專利名稱：基因診斷的微流控芯片電泳無(wú)膠篩分體系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微流控芯片電泳技術(shù)，尤其涉及一種基因診斷的微流控芯片電泳無(wú)膠
篩分體系及其制備方法。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管電泳法已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA片段的分離。凝膠是毛細(xì)管電泳中常用 的電泳介質(zhì)，由于凝膠的粘度非常大，抗對(duì)流，能夠減小分離物質(zhì)的擴(kuò)散，能夠很好地限制 譜帶的展寬，分離效果很好，分離度高，柱效極高，廣泛應(yīng)用在科研及醫(yī)學(xué)疾病診斷中，特別 是在基因診斷中的PCR產(chǎn)物檢測(cè)以及DNA的序列測(cè)定中。然而毛細(xì)管電泳消耗樣品量大使 得PCR過(guò)程變長(zhǎng)，分離時(shí)間長(zhǎng)使得結(jié)果分析不迅速，靈敏度也不夠高，分析一次樣品需要30 分鐘以上。而且凝膠的粘度很大使得凝膠的填充很困難。凝膠電泳時(shí)容易造成柱內(nèi)氣泡， 從而使得毛細(xì)管壽命較短。 隨著微全分析系統(tǒng)的建立以及芯片實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展，根據(jù)毛細(xì)管中的電泳理論及技 術(shù)發(fā)展了一種微流控芯片電泳技術(shù)，同樣包括樣品的上樣與電泳分離。微流控芯片由于其 樣品消耗量小、反應(yīng)快、靈敏度高、成本低和制作周期短而得到廣泛應(yīng)用。針對(duì)微流控芯片 所具有的優(yōu)點(diǎn)及毛細(xì)管凝膠電泳所存在的缺點(diǎn)，希望能有一種適合于微流控芯片電泳的快 速基因診斷的無(wú)膠篩分體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，提供一種基因診斷的微流控
芯片電泳無(wú)膠篩分體系及其制備方法。 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 1、體系 以水為溶劑； 以MES-Tris為背景電解質(zhì)； 以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環(huán)氧乙稀及其 2 5種的混合物為篩分介質(zhì)； 以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2 4種的混合物為添加劑；MES-Tris的濃度范圍為10 300mmol/L的MES， 10 300mmol/L的Tris， pH為
5. 5 9. 0 ; 篩分介質(zhì)的濃度(篩分介質(zhì)的質(zhì)量/體系的體積)為0. 1% 5% ;
添加劑的濃度(添加劑的質(zhì)量/體系的體積)為0. 1 % 10% 。
其工作原理是MES(2-[N-嗎啉代]甲磺酸)和Tris(三羥甲基氨基甲烷)是一種很好的生物緩 沖液體系，pH范圍廣，可以從5. 5到9. O，具有很好的生物相容性。 與凝膠相比，羥丙基甲基纖維素(HPMC)等纖維素衍生物在低濃度下，O. 1% 5%
3范圍內(nèi)具有較低的粘度，特別是HPMC-5， 25t:下在2%的水溶液中，其粘度只有5cP，和水的
粘度在一個(gè)數(shù)量級(jí)上。高分子聚合物溶于水中后，分子相互纏繞，形成孔徑大小一致的網(wǎng)狀
結(jié)構(gòu)，孔徑的大小和聚合物的種類、分子的大小以及聚合物的濃度有關(guān)。在一定電場(chǎng)下，DNA
分子按照大小不同，在篩分介質(zhì)中運(yùn)行的速度不一樣，DNA分子小的運(yùn)動(dòng)速度快，DNA分子
大的運(yùn)動(dòng)速度慢，據(jù)此可以分離大小不一的PCR擴(kuò)增樣品。由于DNA分子在芯片電泳中的
遷移速度只與其分子大小有關(guān)，所以可根據(jù)其遷移時(shí)間來(lái)確定DNA片段的大小，從而實(shí)現(xiàn)
對(duì)PCR產(chǎn)物分析，以便確定對(duì)疾病的診斷。然而，僅僅只有纖維素衍生物等高分子聚合物充
當(dāng)篩分介質(zhì)時(shí)，緩沖液體系的篩分能力，也即可分辨出兩個(gè)相差最小的DNA片段的能力有
限，所以在此基礎(chǔ)上添加一些低分子的多羥基有機(jī)物，比如葡萄糖、甘油、甘露醇等，可以提
高篩分介質(zhì)的分離效率。纖維素衍生物具有很好的生物相容性，葡萄糖等多羥基有機(jī)物也
沒有毒性，對(duì)于PCR產(chǎn)物的分析檢測(cè)沒有毒性影響。 2、制備方法 本制備方法包括下列步驟 ①配制背景電解質(zhì) 稱量MES和TRIS，加入去離子水中，攪拌均勻，使得MES的濃度為10 300mmo1/ L， TRIS的濃度的濃度為10 300mmol/L ;利用pH計(jì)調(diào)節(jié)背景電解質(zhì)的pH，使其在5. 5
9. 0 ; ②加入篩分介質(zhì) 加入稱量好的篩分介質(zhì)，使篩分介質(zhì)的質(zhì)量/體系的體積為0. 1% 5% ; ③加入添加劑 根據(jù)需要加入添加劑，使添加劑的質(zhì)量/體系的體積為0. 1 % 10% 。 3、用途 本發(fā)明所提供的基因診斷的微流控芯片電泳無(wú)膠篩分體系，適合于分離臨床疾病 的PCR產(chǎn)物，從而對(duì)診斷疾病做出參考。 本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和積極效果 使用操作方便，篩分效果好，分離效率高。


圖1為分離100bp ladder DNA marker標(biāo)準(zhǔn)片段的微流控芯片無(wú)膠篩分電泳圖；
圖2為分離①X174-HaelIIDNA標(biāo)準(zhǔn)片段的微流控芯片無(wú)膠篩分電泳圖；
圖3為假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良所對(duì)應(yīng)基因的陰性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的微流控芯片無(wú) 膠篩分電泳圖； 圖4為假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良所對(duì)應(yīng)基因的陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的微流控芯片無(wú)
膠篩分電泳圖。
英譯漢 PCR : (Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈反應(yīng)，是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體 外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)； 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn) 倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA
4供分析研究和檢測(cè)鑒定。過(guò)去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時(shí)便可完成。PCR技 術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。
具體實(shí)施方式

—、體系 1、篩分介質(zhì)可以是一種高分子聚合物，也可以是多種高分子聚合物的混合物。
2、添加劑可以是一種低分子親水有機(jī)物，也可以是多種低分子親水有機(jī)物的混合 物。 二、實(shí)施例
1、實(shí)施例1 以MES-Tris(80mM MES，40mM Tris)為背景電解質(zhì)，pH為6. 12，以2%的羥丙基甲 基纖維素(HPMC-50，25°C 2%的水溶液下，其粘度為50cP)為篩分介質(zhì)構(gòu)成篩分體系。
實(shí)用該篩分體系成功的分離了 100bp ladder DNA marker標(biāo)準(zhǔn)片段，marker中的
六個(gè)片段都得到了基線分離，分離效果很好(圖1)。
2、實(shí)施例2 以MES-Tris(80mM MES， 40mMTris)為背景電解質(zhì)，p朋.12，以3. 5%的羥丙基纖維 素(HPC)為篩分介質(zhì)構(gòu)成篩分體系。使用該篩分體系成功地分離了①X174-HaelIIDNA標(biāo) 準(zhǔn)片段，其中的271bp和281bP這兩個(gè)帶得到了很好的分離(圖2)。同時(shí)，利用該體系對(duì) 假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良這種疾病的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了微流控芯片無(wú)膠篩分電泳分離。圖3 和圖4分別是利用該篩分體系對(duì)人體假肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良陰性樣品和陽(yáng)性樣品的電泳分離。 從圖3中可以看出，正常人的外顯子47含量比外顯子6和外顯子13的含量少，而從圖4中 的陽(yáng)性樣品檢測(cè)看出，外顯子47的含量比外顯子6和外顯子13的含量多，據(jù)此，根據(jù)樣品 電泳分離結(jié)果通過(guò)判斷外顯子47與外顯子6和外顯子13的含量多少就可以判斷出是否患 病。應(yīng)用這一無(wú)膠篩分體系進(jìn)行假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良的基因診斷，對(duì)臨床疾病診斷具有重 要意義。
權(quán)利要求
一種基因診斷的微流控芯片電泳無(wú)膠篩分體系，其特征在于以水為溶劑；以MES-Tris為背景電解質(zhì)；以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環(huán)氧乙稀及其2～5種的混合物為篩分介質(zhì)；以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2～4種的混合物為添加劑；MES-Tris的濃度范圍為10～300mmol/L的MES，10～300mmol/L的Tris，pH為5.5～9.0；篩分介質(zhì)的濃度為0.1％～5％；添加劑的濃度為0.1％～10％。
2. 按權(quán)利要求1所述體系的制備方法，其特征在于包括下列步驟① 配制背景電解質(zhì)稱量MES和TRIS，加入去離子水中，攪拌均勻，使得MES的濃度為10 300mmol/L， TRIS的濃度的濃度為10 300mmol/L ;利用pH計(jì)調(diào)節(jié)背景電解質(zhì)的pH，使其在5. 5 9. 0 ;② 加入篩分介質(zhì)加入稱量好的篩分介質(zhì)，使篩分介質(zhì)的質(zhì)量/體系的體積為0. 1% 5% ;③ 加入添加劑根據(jù)需要加入添加劑，使添加劑的質(zhì)量/體系的體積為0. 1% 10%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因診斷的微流控芯片電泳無(wú)膠篩分體系及其制備方法，涉及微流控芯片電泳技術(shù)。本體系是以水為溶劑；以MES-Tris為背景電解質(zhì)；以羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、聚乙烯醇或聚環(huán)氧乙烯及其2～5種的混合物為篩分介質(zhì)；以葡萄糖、甘油、甘露醇或殼聚糖及其2～4種的混合物為添加劑。本制備方法是①配制背景電解質(zhì)；②加入篩分介質(zhì)；③加入添加劑。本發(fā)明使用安全方便，分離效率高，效果好；適合于分離臨床疾病的PCR產(chǎn)物，從而對(duì)診斷疾病做出參考。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101693925SQ20091027243
公開日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者劉威, 翁毅 申請(qǐng)人:武漢普賽微流科技有限責(zé)任公司;