖7（c）、（d）相同的區(qū)域121。然后，根據(jù)圖8（c）、（d）的區(qū)域121中所包含的粒子，如圖8（e）、（f）所示，繪制與圖7（e）、（f）相同的散點(diǎn)圖130。在此時(shí)的散點(diǎn)圖130上設(shè)定與圖7（e）、（f）相同的區(qū)域131。

然后根據(jù)圖8（e）、（f）的區(qū)域131中所包含的粒子，如圖9（a）、（b）所示，繪制與圖4（a）相同的散點(diǎn)圖100。在此時(shí)的散點(diǎn)圖100上，如上文參照圖4（a）所作出的說明同樣地，設(shè)定可以認(rèn)為來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度之比率在一定范圍內(nèi)的區(qū)域101。然后，選擇圖9（a）、（b）的區(qū)域101所含有的粒子作為分析對象細(xì)胞。

如此，通過圖8（a）~（f）所示的分析對象細(xì)胞的篩選，除去不需要的粒子。因此，通過圖9（a）、（b）的區(qū)域101精確地選擇出了被認(rèn)為恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行了雜交的細(xì)胞。

5.基于分析對象細(xì)胞的靈敏度和特異度

就在上述4中最終選擇的各個(gè)分析對象細(xì)胞，獲取來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度除以來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度所得到的值。如圖10所示，將實(shí)施方式1獲取的除法運(yùn)算值分成對照細(xì)胞與異常細(xì)胞進(jìn)行點(diǎn)繪。

此外，在圖10上，將就比較例所選擇的各分析對象細(xì)胞所獲取的除法運(yùn)算值分成對照細(xì)胞與異常細(xì)胞來點(diǎn)繪出來。在比較例，上述4中不使用圖9（a）、（b）所示的散點(diǎn)圖100，以圖8（e）、（f）的區(qū)域131中所含有的粒子作為分析對象。即，比較例與實(shí)施方式1相比省略了選擇恰當(dāng)進(jìn)行了雜交的細(xì)胞這一步驟。

在實(shí)施方式1與比較例，如圖10中虛線所示，分別設(shè)定針對除法運(yùn)算值的閾值，以使得靈敏度和特異度最大化。靈敏度是因位于閾值上側(cè)而被判斷為異常的細(xì)胞數(shù)除以試樣中實(shí)際的異常細(xì)胞數(shù)所得到的。特異度是因位于閾值下側(cè)而被判斷為正常的細(xì)胞數(shù)除以試樣中對照細(xì)胞數(shù)所得到的值。在比較例中，靈敏度和特異度均為94.5%。在實(shí)施方式1中，靈敏度和特異度均為99.1%，結(jié)果好于比較例。另外，閾值也可以使用別的值。例如，可以用實(shí)施方式1中從各對照細(xì)胞獲得的除法運(yùn)算值的最大值作為閾值，也可以用實(shí)施方式1中從各異常細(xì)胞獲得的除法運(yùn)算值的最小值作為閾值。

如上所示，通過本驗(yàn)證得知，如實(shí)施方式1所述地用散點(diǎn)圖100的區(qū)域101來選擇恰當(dāng)進(jìn)行了雜交的細(xì)胞就能提高靈敏度和特異度。因此，通過實(shí)施方式1就能精確地檢測出異常細(xì)胞和正常細(xì)胞，因此能夠準(zhǔn)確監(jiān)視藥物治療的效果。

（實(shí)施方式2）

實(shí)施方式2中，將本發(fā)明應(yīng)用于基于fish法將出現(xiàn)了易位的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來的方法。關(guān)于檢測出出現(xiàn)了易位的異常細(xì)胞的方法，以慢性粒細(xì)胞白血病中會出現(xiàn)的9號染色體和22號染色體之間出現(xiàn)的易位為例進(jìn)行說明。

在正常細(xì)胞即易位陰性的細(xì)胞中，如圖11（a）所示，abl基因的序列在9號染色體，bcr基因的序列在22號染色體。以下稱bcr基因的序列為“bcr區(qū)域部分”，稱abl基因的序列為“abl區(qū)域部分”。出現(xiàn)易位，則abl區(qū)域部分轉(zhuǎn)移到22號染色體。以此，異常細(xì)胞即易位陽性的細(xì)胞中就如圖11（b）所示地出現(xiàn)bcr-abl融合基因。

因?yàn)闀霈F(xiàn)如此易位，所以，如圖11（a）、（b）所示，例如熒光標(biāo)記abl區(qū)域部分以產(chǎn)生紅色熒光，熒光標(biāo)記bcr區(qū)域部分以產(chǎn)生綠色熒光。于是，正常細(xì)胞的圖像成為圖11（c）所示狀態(tài)，異常細(xì)胞的圖像成為圖11（d）所示狀態(tài)。圖11（c）、（d）所示細(xì)胞圖像是合成基于細(xì)胞產(chǎn)生的紅色熒光的圖像和基于細(xì)胞產(chǎn)生的綠色熒光的圖像所得到的。在圖11（c）的情況下，紅色光點(diǎn)與綠色光點(diǎn)分離，所以可以知道細(xì)胞是正常細(xì)胞。而在圖11（d），由于所謂的雙融合（dualfusion）而出現(xiàn)了紅色光點(diǎn)與綠色光點(diǎn)重疊形成的黃色光點(diǎn)。以此，當(dāng)出現(xiàn)圖11（d）的情況下，可以知道細(xì)胞是出現(xiàn)了bcr-abl融合基因的異常細(xì)胞，醫(yī)生等能夠就慢性粒細(xì)胞白血病的可能性作出診斷。

此外，為了檢測出abl區(qū)域部分向22號染色體的易位，例如，還可以如圖12（a）、（b）所示，熒光標(biāo)記bcr區(qū)域部分和與bcr區(qū)域部分相鄰的核酸序列并使其分別產(chǎn)生綠色熒光。以下稱與bcr區(qū)域部分相鄰的核酸序列為“bcr相鄰區(qū)域部分”。如此，正常細(xì)胞的圖像成為圖12（c）所示狀態(tài)，異常細(xì)胞的圖像成為圖12（d）所示狀態(tài)。

如圖12（c）所示，細(xì)胞為正常細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞核中的dna為雙鏈，所以綠色光點(diǎn)與圖12（a）所示狀態(tài)相應(yīng)地為二個(gè)。而如圖12（d）所示，細(xì)胞為異常細(xì)胞時(shí)，染色體分離，即由于所謂的斷裂（breakapart），bcr相鄰區(qū)域部分從22號染色體斷開，轉(zhuǎn)移到9號染色體，綠色光點(diǎn)增加。另外，此時(shí)，9號染色體的abl區(qū)域部分轉(zhuǎn)移到22號染色體上的bcr相鄰區(qū)域部分曾經(jīng)所在的部位。以此得知，圖12（d）所示情況為異常細(xì)胞。此外，abl區(qū)域部分和與abl區(qū)域部分相鄰的核酸序列也可以被熒光標(biāo)記并產(chǎn)生綠色熒光。此時(shí)，與圖12（c）、（d）同樣地，可以檢測出由于斷裂產(chǎn)生的異常細(xì)胞。

在如上所述進(jìn)行雙融合和斷裂的判斷時(shí)，也進(jìn)行圖1步驟s11~s14的處理步驟，檢測出異常細(xì)胞。

基于雙融合進(jìn)行判斷時(shí)，如圖11（a）所示，基因序列被熒光標(biāo)記。此時(shí)，評價(jià)對象區(qū)是bcr區(qū)域部分或abl區(qū)域部分。當(dāng)評價(jià)對象區(qū)是bcr區(qū)域部分時(shí)，檢測對象區(qū)是abl區(qū)域部分，當(dāng)評價(jià)對象區(qū)是abl區(qū)域部分時(shí)，檢測對象區(qū)是bcr區(qū)域部分。即，檢測對象區(qū)和評價(jià)對象區(qū)的組合只要是bcr區(qū)域部分和abl區(qū)域部分即可。

此時(shí)也與實(shí)施方式1同樣地，在步驟s11的試樣制備步驟，通過雜交使評價(jià)用探針結(jié)合到評價(jià)對象區(qū)，檢測用探針結(jié)合到檢測對象區(qū)。因此，與實(shí)施方式1同樣地，通過步驟s11~s13，可以根據(jù)來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度選擇恰當(dāng)雜交的細(xì)胞。

在步驟s14的檢測步驟中，用來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膱D像和來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膱D像來判斷abl區(qū)域部分和bcr區(qū)域部分的分布。因此，在實(shí)施方式2中，在步驟s12的受光步驟獲取上述圖像。

在步驟s14，根據(jù)在步驟s12獲取的圖像中來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植己蛠碜栽u價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植迹ㄟ^處理裝置從分析對象細(xì)胞中檢測出異常細(xì)胞。具體而言，由于基于檢測用探針的光點(diǎn)位置與基于評價(jià)用探針的光點(diǎn)位置重合而如圖11（d）所示在合成圖像上產(chǎn)生了一定顏色的光點(diǎn)時(shí)，通過處理裝置判斷為出現(xiàn)了易位。然后，通過處理裝置將出現(xiàn)了易位的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。此外，也可以使顯示部件上顯示細(xì)胞的圖像，通過操作人員肉眼觀察，將基于檢測用探針的光點(diǎn)位置和基于評價(jià)用探針的光點(diǎn)位置較接近或重合的細(xì)胞判斷為出現(xiàn)了易位的異常細(xì)胞。

當(dāng)基于斷裂進(jìn)行判斷時(shí)，如圖12（a）所示，bcr區(qū)域部分和與bcr區(qū)域部分相鄰的核酸序列分別被熒光標(biāo)記。此時(shí)，評價(jià)對象區(qū)是bcr區(qū)域部分或bcr相鄰區(qū)域部分。當(dāng)評價(jià)對象區(qū)是bcr區(qū)域部分時(shí)，檢測對象區(qū)是bcr相鄰區(qū)域部分，當(dāng)評價(jià)對象區(qū)是bcr相鄰區(qū)域部分時(shí)，檢測對象區(qū)是bcr區(qū)域部分。即，檢測對象區(qū)和評價(jià)對象區(qū)的組合只要是bcr區(qū)域部分和bcr相鄰區(qū)域部分即可。另外，檢測對象區(qū)和評價(jià)對象區(qū)的組合也可以是abl區(qū)域部分、以及與abl區(qū)域部分相鄰的核酸序列。

此時(shí)也同樣地，在步驟s11的試樣制備步驟，通過雜交使評價(jià)用探針結(jié)合到評價(jià)對象區(qū)，使檢測用探針結(jié)合到檢測對象區(qū)。但此時(shí)的評價(jià)用探針和檢測用探針能夠與bcr區(qū)域部分和bcr相鄰區(qū)域部分雜交，因此實(shí)際上其結(jié)構(gòu)相同。然后，與上述雙融合的情況同樣地，通過步驟s11~s13，根據(jù)來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度選擇恰當(dāng)雜交的細(xì)胞。

在步驟s14，根據(jù)所獲取的圖像中來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植己蛠碜栽u價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾姆植?，通過處理裝置從分析對象細(xì)胞中檢測出異常細(xì)胞。如圖12（b）所示，當(dāng)檢測對象區(qū)或評價(jià)對象區(qū)轉(zhuǎn)移到其他染色體上時(shí)，可以認(rèn)為出現(xiàn)了易位。因此，如圖12（d）所示，當(dāng)基于檢測用探針和評價(jià)用探針的光點(diǎn)增加時(shí)，判斷為出現(xiàn)了易位。然后將出現(xiàn)了易位的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。此外，也可以使顯示部件上顯示細(xì)胞的圖像，通過操作人員的肉眼觀察檢測出出現(xiàn)了易位的細(xì)胞。

在實(shí)施方式2中，同樣地，針對被視為恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行了雜交的細(xì)胞來判斷是否為異常細(xì)胞。因此，與實(shí)施方式1同樣地，能夠提高異常細(xì)胞的檢測精度。另外，在實(shí)施方式2，能夠精確地檢測出9號染色體與22號染色體之間出現(xiàn)了易位的異常細(xì)胞，所以醫(yī)生等人能夠準(zhǔn)確判斷慢性粒細(xì)胞白血病的病情。

（實(shí)施方式3）

實(shí)施方式3中，將本發(fā)明用于基于fish法將出現(xiàn)了缺失的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來的方法中。

正常細(xì)胞即缺失陰性的細(xì)胞中，一定dna序列區(qū)位于一定的染色體，但異常細(xì)胞即缺失陽性的細(xì)胞中，一定dna序列區(qū)從染色體上消失。要檢測出缺失時(shí)，檢測對象區(qū)為缺失的dna序列區(qū)的至少一部分序列，評價(jià)對象區(qū)為除缺失的dna序列區(qū)的dna序列區(qū)的部分序列。以此，與實(shí)施方式1同樣地，能夠選擇出被視為恰當(dāng)雜交的細(xì)胞。此外，當(dāng)通過處理裝置判斷來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度在一定閾值以下時(shí)，能夠通過處理裝置檢測出出現(xiàn)了缺失的異常細(xì)胞。也可以使顯示部件上顯示圖像，通過操作人員的肉眼觀察檢測出出現(xiàn)了缺失的異常細(xì)胞。

（實(shí)施方式4）

在實(shí)施方式4中，將本發(fā)明用于基于fish法將染色體上出現(xiàn)了倒位的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來的方法中。

倒位的情況下，染色體上的dna堿基序列的順序部分顛倒。因此，例如，將與特定基因及其相鄰的dna序列區(qū)這兩種區(qū)域結(jié)合的探針混入試樣，如果檢測到來自該探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒?，即可判斷該?xì)胞是未出現(xiàn)倒位的正常細(xì)胞。如果檢測不到來自該探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒?，則認(rèn)為由于基因從染色體斷開并出現(xiàn)了顛倒而導(dǎo)致探針未能結(jié)合，由此就能將細(xì)胞判斷為出現(xiàn)了倒位的異常細(xì)胞。要檢測出倒位，檢測對象區(qū)為跨確定基因和與之相鄰的dna序列區(qū)的區(qū)域，評價(jià)對象區(qū)為出現(xiàn)倒位的該特定基因。

另外，如圖13所示，本發(fā)明適用于判斷各種基因組異常（基因擴(kuò)增、易位、缺失、倒位等）并檢測異常細(xì)胞的情況。

（實(shí)施方式5）

在實(shí)施方式5中，將本發(fā)明用于基于實(shí)施方式1的細(xì)胞檢測方法檢測出異常細(xì)胞的細(xì)胞檢測裝置中。

如圖14所示，細(xì)胞檢測裝置10包括處理部件11、試樣制備部件12、光學(xué)檢測部件13、信號處理部件14、顯示部件15和輸入部件16。

處理部件11由微型計(jì)算機(jī)和cpu等以及存儲部件11a構(gòu)成。存儲部件11a由ram、rom和硬盤等構(gòu)成。存儲部件11a存儲供處理部件11執(zhí)行的處理程序。處理部件11與細(xì)胞檢測裝置10各部分傳輸信號，并控制各部分。試樣制備部件12通過混合細(xì)胞和試劑來制備試樣。

如圖15所示，光學(xué)檢測部件13包括流動室200、光源211~214、受光部件221~223、拍攝部件224、聚光鏡231~239、分色鏡241~244、半透射鏡251、過濾器252和光學(xué)單元253。

光源211~214由半導(dǎo)體激光光源構(gòu)成。光源211~214射出的光分別是波長λ11~λ14的激光。例如，波長λ11~λ14分別是405nm、488nm、642nm、785nm。聚光鏡231~234分別聚集光源211~214射出的光。分色鏡241反射波長λ12的光，讓波長λ13的光透過。分色鏡242反射波長λ11的光，并讓波長λ12、λ13的光透過。于是，從光源211~214射出的波長λ11~λ14的光照射到流經(jīng)流動室200的流路201的試樣。

波長λ11~λ13的光照射到流經(jīng)流動室200的試樣，則染色了細(xì)胞的熒光色素會產(chǎn)生熒光。波長λ11的光照射到細(xì)胞核染色用色素上，則會產(chǎn)生波長λ21的熒光，波長λ12的光照射到評價(jià)用探針的熒光色素上，則會產(chǎn)生波長λ22的熒光，波長λ13的光照射到檢測用探針的熒光色素上，則會產(chǎn)生波長λ23的熒光。波長λ14的光照射到流經(jīng)流動室200的試樣上，此光會透過細(xì)胞。透過細(xì)胞的波長λ14的光用于生成明視野圖像。

聚光鏡235聚集流經(jīng)流動室200的試樣所產(chǎn)生的波長λ21~λ23的熒光以及透過流經(jīng)流動室200的試樣的波長λ14的光。半透射鏡251讓透過聚光鏡235的光中的大約一半透射，將約一半反射到過濾器252。

過濾器252使波長λ21~λ23的熒光透過，并阻斷不需要的光。分色鏡243反射波長λ21的熒光，并讓波長λ22、λ23的熒光透過。分色鏡244反射波長λ22的熒光，并讓波長λ23的熒光透過。聚光鏡236~238分別聚集波長λ21~λ23的熒光。受光部件221~223分別接收波長λ21~λ23的熒光，并輸出與所接收的熒光的強(qiáng)度相應(yīng)的信號。受光部件221~223由光電倍增管構(gòu)成。受光部件221~223由光電倍增管構(gòu)成，所以能夠以高靈敏度生成與熒光強(qiáng)度相應(yīng)的信號。

光學(xué)單元253具有4片分色鏡組合而成的結(jié)構(gòu)。光學(xué)單元253的4片分色鏡分別以略微不同的角度反射波長λ21~λ23的熒光和波長λ14的光，并在拍攝部件224的受光面上使其分離。聚光鏡239聚集波長λ21~λ23的熒光和波長λ14的光。拍攝部件224由tdi（timedelayintegration，時(shí)間延遲積分）相機(jī)構(gòu)成。拍攝部件224接收波長λ21~λ23的熒光和波長λ14的光，并將分別與波長λ21~λ23的熒光和波長λ14的光相應(yīng)的粒子的圖像信息作為拍攝信號輸出。

返回圖14，信號處理部件14由處理信號的復(fù)數(shù)條線路和存儲部件構(gòu)成。信息處理部件14根據(jù)從受光部件221~223輸出的信號就各個(gè)粒子分別計(jì)算出熒光強(qiáng)度。處理部件11將就各個(gè)粒子分別算出的熒光強(qiáng)度存儲在存儲部件11a。此外，處理部件11根據(jù)拍攝部件224所輸出的拍攝信號生成粒子圖像，將生成的圖像按照各個(gè)粒子分別存儲到存儲部件11a。顯示部件15由顯示器構(gòu)成，用于顯示異常細(xì)胞的檢測結(jié)果等。輸入部件16由鼠標(biāo)和鍵盤構(gòu)成。操作人員通過輸入部件16向細(xì)胞檢測裝置10輸入指示。

下面參照圖16就細(xì)胞檢測裝置10的異常細(xì)胞檢測處理進(jìn)行說明。通過處理部件11控制細(xì)胞檢測裝置10的各部分來進(jìn)行異常細(xì)胞檢測處理。

在步驟s101，處理部件11驅(qū)動試樣制備部件12，混合細(xì)胞、含與細(xì)胞中檢測對象區(qū)雜交的檢測用探針的試劑、含與細(xì)胞中評價(jià)對象區(qū)雜交的評價(jià)用探針的試劑、以及含細(xì)胞核染色用色素的試劑，以此制備試樣。以此，如圖2（a）、（b）所示，含有熒光色素的檢測用探針與檢測對象區(qū)結(jié)合，含有熒光色素的評價(jià)用探針與評價(jià)對象區(qū)結(jié)合。在步驟s102，處理部件11讓步驟s101制備的試樣流入流動室200。在步驟s103，處理部件11驅(qū)動光源211~214，向流經(jīng)流動室200的試樣照射光。在步驟s104，處理部件11通過受光部件221~223接收試樣中的粒子所產(chǎn)生的波長λ21~λ23的熒光，并獲取波長λ21~λ23的熒光的強(qiáng)度。

在步驟s105，處理部件11與實(shí)施方式1的步驟s13同樣地根據(jù)來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度選擇分析對象細(xì)胞。具體而言，處理部件11根據(jù)信號處理部件14算出的波長λ21、λ22的熒光的強(qiáng)度選擇散點(diǎn)圖100的區(qū)域101中的細(xì)胞作為分析對象細(xì)胞。此時(shí)，同樣地，處理部件11實(shí)際上不使用散點(diǎn)圖100，而是在以波長λ21、λ22的熒光的強(qiáng)度為二軸的假想坐標(biāo)空間上進(jìn)行處理，并選擇分析對象細(xì)胞。另外，此時(shí)也同樣地，如實(shí)施方式1的驗(yàn)證所示，最好除去不需要的粒子。

在步驟s106，處理部件11與實(shí)施方式1的步驟s14同樣地根據(jù)來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴姆治鰧ο蠹?xì)胞中檢測出異常細(xì)胞。具體而言，處理部件11使用的是信號處理部件14算出的波長λ22、λ23的熒光的強(qiáng)度。針對各分析對象細(xì)胞，處理部件11用波長λ23的熒光的強(qiáng)度除以波長λ22的熒光的強(qiáng)度，將除法運(yùn)算結(jié)果超過一定閾值的細(xì)胞作為檢測對象區(qū)擴(kuò)增的異常細(xì)胞檢測出來。在步驟s106，處理部件11也可以在從拍攝部件224的拍攝信號生成的圖像中獲取光點(diǎn)，并根據(jù)光點(diǎn)檢測出異常細(xì)胞。

在實(shí)施方式5也可以將出現(xiàn)了實(shí)施方式2~4所述的易位、缺失、倒位的細(xì)胞作為異常細(xì)胞檢測出來。關(guān)于易位，處理部件11根據(jù)從拍攝部件224的拍攝信號生成的圖像獲取熒光的分布，并根據(jù)熒光的分布檢測出出現(xiàn)了易位的異常細(xì)胞。關(guān)于缺失或倒位，處理部件11檢測出來自檢測用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒鈴?qiáng)度在一定閾值以下的細(xì)胞，并將其作為出現(xiàn)了缺失或倒位的異常細(xì)胞?；蛘哌€可以如下：處理部件11在從拍攝部件224的拍攝信號生成的圖像上獲取光點(diǎn)，將光點(diǎn)數(shù)比正常細(xì)胞少的細(xì)胞作為出現(xiàn)了缺失或倒位的異常細(xì)胞檢測出來。

處理部件11也可以在顯示部件15上顯示用于接受通過肉眼觀察獲得的圖像分類結(jié)果的肉眼觀察結(jié)果輸入界面300。

如圖17所示，肉眼觀察結(jié)果輸入界面300包括圖像顯示區(qū)310、按鈕321~324、結(jié)果顯示區(qū)330、保存按鈕340。處理部件11收到開始肉眼觀察輸入的指示后，在顯示部件15上顯示關(guān)于對象試樣的肉眼觀察結(jié)果輸入界面300。

圖像顯示區(qū)310顯示根據(jù)對象試樣獲取的、在步驟s105選擇的細(xì)胞圖像。圖像顯示區(qū)310內(nèi)的圖像能夠被選擇，圖像被選擇后，如圖像顯示區(qū)310內(nèi)左上角的圖像一樣地，圖像被雙重線圈起來。按鈕321~324用于接受圖像顯示區(qū)310內(nèi)所選擇的圖像的肉眼觀察結(jié)果。操作人員肉眼觀察所選擇的圖像，如果判斷在圖像所示細(xì)胞中出現(xiàn)了基因擴(kuò)增、易位導(dǎo)致的基因融合、易位造成的斷開、以及缺失，則分別通過輸入部件16按下按鈕321~324。以此，結(jié)果顯示區(qū)330內(nèi)的相應(yīng)項(xiàng)目的數(shù)值就會增加。

結(jié)果顯示區(qū)330分別顯示試樣所含有的所有細(xì)胞中出現(xiàn)了基因擴(kuò)增、融合、斷開和缺失的細(xì)胞的個(gè)數(shù)。即，結(jié)果顯示區(qū)330顯示操作人員通過按鈕321~324輸入的個(gè)數(shù)。按下保存按鈕340，則處理部件11將顯示在結(jié)果顯示區(qū)330的結(jié)果值存儲到存儲部件11a。如此，操作人員就能肉眼觀察圖像并輸入各個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)，將輸入的結(jié)果存儲到存儲部件11a。在肉眼觀察結(jié)果輸入界面300上只選擇并顯示染色狀態(tài)良好的細(xì)胞，所以，操作人員能夠觀察良好的圖像并高效地判斷細(xì)胞狀態(tài)。

（實(shí)施方式6）

在實(shí)施方式6中，將本發(fā)明用于選擇細(xì)胞的細(xì)胞選擇裝置中。

如圖18所示，實(shí)施方式6的細(xì)胞選擇裝置20與實(shí)施方式5的細(xì)胞檢測裝置10相比多了粒子甄別部件21和存放部件22。此外，如圖19所示，在實(shí)施方式6中，與實(shí)施方式5相比，光學(xué)檢測部件13的流動室200的結(jié)構(gòu)不同。實(shí)施方式6的其他結(jié)構(gòu)與實(shí)施方式5相同。

如圖19所示，實(shí)施方式6的流動室200中除了流路201之外還有流路202、203。流路202在流路201的延長線上，流路203在流路201、202之間，其是從流路201分叉出來的。流路202連接著無圖示的廢棄部件，流路203連接著存放部件22。粒子甄別部件21設(shè)置在流路202上。粒子甄別部件21包括部件21a構(gòu)件21a和使構(gòu)件21a向流路202突出的驅(qū)動部件。構(gòu)件21a位于打開流路202的位置時(shí)，流經(jīng)流路201的試樣不會運(yùn)送到流路203，而是經(jīng)由流路202運(yùn)送到廢棄部件。另一方面，構(gòu)件21a位于堵塞流路202的位置時(shí)，流經(jīng)流路201的試樣不會運(yùn)送到流路202，而是經(jīng)過流路203被運(yùn)送到存放部件22。

下面參照圖20，就細(xì)胞選擇裝置20所進(jìn)行的分析對象細(xì)胞的選擇處理進(jìn)行說明。圖20的流程圖與圖16相比用步驟s111~s113取代了步驟s105、s106。

在步驟s101，處理部件11與實(shí)施方式5同樣地制備試樣。在步驟s102，處理部件11驅(qū)動粒子甄別部件21，預(yù)先打開流路202，讓試樣從試樣制備部件12流入流動室200的流路201。在步驟s103，處理部件11與實(shí)施方式5同樣地用光照射試樣。此時(shí)，如圖19所示，從光源211~214射出的光照射到位于流路201的位置201a上的粒子，從粒子產(chǎn)生的光被受光部件221~223和拍攝部件224接收。在步驟s104，處理部件11與實(shí)施方式5同樣地獲取粒子所產(chǎn)生的熒光的強(qiáng)度。

在步驟s111，處理部件11根據(jù)位置201a的粒子所產(chǎn)生的波長λ21、λ22的熒光的強(qiáng)度判斷此粒子是否在圖4（a）所示散點(diǎn)圖100的區(qū)域101。即，關(guān)于位置201a的細(xì)胞，處理部件11根據(jù)來自評價(jià)用探針?biāo)械臒晒馍氐臒晒獾膹?qiáng)度和來自核酸染色用色素的熒光的強(qiáng)度，判斷雜交是否恰當(dāng)進(jìn)行。

如果就位置201a的細(xì)胞判斷為雜交恰當(dāng)進(jìn)行，則在步驟s112中，處理部件11在此細(xì)胞位于流路201的位置201b時(shí)驅(qū)動粒子甄別部件21來堵塞流路202，將此細(xì)胞運(yùn)送到存放部件22。另一方面，如果就位置201a的細(xì)胞判斷為未恰當(dāng)雜交，在步驟s113，處理部件11在此細(xì)胞位于位置201b時(shí)驅(qū)動粒子甄別部件21來打開流路202，將此細(xì)胞運(yùn)送到廢棄部件。

通過實(shí)施方式6，選擇恰當(dāng)雜交的細(xì)胞作為分析對象，并將其送入存放部件22。因此，使用存放在存放部件22的細(xì)胞，例如在通過其他檢測裝置或細(xì)胞檢測裝置10進(jìn)行異常細(xì)胞的檢測時(shí)，能夠精確地檢測出異常細(xì)胞。

在實(shí)施方式6，在步驟s101，與實(shí)施方式5同樣地，以her2基因作為檢測對象區(qū)，以ch17為評價(jià)對象區(qū)制備試樣。然而，本發(fā)明不限于此，也可以與實(shí)施方式2~4同樣地決定檢測對象區(qū)和評價(jià)對象區(qū)的組合并制備試樣。此時(shí)也能夠選擇恰當(dāng)雜交的細(xì)胞作為分析對象。

編號說明

10細(xì)胞檢測裝置

11處理部件

12試樣制備部件

20細(xì)胞選擇裝置

200流動室

211~214光源

221~223受光部件

224拍攝部件