專利名稱：：具有多臟器轉(zhuǎn)移潛能的中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物技術(shù)、微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株及其用途。
背景技術(shù)：
：肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生存和發(fā)展的惡性疾病之一，已成為腫瘤疾病中的頭號(hào)殺手。雖然目前對(duì)肺癌的治療已經(jīng)取得長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是肺癌死亡率仍長(zhǎng)期居高不下，主要原因在于難以早期診斷和它的高轉(zhuǎn)移性，許多患者首診時(shí)即發(fā)現(xiàn)有多器官轉(zhuǎn)移。所以，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍舊是肺癌治療的難題。然而，肺癌轉(zhuǎn)移尤其是靶向轉(zhuǎn)移(腫瘤細(xì)胞向特定器官進(jìn)行轉(zhuǎn)移)的分子機(jī)理還不清楚。肺腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，而且非常容易發(fā)生骨、腦、肝臟的轉(zhuǎn)移，病人的預(yù)后很差。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的研究一直在開(kāi)展，也發(fā)現(xiàn)了各種各樣的分子如降解細(xì)胞基質(zhì)的分子，細(xì)胞黏附分子，轉(zhuǎn)移相關(guān)糖蛋白等等，但都沒(méi)有對(duì)腫瘤向特定器官進(jìn)行轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行說(shuō)明。本專利立足于開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中國(guó)人多器官轉(zhuǎn)移的專利細(xì)胞系，旨在通過(guò)分離純化出來(lái)的向特定器官進(jìn)行轉(zhuǎn)移的骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、肝臟等多臟器轉(zhuǎn)移細(xì)胞系進(jìn)行系統(tǒng)地全基因組芯片和microRNA芯片分析，將基因或microRNA的表達(dá)變化與基因組的擴(kuò)增或缺失相聯(lián)系，并結(jié)合microRNA的靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase)，篩選那些有位于基因組上缺失或擴(kuò)增區(qū)域的同時(shí)有表達(dá)變化的microRNA，將這些microRNA的調(diào)控耙標(biāo)(即受這些microRNA調(diào)控的基因)與在各轉(zhuǎn)移細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生變化的且位于基因組缺失或擴(kuò)增區(qū)域的基因進(jìn)行比較，挑選那些重疊的基因進(jìn)行研究，這樣有利于發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的或起決定作用的與靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因或microRNA，可以深入揭示肺腺癌靶向轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理，為阻斷轉(zhuǎn)移提供候選的分子靶標(biāo)，可服務(wù)于肺腺癌病人的檢測(cè)，評(píng)估其發(fā)生轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移部位的風(fēng)險(xiǎn)，從而為有針對(duì)性地治療提供依據(jù)，分子靶標(biāo)功能的明確也為今后分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株，所述的細(xì)胞株具有骨、腦、肝、肺、腎和腎上腺多臟器轉(zhuǎn)移潛能。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供該肺癌細(xì)胞株的醫(yī)療研究用途。本發(fā)明采用取自56歲女性肺腺癌患者十次化療后產(chǎn)生的腹水作細(xì)胞原代培養(yǎng)的材料，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)成功，建立的肺腺癌細(xì)胞株命名為CPA-Y2。經(jīng)裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，第八代細(xì)胞開(kāi)始致瘤率，第十代細(xì)胞致瘤率已達(dá)到100%;體外培養(yǎng)細(xì)胞在顯微鏡下顯示為貼壁生長(zhǎng)且細(xì)胞面積較小(與SPC-A-1比較)；經(jīng)裸鼠左心室種植(75-80萬(wàn)細(xì)胞/只)三周后陸續(xù)出現(xiàn)小鼠下肢不便，后經(jīng)核素骨顯像檢測(cè)和病理確定為骨、肺、腎上腺轉(zhuǎn)移達(dá)100%;同時(shí)有80%腎轉(zhuǎn)移、75%肝轉(zhuǎn)移、50%腦轉(zhuǎn)移。(TheChineseLungAdenocarcinomacellwithHighlyBone，Pulmonary,Brain，Liver，adrenalandkidneyMetastases,CPA-Y2)。已于2008年10月8日保藏，保藏單位CGMCC，北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCCNo2708，分類(lèi)命名中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞系。本細(xì)胞株具有以下生物學(xué)特性1，親代細(xì)胞的體積較小(和SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞比)。2，致瘤率在裸鼠皮下注射100萬(wàn)癌細(xì)胞，第八代50%致瘤；第十代起100%。3，具有骨、腦、肝、肺、腎和腎上腺多臟器轉(zhuǎn)移的中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞系。4，第一代肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞經(jīng)左心室注射裸鼠形成多臟器轉(zhuǎn)移的時(shí)間為2-3周。5，親代細(xì)胞轉(zhuǎn)移部位出現(xiàn)的比率，以肺、骨、腎上腺為突出。6，熒光定量PCR測(cè)定，癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因IGF、ETV5高表達(dá)。7，患者十次化療后產(chǎn)生大量胸、腹水提示該細(xì)胞對(duì)化療耐藥。表1是細(xì)胞生物特性表。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注皮下滯瘤率系指每只裸鼠皮下注射百萬(wàn)細(xì)胞后統(tǒng)計(jì)。本發(fā)明建立了一個(gè)具有多臟器高潛能轉(zhuǎn)移的國(guó)人肺腺癌親代細(xì)胞株。本發(fā)明通過(guò)下述方法建立具有多臟器高潛能轉(zhuǎn)移的國(guó)人肺腺癌親代細(xì)胞株，取肺腺癌患者十次化療后產(chǎn)生的腹水作細(xì)胞原代培養(yǎng)的材料，采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫缺陷小鼠(皿demice，SCIDmice,NIH-IIIBNXmice)，通過(guò)在免疫缺陷小鼠尾靜脈注射1月后出現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，取肺結(jié)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠注射后形成多臟器轉(zhuǎn)移，經(jīng)實(shí)驗(yàn)和病理證實(shí)是個(gè)良好的中國(guó)人肺腺癌多臟器轉(zhuǎn)移細(xì)胞模型，為系統(tǒng)研究肺癌多發(fā)轉(zhuǎn)移提供了技術(shù)平臺(tái)。經(jīng)網(wǎng)上查詢，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)有肺癌肝、腦轉(zhuǎn)移模型的報(bào)道。本發(fā)明建立了高潛能多臟器轉(zhuǎn)移國(guó)人肺腺癌細(xì)胞系，能對(duì)國(guó)人肺腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷提供參考數(shù)據(jù)，還可進(jìn)一步建立相關(guān)基因芯片技術(shù)，評(píng)估探索各種藥物包括化學(xué)、生物、免疫、中醫(yī)藥、放射性藥物等治療療效。為探索診療國(guó)人肺癌轉(zhuǎn)移提供了技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)，進(jìn)一步分析肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因組以及多臟器轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，可加深對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為肺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、評(píng)估療效提供一種有效的分子檢測(cè)方法。圖1是CPA-Y2早期細(xì)胞照片X100。圖2是2，CPA-Y2肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞X100。圖3是CPA-Y2腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞X100。圖4是4，CPA-Y2左肱骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞X100。圖5是CPA-Y2腦轉(zhuǎn)移病理HEX100。圖6是6，CPA-Y2肝轉(zhuǎn)移病理HEX100。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取肺腺癌患者十次化療后產(chǎn)生的腹水作細(xì)胞原代培養(yǎng)的材料，采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫缺陷小鼠(皿demice，SCIDmice,NIH-IIIBNXmice)，通過(guò)在免疫缺陷小鼠尾靜脈注射1月后出現(xiàn)肺結(jié)節(jié)，取肺結(jié)節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)成功，建立了肺腺癌細(xì)胞命名為CPA-Y2。經(jīng)裸鼠動(dòng)物注射后實(shí)驗(yàn)顯示，第八代細(xì)胞開(kāi)始致瘤率，第十代細(xì)胞致瘤率已達(dá)到100%;體外培養(yǎng)細(xì)胞在顯微鏡下顯示為貼壁生長(zhǎng)且細(xì)胞面積較小(與SPC-A-1比較)；經(jīng)裸鼠左心室種植(75-80萬(wàn)細(xì)胞/只)三周后陸續(xù)出現(xiàn)小鼠下肢不便，后經(jīng)核素骨顯像檢測(cè)和病理確定形成多臟器轉(zhuǎn)移，骨、肺、腎上腺轉(zhuǎn)移達(dá)100%;同時(shí)有80%腎轉(zhuǎn)移、75%肝轉(zhuǎn)移、50%腦轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)和病理結(jié)果證實(shí)，所述的肺腺癌細(xì)胞CPA-Y2是良好的中國(guó)人肺腺癌多臟器轉(zhuǎn)移細(xì)胞模型，為系統(tǒng)研究肺癌多發(fā)轉(zhuǎn)移提供了技術(shù)平臺(tái)。實(shí)施例2國(guó)人肺腺癌細(xì)胞(CPA-Y2)75X1(^，注入免疫缺陷小鼠血液系統(tǒng)，兩周后隔天稱重，第三周起每周進(jìn)行核素骨顯像檢測(cè)，能證實(shí)該親代細(xì)胞是高潛能多臟器轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞系。所述的培養(yǎng)基為含10%小?；蛱ヅＱ錜PMI1640或DMEM培養(yǎng)基，pH=7，培養(yǎng)溫度為37°C，5%C02。實(shí)施例3免疫缺陷小鼠經(jīng)左肺、左心室注射CPA-Y2人肺腺癌細(xì)胞后形成多臟器轉(zhuǎn)移后再篩選建立單臟器轉(zhuǎn)移各亞型細(xì)胞。綜合運(yùn)用基因芯片、實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白印跡(WesternBlotting)等技術(shù)，進(jìn)一步分析肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能基因組以及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。權(quán)利要求一種具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株，其特征在于，所述細(xì)胞分類(lèi)命名為中國(guó)人肺腺癌細(xì)胞系，CPA-Y2，保藏編號(hào)CGMCCNo.2708。2.按權(quán)利要求1所述的具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株，其特征所述細(xì)胞株具有以下生物學(xué)特性1)半懸浮半貼壁生長(zhǎng)，親代細(xì)胞的體積較SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞?。?)在裸鼠皮下注射100萬(wàn)癌細(xì)胞，第八代50%致瘤，第十代起100%致瘤；3)骨、腦、肝、肺、腎和腎上腺多臟器轉(zhuǎn)移；4)第一代肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞經(jīng)左心室注射裸鼠形成多臟器轉(zhuǎn)移的時(shí)間為2-3周；5)親代細(xì)胞轉(zhuǎn)移高出現(xiàn)部位為肺、骨、腎上腺；6)熒光定量PCR測(cè)定，癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因IGF、ETV5高表達(dá)；7)該細(xì)胞對(duì)化療耐藥。3.按權(quán)利要求1所述的具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株，其特征是所述源細(xì)胞是以肺腺癌患者十次化療后產(chǎn)生的腹水作細(xì)胞原代培養(yǎng)的材料。全文摘要本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域。采用肺腺癌患者十次化療后產(chǎn)生的腹水作細(xì)胞原代培養(yǎng)的建系的材料，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，建立了具有多臟器轉(zhuǎn)移高潛能的國(guó)人肺腺癌細(xì)胞株細(xì)胞株命名為CPA-Y2，保藏編號(hào)CGMCCNo.2708。所建立的細(xì)胞株，半懸浮半貼壁生長(zhǎng)，親代細(xì)胞的體積較SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞??；在裸鼠皮下注射100萬(wàn)癌細(xì)胞，第八代50％致瘤，第十代起100％致瘤；能在骨、腦、肝、肺、腎和腎上腺多臟器轉(zhuǎn)移；且該細(xì)胞對(duì)化療耐藥。所述細(xì)胞株是理想的人肺腺癌的多臟器轉(zhuǎn)移研究的細(xì)胞模型，在揭示人肺腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和抗轉(zhuǎn)移藥物篩選的應(yīng)用中將有著廣闊的前景。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101717753SQ20091017080公開(kāi)日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年9月8日優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日發(fā)明者楊順?lè)忌暾?qǐng)人:上海市胸科醫(yī)院