本發(fā)明提供了一種水貂自咬行為診斷基因，進(jìn)一步本發(fā)明還涉及利用該診斷基因設(shè)計(jì)自咬行為個(gè)體特異性的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增引物，可用于快速診斷水貂群體中的自咬行為個(gè)體的檢測(cè)方法，屬于鼬科動(dòng)物疾病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自咬行為（self-bitingbehavior，sb）是一種發(fā)生機(jī)理未明的異常行為。行為學(xué)家將其定義為有意、直接傷害自體組織的行為模式，多見(jiàn)于籠養(yǎng)條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物和患有精神性疾病或智力障礙、癡呆的病人。毛皮動(dòng)物的自咬癥是指水貂和狐貍等肉食性毛皮動(dòng)物的一種以反復(fù)咬傷身體后軀和尾部為主要癥狀的慢性疾病，是毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中最為嚴(yán)重的疾病之一。目前，世界上主要的毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)大國(guó)均有該病發(fā)生，發(fā)病率約為5~20%。丹麥報(bào)道的發(fā)病率為20%。全世界每年僅水貂皮的生產(chǎn)量約為3000~3500萬(wàn)張，由于自咬癥導(dǎo)致的等級(jí)下降的皮張?jiān)?00~300萬(wàn)張，每年給世界毛皮動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)1967~1970年已有水貂自咬癥發(fā)病的報(bào)道。國(guó)內(nèi)每年水貂自咬癥的發(fā)病率約為5~10%。因此對(duì)水貂自咬行為的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、診斷并及時(shí)治療對(duì)預(yù)防和徹底根除該行為具有重大的意義。目前，對(duì)于水貂自咬行為的檢測(cè)方法多為pcr擴(kuò)增、rapd和scar檢測(cè)方法。但以上方法存在重復(fù)性和穩(wěn)定性差，以及操作復(fù)雜不利于現(xiàn)場(chǎng)推廣等問(wèn)題。因此，選擇高特異性的抗原，建立具有高敏感性、高特異性的水貂自咬行為診斷方法十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明公開(kāi)了一種水貂自咬行為診斷基因，采用尾分析法對(duì)健康水貂和自咬行為水貂基因組dna池進(jìn)行rapd擴(kuò)增篩選隨機(jī)引物，獲得健康水貂和自咬行為水貂基因池中差異標(biāo)記基因?；厥铡⒖寺‰S機(jī)引物a10的rapd特異標(biāo)記片段，經(jīng)測(cè)序后獲得該片段的全序列。所測(cè)的sa10-1000基因序列的長(zhǎng)度為959bp，將所測(cè)序列通過(guò)genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測(cè)的sa10-959擴(kuò)增序列與犬屬布氏桿菌的同源性達(dá)73%。

本發(fā)明所述的一種水貂自咬行為診斷基因，如sqyno:1所示。

本發(fā)明所述一種水貂自咬行為診斷基因的制備方法，包括以下步驟：

用基因組dna提取試劑盒從采取健康水貂和自咬癥水貂肌肉樣本中提取基因組dna，分別組成基因池用于rapd擴(kuò)增；

隨機(jī)引物序列如下：

a10引物序列g(shù)tgatcgcag；

將隨機(jī)引物a10對(duì)健康和自咬水貂基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該引物在自咬水貂基因組中擴(kuò)增到1條特異性條帶；回收、克隆隨機(jī)引物的rapd特異標(biāo)記片段，經(jīng)測(cè)序后獲得該片段的全序列；

所測(cè)基因序列的長(zhǎng)度為959bp（圖1），并命名為sa10-959，將所測(cè)序列通過(guò)genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測(cè)的基因序列與犬屬布氏桿菌的同源性達(dá)73%；sa10-959特異標(biāo)記片段的全序列如sqyno:1所示。

本發(fā)明水貂自咬行為診斷基因診斷水貂群體中的自咬行為個(gè)體的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

采用水貂自咬行為診斷基因序列做為候選靶基因序列，設(shè)計(jì)了一套特異性的lmap引物。lmap的引物設(shè)計(jì)是采用官方軟件primerexplorerv3.0；首先通過(guò)瀏覽器登錄lamp官方網(wǎng)站http://primerexplorer.jp，進(jìn)入primerexplorerv3.0軟件使用界面，導(dǎo)入文本格式的靶序列；

lmap的引物序列如下：

f3引物序列cgggtgatttccggtttga

b3引物序列　acgcagccatgatcttcttg

fip引物序列tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg

bip引物序列aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat

lf引物序列g(shù)ttgggaagaccgataagagc

lb引物序列g(shù)gggatcgcggctgtttct。

所述的lamp反應(yīng)體系為：2.5μl10×buffer、1.2mmdntp、f3和b3引物0.2μm、fip和bip引物1.6μm、lf和lb引物0.8μm、1.0m甜菜堿、8mmmg²⁺、1μlbstdna聚合酶、2μl模板；62.1°c反應(yīng)1小時(shí)，80°c加熱2分鐘；分別以健康水貂和自咬水貂dna為模板，同時(shí)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有自咬水貂個(gè)體能擴(kuò)增出lamp反應(yīng)特有的梯形條帶。

本發(fā)明所述的診斷基因可以制備水貂群體中的自咬行為個(gè)體試劑盒。

本發(fā)明的積極效果在于：

提供了一種水貂自咬行為診斷基因，通過(guò)genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測(cè)的sa10-959擴(kuò)增序列與犬屬布氏桿菌的同源性達(dá)73%。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速準(zhǔn)確且自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，使其適合于臨床的快速診斷和牧區(qū)、村鎮(zhèn)等流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明a10隨機(jī)引物對(duì)健康和自咬水貂dna的擴(kuò)增結(jié)果1~5為健康水貂6~10為自咬水貂；

圖2為本發(fā)明lamp反應(yīng)對(duì)水貂自咬癥的的特異性檢測(cè)電泳圖：m,dl2000；泳道1,2是自咬水貂dna；泳道3，4為健康水貂dna；n，陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式：

下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明的任何平行改變和改動(dòng)都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。

實(shí)施例1:

本發(fā)明一種水貂自咬行為診斷基因的制備方法，包括以下步驟：

用基因組dna提取試劑盒從采取健康水貂和自咬癥水貂肌肉樣本中提取基因組dna，分別組成基因池用于rapd擴(kuò)增；

隨機(jī)引物序列如下：

a10引物序列g(shù)tgatcgcag；

將隨機(jī)引物a10對(duì)健康和自咬水貂基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該引物在自咬水貂基因組中擴(kuò)增到1條特異性條帶；

回收、克隆隨機(jī)引物的rapd特異標(biāo)記片段，經(jīng)測(cè)序后獲得該片段的全序列；

所測(cè)基因序列的長(zhǎng)度為959bp（圖1），并命名為sa10-959，將所測(cè)序列通過(guò)genbank中的blast序列比較分析，從比較結(jié)果得知，所測(cè)的基因序列與犬屬布氏桿菌的同源性達(dá)73%；sa10-959特異標(biāo)記片段的全序列如sqyno:1所示。

實(shí)施例2：

本發(fā)明水貂自咬行為診斷基因診斷水貂群體中的自咬行為個(gè)體的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

采用水貂自咬行為診斷基因序列做為候選靶基因序列，設(shè)計(jì)了一套特異性的lmap引物。lmap的引物設(shè)計(jì)是采用官方軟件primerexplorerv3.0；首先通過(guò)瀏覽器登錄lamp官方網(wǎng)站http://primerexplorer.jp，進(jìn)入primerexplorerv3.0軟件使用界面，導(dǎo)入文本格式的靶序列；

lmap的引物序列如下：

f3引物序列cgggtgatttccggtttga

b3引物序列　acgcagccatgatcttcttg

fip引物序列tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg

bip引物序列aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat

lf引物序列g(shù)ttgggaagaccgataagagc

lb引物序列g(shù)gggatcgcggctgtttct。

lamp反應(yīng)體系為：2.5μl10×buffer、1.2mmdntp、f3和b3引物0.2μm、fip和bip引物1.6μm、lf和lb引物0.8μm、1.0m甜菜堿、8mmmg²⁺、1μlbstdna聚合酶、2μl模板；62.1°c反應(yīng)1小時(shí)，80°c加熱2分鐘；分別以健康水貂和自咬水貂dna為模板，同時(shí)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有自咬水貂個(gè)體能擴(kuò)增出lamp反應(yīng)特有的梯形條帶（圖2）。

為了驗(yàn)證lmap標(biāo)記的特異性和適用性。選水貂養(yǎng)殖廠取皮期的自咬水貂和健康水貂各30只，分別提取dna，并分別采用rapd和lmap標(biāo)記擴(kuò)增并進(jìn)行驗(yàn)證?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果如表1所示，特異lmap標(biāo)記在健康和自咬水貂群體之間的比例差異極顯著（p<0.001）。與rapd標(biāo)記相比較，lmap標(biāo)記方法更準(zhǔn)確的區(qū)分健康與自咬水貂個(gè)體，并且更加穩(wěn)定、可靠。lamp反應(yīng)可合成10⁹數(shù)量級(jí)的dna，同時(shí)產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白色沉淀來(lái)快速定性判斷l(xiāng)amp反應(yīng)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以用此簡(jiǎn)化方法對(duì)水貂群體進(jìn)行大規(guī)模鑒定，既快速簡(jiǎn)便，又大大降低成本。

表1健康水貂和自咬水貂中rapd和lmap標(biāo)記分布情況

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所

<120>

<140>

<160>

<210>

<211>959

<212>dna

<213>水貂（neovisonvison）

<400>

1cactagcgtcgccctgctaagtcgatcttgacgccgcgttggtcgaaccc

51tctcttactactcgccgcaagtcgggctaatgtgcgaagtgtcccttcgt

101ggtaggcaactgctaataacggccaacgcccactaaaggccaaactcagg

151cttctcggcactccgccgagaatagccagaagggttgtgccagacgccgc

201actgccactgcgacctgccgttccgtcagccgtacccggcgtagcagccc

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<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(19)

<223>

<400>2

cgggtgatttccggtttga19

<210>3

<211>10

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(10)

<223>

<400>3

acgcagccatgatcttcttg20

<210>4

<211>37

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(37)

<223>

<400>4

tccagcgtcaccgtcacgcgtccgaagagccgtgagg37

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(36)

<223>

<400>5

aaggcagtcggcatgggcggcgggatcaaccgcaat36

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(21)

<223>

<400>6

gttgggaagaccgataagagc21

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(19)

<223>

<400>7

ggggatcgcggctgtttct19