一種結核病血清學診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種結核病血清學診斷試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終止液，還包含以下組分：重組蛋白rRv0220，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重組蛋白rRv2958c，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明所提供的兩種重組蛋白均具有良好的免疫反應性，能與其誘導的小鼠產生的抗體發(fā)生特異結合。兩種重組蛋白均能與結核病患者血清發(fā)生特異結合，經間接ELISA法檢測，與膠體金法(38?16KDa)比較，rRv0220的特異性、敏感性和總符合率分別為98.6％，98.3％和98.4％；rRv2985c的特異性、敏感性和總符合率分別為100％，96.5％和98.4％，說明兩種重組蛋白具有高度的敏感性與特異性，能夠作為結核病血清學診斷的優(yōu)選抗原。
【專利說明】
一種結核病血清學診斷試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能夠用于結核病血清學診斷的檢測試劑盒，尤其涉及兩種能與結 核病患者血清發(fā)生特異結合的結核分枝桿菌抗原，屬于生物工程和疾病診斷技術領域。
【背景技術】
[0002] 結核病（TuberculosisJB)是威脅人類健康的最主要的傳染性疾病之一，由傳染 性病原體結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起。MTB主要分為人型、 牛型、非洲型及鼠型，人類結核病90%以上由感染人型MTB引起，少數為牛型和非洲型所致。 MTB可侵犯全身各器官系統，患病部位以肺臟最為常見，也可累及肝、骨和腦等其它器官。 MTB感染分為潛伏性與活動性兩種狀態(tài)。TB的傳染源主要是活動性的肺結核患者，其主要通 過呼吸道傳播，也可用過破損的皮膚、粘膜和消化道等途徑傳染。MTB攜帶者感染HIV后，由 潛伏期發(fā)展為活動性結核病的可能性遠高于未感染HIV者，其病程發(fā)展更快。2014年世界衛(wèi) 生組織公布全球約960萬新發(fā)TB病例，110萬人死于TB，其中40萬為HIV陽性。
[0003] 目前，結核病的實驗室診斷方法主要有以下幾種：（1)細菌學診斷：痰涂片鏡檢法 簡單、快速和可靠，但其敏感性差;痰樣本培養(yǎng)是結核病診斷的金標準，但傳統固體培養(yǎng)時 間需60~90d，液體培養(yǎng)及藥敏試驗約需20d，且約40%的成人肺結核患者的痰涂片標本檢 測為陰性。（2)血清學診斷:TB血清學診斷方法主要是利用免疫技術進行檢測血清中特異性 抗MTB的抗體。（3)結核菌素皮膚試驗:感染過MTB的機體產生相應的致敏淋巴細胞，再次注 射PPD后，機體會在皮試試驗后的2~3d產生遲發(fā)型的超敏反應，局部出現紅腫硬節(jié)。該試 驗一直被應用于TB的臨床診斷，但其特異性差，常與環(huán)境分枝桿菌和BCG產生交叉反應。（4) MTB核酸擴增檢測：該方法敏感性好，即使標本中拷貝數低的細菌也能被檢出，但臨床應用 會有偏差，如標本處理不當，靶序列或擴增產物交叉污染等易造成假陰性。（5)IFN-y釋放 試驗:該方法是體外免疫檢測的新方法，其商業(yè)化診斷試劑盒以EAST6和CFP10蛋白作為刺 激抗原，一般釆用酶聯免疫吸附測定或者酶聯免疫斑點方法檢測機體全血或者外周血單核 細胞中產生的IFN- y的T細胞數量及細胞因子變化量。
[0004] 這些診斷方法中，血清學檢測是體外診斷TB的有效方法，其檢測方法簡單、快速、 高效和低廉，成為近年來TB診斷的研究熱點。該方法通過基因工程獲取重組抗原，結合間接 ELI SA方法檢測病人血清中的抗MTB的抗體，在TB的血清學診斷中顯示出優(yōu)越的診斷潛能， 雖然目前已有基于重組抗原組合的商品化試劑盒，如膠體金法試劑盒TB38-16KD，但其敏感 性和特異性有待進一步提高，且在臨床檢驗中并不能診斷潛伏期TB。因此，尋找特異性強和 敏感性高的MTB抗原是提高TB血清學檢測陽性率的關鍵。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明解決了【背景技術】中的不足，提供了一種用于TB血清學診斷的ELISA試劑盒， 該試劑盒中的兩種重組蛋白（抗原)均能夠與結核病患者血清發(fā)生特異結合，敏感性和特異 性高，具有良好的應用前景。
[0006] 實現本發(fā)明上述目的所采用的技術方案為：
[0007] -種結核病血清學診斷試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終 止液，試劑盒中還包含以下組分:重組蛋白rRv0220,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；重 組蛋白rRv2958c，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明還成功構建了2種原核表達重 組載體pET-28a/Rv0220和pET-28a/Rv2958c，將其分別轉化到大腸桿菌E.coil BL21中后， 用IPTG分別誘導表達出相對分子量約為46kDa和50kDa的兩種重組融合蛋白（以包涵體狀態(tài) 表達），經鎳柱親和純化后獲得了純化的重組蛋白。
[0008] 所述包被液為0.05M的碳酸鹽緩沖液，其pH為9.6 ;所述的洗滌液為含0.05 % Tween-20的TOST緩沖液，其pH為7.6;所述封閉液為含5 %BSA的PBS緩沖液;所述的終止液為 2mol/L 的 H2S04 溶液。
[0009] 本發(fā)明所提供的重組蛋白rRv0220和rRv2958c均能與不同的TB患者血清發(fā)生特異 結合，經間接ELISA法檢測，與膠體金法(38-16KDa)比較，測得rRv0220的特異度為98.6%， 敏感度為98.3 %，總符合率為98.4% ; rRv2985c的特異度為100.0%，敏感度為96.5%，總符 合率為98.4%;說明兩種重組蛋白具有良好的免疫反應性，能夠作為TB血清學診斷的優(yōu)選 抗原。
【附圖說明】
[001 0]圖1為實施例中PCR產物1.0 %瓊脂糖電泳分析圖；
[0011] 圖2為實施例中兩種重組質粒雙酶切1.0%瓊脂糖電泳分析圖；
[0012] 圖3為實施例中兩種重組質粒在E.coliBL21中的表達圖；
[0013] 圖4為實施例中兩種重組蛋白的純化圖；
[0014]圖5為Western Blot法檢測重組蛋白與臨床血清的免疫反應性結果圖；
[0015]圖6為ELISA法檢測重組蛋白與臨床血清的免疫反應性結果圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不局 限于以下實施例。
[0017] 一、原核表達重組載體的構建
[0018] 1、目的基因的PCR擴增
[0019] (1)目的基因特異性引物的設計及合成
[0020] 根據GenBank中Rv0220和Rv2958c兩種基因的DNA序列分別設計上下游引物（下劃 線為限制性內切酶酶切位點），各基因的上下游引物、酶切位點、產物長度和退火溫度如下 表所示：
[0021]
[0022] (2)目的基因的PCR擴增反應體系及程序
[0023]以TB的基因組DNA為模板，用Pyrbest?高保真DNA聚合酶進行PCR擴增目的基因。 PCR反應體系均為:Pyrbest? DNAMix 12.5此、上下游引物各lyL、MTB DNA模板2此，去離子 水8.5此。1^0220 的擴增參數為：981€3〇8,98°(：1〇8,551€3〇8,721€3〇8，共35個循環(huán) ；72°(：延 伸 21^11。1^2958(3 的擴增參數為：981€3〇8;98°(：1〇8,441€3〇8,72 1€3〇8，共35個循環(huán)；72°(：延 伸2min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果并保存。
[0024] 結果顯示如圖1所示，分別擴增出大小為1212bp和1287bp的PCR產物，分別與 Rv0220和Rv2958c基因的片段大小一致。然后采用DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化回收。 [0025] 2、載體與目的基因的雙酶切鑒定及純化回收
[0026] (1)原核質粒pET-28a與目的基因Rv0220和Rv2958c的雙酶切體系
[0029] (2)原核質粒pET_28a與目的基因雙酶切后的純化回收
[0030] 按25yL酶切體系加入各成分，600rpm點離10s，放至37°C水浴箱中保溫酶切4h，然 后65°C水浴15min終止酶切反應。純化雙酶切后的目的基因和原核質粒pET-28a。
[0031] 3、載體與目的基因的連接
[0032]連接體系如下：
[0034]按上述體系將純化好的目的基因和質粒雙酶切產物及各反應物加到0 . lmL EP管 中，混勻后點離，22°C連接3h [0035] 4、轉化
[0036] (1)取10yL經65°C滅活lOmin的連接產物，加入到感受態(tài)細胞中混勻，冰浴30min;
[0037] (2)將菌液放置在42°C水浴箱中熱激90s，迅速冰浴3min;
[0038] (3)將轉化物中加入800yL LB液體培養(yǎng)基混勻，180rpm、37°C振蕩培養(yǎng)lh，4°C， 14000rpm 離心 lmin;
[0039] (4)吸去800yL上清，將剩余成分輕輕吹打，重懸菌體；
[0040] (5)將重懸的菌液均勻鋪于LB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素)上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。
[0041] 5、陽性克隆的篩選與鑒定 [0042] (1)陽性克隆的篩選
[0043]過夜培養(yǎng)后，觀察LB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素)上長出的單個菌落，隨機挑取5個單 菌落，分別接種于lmL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜；
[0044] (2)陽性克隆的鑒定
[0045] 兩種重組質粒雙酶切1.0%瓊脂糖電泳分析圖如圖2所示，圖2中，M: DNA Marker; l:pET_28a/Rv0220PCR product;2:pET_28a/Rv2958c PCR product。
[0046]將重組質粒的測序結果進行BLAST分析，結果顯示構建的各重組質?；騌v0220 和Rv2958c與GenBank公布的兩種基因的DNA序列符合率均為100%，表明重組質粒構建成 功。
[0047]二、兩種重組蛋白的表達、純化與鑒定 [0048] 1、原核重組表達載體的誘導表達
[0049] (1)重組質粒構建測序成功后，分別取含重組質粒pET-28a/Rv0220、pET-28a/ Rv2958c的E.coli BL21接種于的LB固體培養(yǎng)基(含卡那霉素)上，37°C培養(yǎng)過夜；
[0050] (2)分別挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜；
[0051 ] (3)挑取重組菌Rv0220經培養(yǎng)后，加入IPTG至終濃度為2mmol/L，37 °C下誘導表達 3h。重組菌Rv2958c經培養(yǎng)后，加入IPTG至終濃度為1.5mmol/L，37°C下誘導培養(yǎng)6h。
[0052] (4)離心收集菌體沉淀并重懸于roS中，加入溶菌酶至終含量為4.Og/L;冰浴2h后 超聲波破碎菌液(每次l〇s，間歇10s;共計5次）。離心后分別收集上清和沉淀，取32此上清與 8yL的5 X SDS上樣緩沖液均勻混合;菌體沉淀中加入40yL PBS與10yL的5 X SDS上樣緩沖液 混勻，煮沸5min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色以觀察重組蛋白rRv0220和 rRv2958c的存在狀態(tài)。
[0053] 通過改變誘導時的溫度、IPTG濃度和時間摸索蛋白最佳表達條件，rRv0220、 rRv2958c均以包涵體形式表達。兩種重組質粒在E.coliBL21中的表達圖如圖3所示。37°C、 2 ? Ommol/LIPTG、誘導3h時rRv0220表達水平最高；37°C、1 ? 5mmol/LIPTG、誘導6h時rRv2958c 表達水平最高。
[0054] 3、重組蛋白的鑒定
[0055] (1)將各重組蛋白經SDS-PAGE電泳，條件設置為90V電泳30min，待樣品進入分離膠 后，電壓調至120V，電泳至合適位置后，分別在各重組蛋白相應的分子量處切膠；
[0056] (2)用半干轉膜儀將SDS-PAGE膠上的蛋白經90mA 2h轉移至PVDF膜上；
[0057] (3)轉膜完畢，將膜正面朝下浸泡于含5%BSA的封閉液中，4°C封閉過夜；
[0058] (4)加入TBST緩沖液洗膜3次，每次15min;
[0059] (5)PVDF膜浸泡于鼠源性抗His標簽單克隆抗體（1:15 000稀釋）中，室溫孵育2小 時；
[0060] (6)加入TBST緩沖液洗膜5次，每次15min;
[00611 (7)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(1:20 000稀釋)室溫孵育45min; [0062] (8)加入TBST緩沖液洗膜5次，每次15min;
[0063] (9)用ECL化學發(fā)光劑顯色，使用全自動化學發(fā)光圖像分析系統拍照并留圖。
[0064] 4、重組蛋白的大規(guī)模制備
[0065]按照上步驟中各蛋白表達條件進行大規(guī)模表達。10 OOOrpm離心15min，收集菌體 沉淀。加適量PBS緩沖液洗滌菌體2次，洗滌后按每克濕菌體加入8mLPBS緩沖液，加入溶菌酶 至終濃度為4. Og/L;樣本置于冰盒內于搖床振蕩過夜，超聲波破碎(每次10s，間歇10s;共計 60次）。4°(：，12 OOOrpm離心20min收集包涵體沉淀。
[0066] 5、包涵體洗滌和溶解
[0067] (1)取超聲波破碎分離的包涵體，加入包涵體洗滌液I (4%TritonX-100，60mmol/L EDTA，1.5mol/L NaCl，pH = 7.0)，漩渦振蕩混勻，放置冰盒內搖床振蕩30min，4°C，10 OOOrpm離心15min，收集沉淀；
[0068] (2)加入包涵體洗滌液 II (0 ? lmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，2mol/L Urea，pH= 7.0)，混勾，冰浴搖床振蕩30min，4°C，10 OOOrpm離心15min，收集洗滌后的包涵體；
[0069] (3)洗滌后的包涵體重懸于溶解液(0? lmol/L Tris-Cl，8mol/L Urea，5臟ol/L DTT， pH=8.0)，室溫孵育過夜，使包涵體充分溶解。
[0070] 6、重組蛋白的變性純化
[0071] (1)獲取溶解后的包涵體溶液，4°C，10000rpm離心15min收集上清液；
[0072] (2)用Buffer B緩沖液（8mol/L Urea，100mmol/L NaH2P〇4,10mmol/L Tris-Cl ,pH =8.0)預平衡Ni-NTA柱2min，棄去流出液，用PBS緩沖液將柱子潤洗2次；
[0073] (3)將收集的包涵體溶解液上清加入Ni-NTA柱，搖床振蕩lh，使蛋白充分掛柱；
[0074] (4)用Buffer C緩沖液（8mol/L Urea，100mmol/L NaH2P〇4,10mmol/L Tris-Cl ,pH =6.3)洗柱，收集流出液，反復洗滌3次；
[0075] (5)用Buffer D緩沖液（8mol/L Urea，100mmol/LNaH2P〇4,10mmol/L Tris-Cl，pH= 5.9)洗柱，收集流出液，反復洗滌3次；
[0076] (6)用Buffer E緩沖液（8mol/L Urea，100mmol/LNaH2P〇4,10mmol/L Tris-Cl，pH= 4.5)進行洗脫，收集流出液，反復洗滌3次。
[0077] 收集大量誘導表達rRv0220、rRv2958c，超聲破碎菌體獲得包涵體，經洗滌和變性溶 解后上Ni-NTA柱，用Buffer B、Buffer C、Buffer D和Buffer E進行洗脫。結果顯示均能得到 純度較高的rRv0220、rRv2958c，如圖4所示。純化后的rR v0220、rRv2958c經透析袋透析復性， PEG800濃縮，用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度分別為1100yg/mL、2200yg/mL。
[0078] 7、重組蛋白透析復性
[0079] (1)分別把純化后的rRv0220、rRv2958c加入透析袋內，用透析液(50mmol/L NaCl、 0.5mmol/L EDTA、50mmol/L Tris、lmmol/L GSH、0.1mmol/L GSSG，50%甘油，pH=8.0)于4 °C透析過夜；
[0080] (2)透析液更換為（4mol/L Urea、2mmol/L GSH、0.2mmol/L GSSG、PBS pH=7.4)，4 °C透析過夜；
[0081 ] (3)向透析杯中分批加入共1L的PBS緩沖液，緩慢降低Urea濃度使重組蛋白自然復 性；
[0082] (4)最后用聚乙二醇PEG800濃縮復性后的蛋白。
[0083] 8、總結
[0084] 本實施例中成功構建了含MTB Rv0220和Rv2958c基因的兩種原核表達載體pET-28a/Rv0220和pET-28a/Rv2958c。分別對兩種重組蛋白rRv0220、rRv2958c的表達條件進行 了摸索與優(yōu)化，內容包括誘導劑1?了6濃度(0.2臟〇1凡、0.51111]1〇1凡、1.01111]1〇1凡、1.51111]1〇1/1和 2.0111111〇1/1)、誘導溫度（16°(：、28°(：、30°(：和37°(：)和誘導時間（311、611、811、12和2411)。結果顯 示:rRv0220在IPTG濃度為2.0mmol/L，37°C時誘導3h在沉淀中表達水平最高，上清中無表 達;rRv2958c在IPTG濃度為1.5mmol/L，37°C時誘導6h在沉淀中表達水平最高，上清中無表 達。說明兩種重組蛋白均以包涵體形式表達，重組目的蛋白形成包涵體的可能原因如下： (1)在大量合成的目的蛋白rRv〇220、rRv2958c時，蛋白折疊過程中，大腸桿菌E. coliBL21內 參與蛋白正確折疊的因子不能滿足需求，因此產生包涵體；（2)當大腸桿菌E.coliBL21表達 了對其有毒性的蛋白時，rRv0220、rRv2958c所形成的包涵體是表達宿主菌的一種自身保護 行為。本發(fā)明通過以下方法進行改進：（1)降低IPTG誘導物濃度；（2)降低誘導溫度；（3)重新 提取測序成功的陽性菌重組質粒，更換原核表達菌E.coliRosetta。但重組蛋白仍以包涵體 形式進行表達。因此，本發(fā)明采用含8M尿素的溶解液溶解包涵體rRv0220、rRv2958c，經過Ni 柱純化的重組蛋白為變性蛋白，將變性蛋白置入透析袋，透析袋置于含氧化性和還原性谷 胱甘肽的透析液，使其折疊成正確的空間結構以恢復重組蛋白的生物學活性。
[0085]三、重組蛋白的免疫活性研究
[0086] 將30只8周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為PBS組、rRv0220組和rRv2958c組。經實驗 研究，rRv0220和rRv2958c均具有良好的免疫原性，能誘導小鼠產生特異性抗體。小鼠血清 中特異性IgG水平隨免疫次數增加呈上升趨勢。末次免疫小鼠兩周后，rRv0220和rRv2958c 組免疫小鼠血清IgG抗體的效價分別為1:12 800和1:12 800;經Westernblot檢測，兩種重 組蛋白均能與末次免疫的小鼠血清發(fā)生特異結合。
[0087] 總結：將rRv0220、rRv2958c重組蛋白經皮下多點注射法免疫雌性BALB/c小鼠，發(fā) 現rRv0220和rRv2958c蛋白均具有良好的免疫原性，能有效誘導免疫小鼠產生相應的抗體。 免疫第6周后IgG抗體效價分別為1:12800和1:12800，明顯高于對照組(P〈0.01) Western blot檢測的結果表明，兩種重組蛋白均能與免疫的小鼠血清發(fā)生特異結合。
[0088] 四、重組蛋白免疫反應性的臨床評價
[0089] 1、本實施例中所采用的人體血清及來源如下：
[0090] (1) TB陽性血清（痰涂片抗酸染色陽性，且經膠體金法檢測其抗MTB抗體陽性）70 份，來自衡陽市第三人民醫(yī)院檢驗科；
[0091] (2)肺炎支原體陽性血清(經膠體金法檢測其抗MTB抗體為陰性)32份，由南華大學 附屬第一醫(yī)院檢驗科提供；
[0092] (3)TB陰性血清（痰涂片抗酸染色為陰性，且經膠體金法確認MTB抗體和肺炎支原 體抗體均為陰性)57份，來自衡陽市第三人民醫(yī)院檢驗科。
[0093] 2、Western Blot檢測重組蛋白與臨床血清的免疫反應性
[0094] 將8份TB陽性血清混合，以1:200的比例稀釋作為一抗，Western Blot鑒定重組蛋 白rRv0220、rRv2958c與結核患者血清的反應性。
[0095] (1)將各蛋白在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，90V電泳30min，待樣品進入分離膠后， 調整電壓至120V電泳至發(fā)明所需時間，分別在目的蛋白相應的分子量處切膠；
[0096] (2)取PVDF膜稍大于膠的大小，PVDF膜在使用前在甲醇中浸泡10s，接著PVDF膜、轉 膜濾紙和切下的凝膠均浸泡于轉膜緩沖液中半小時。用半干轉膜儀將SDS-PAGE膠上的蛋白 經90mA 2h轉移至PVDF膜上；
[0097] (3)轉膜完畢，用含5 % BSA的封閉液4°C封閉過夜；
[0098] (4)加入TBST緩沖液洗膜3次，每次15min;
[0099] (5)PVDF膜與臨床血清（1:200稀釋)結合，室溫孵育2h;
[0100] (6)加入TBST緩沖液洗膜5次，每次15min;
[0101] (7)加入HRP標記的羊抗人IgG(l:10 000稀釋），室溫孵育45min;
[0102] (8)加入TBST緩沖液洗膜5次，每次15min;
[0103] (9)把增強型ECL化學發(fā)光劑均勻加在PVDF膜上，使用全自動化學發(fā)光圖像分析系 統拍照并保存。
[0104] 3、間接ELISA法評價重組蛋白與臨床血清的免疫反應性
[0105]以純化、鑒定并測定后的rRV〇220、rRv2958c為抗原包被ELISA微孔板，以臨床收集 的結核陽性血清、結核陰性血清和肺炎支原體陽性血清為一抗，間接ELISA法檢測臨床血清 中特異性IgG，具體步驟如下：
[0106] (1)包被:分別將純化的冰￥〇220、冰￥2958〇用?119.6的碳酸鹽緩沖液分別稀釋至 濃度為1 〇yg/mL，1 OOyL/孔，于4 °C包被過夜；
[0107] (2)洗滌：充分甩去ELISA微孔板中液體，加入TOST緩沖液（含0.05%TWeen-20的 PBS緩沖液，pH 7 ? 6)，100此/孔洗滌3次，拍干；
[0108] (3)封閉：按照200yL/孔加入含5%BSA的PBS緩沖液，37°C封閉2h;
[0109] (4)洗滌:重復步驟(2);
[0110] (5)孵育一抗:將臨床血清稀釋（1:500)后加入微孔板內，100此/孔，37°C孵育2h;
[0111] (6)洗滌:重復步驟(2);
[0112] (7)孵育二抗:將HRP標記的羊抗人IgG抗體稀釋（1:10 000)，加入微孔板中，50yL/ 孔，37°C孵育lh;
[0113] (8)洗滌:重復步驟(2);
[0114] (9)顯色:加TMB顯色劑A液和B液各50此，避光顯色10min后加入終止液終止反應；
[0115] (10)測定：用酶標儀測定各待測孔的A45Q值；以結核病陰性血清做陰性對照，以其 平均A 45Q+2S為陽性臨界值，測定孔A45Q值大于陽性界值為陽性，否則判為陰性;根據各重組 蛋白各臨床血清的反應情況，評價重組蛋白的免疫反應性。
[0116] 4、重組蛋白免疫反應性的臨床評價結果
[0117] 分別采用Western Blot和ELISA法檢測rRv0220、rRv2958c與臨床血清的免疫反應 性，檢測結果如圖5和圖6所示，結果表明rRv0220、rRv2958c用于檢測臨床血清具有較高的 特異性和敏感性：與膠體金法（38-16KDa)比較，rRv0220的特異性為98.6 %，敏感性為 98.3 %，總符合率均為98.4 % ; rRv2985c的特異性為100 %，敏感性為96.5 %，總符合率為 98.4%。檢測結果如下表所示：
[0118] 間接ELISA法檢測臨床血清的敏感性和特異性
【主權項】
1. 一種結核病血清學診斷試劑盒，該試劑盒中至少包括包被液、洗滌液、封閉液和終止 液，其特征在于試劑盒中還包含以下組分:重組蛋白rRv0220,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示；重組蛋白rRv2958c，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。2. 根據權利要求1所述的結核病血清學診斷試劑盒，其特征在于:所述包被液為0.05M 的碳酸鹽緩沖液，其pH為9.6;所述的洗滌液為含0.05 % Tween-20的TOST緩沖液，其pH為 7.6;所述封閉液為含5 %BSA的PBS緩沖液;所述的終止液為2mol/I^H2S04溶液。3. -種用于表達權利要求1中所述重組蛋白rRv0220的原核表達重組載體pET-28a/ Rv0220〇4. 一種用于表達權利要求1中所述重組蛋白rRv2958c的原核表達重組載體pET-28a/ Rv2958c〇5. 權利要求1所述的結核病血清學診斷試劑盒在制備檢測結核病病人血清中結核分枝 桿菌抗體試劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/569GK106053800SQ201610367677
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】曾焱華, 游曉攏, 王麗, 鄧湘贏
【申請人】南華大學