一種分離調(diào)控花生胚發(fā)育基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離調(diào)控花生胚發(fā)育基因的方法，屬于功能基因組學(xué)領(lǐng)域，所述AhHsfa4A基因序列如SEQIDNO:1所示，將篩選得到受鈣誘導(dǎo)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的密切相關(guān)重要基因AhHsfa4A，并通過改良的RACE技術(shù)從所構(gòu)建的全組織全長文庫得到了AhHsfa4A基因的全序列。本發(fā)明建立了一種高效篩選缺鈣誘導(dǎo)的花生早期胚重要基因的方法（SSHaLL）并利用該方法篩選到一個(gè)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A并對其進(jìn)行了表達(dá)鑒定。該發(fā)明為高效篩選花生胚發(fā)育的重要差異表達(dá)基因，從而進(jìn)一步闡明花生胚發(fā)育的分子機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利說明】一種分離調(diào)控花生胚發(fā)育基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分離調(diào)控花生胚發(fā)育基因的方法，屬于功能基因組學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果、衰老和死亡等生命過程伴隨著復(fù)雜的生理生化變化，是植物體內(nèi)基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果?；虻牟町惐磉_(dá)與組織、細(xì)胞的生物學(xué)性狀和功能密切相關(guān)，成為生命科學(xué)的重要研究課題。比較不同細(xì)胞或不同基因型在基因表達(dá)上的差異，不僅是研究生命過程分子機(jī)制的基礎(chǔ)，亦是分離克隆目的基因的前提。分離差異表達(dá)基因?qū)τ诹私?和揭示植物體的生長發(fā)育規(guī)律，進(jìn)而進(jìn)行生物的改良、抗逆、抗病等研究具有重要的意義。目前尋找差異表達(dá)基因成為功能基因研究的一個(gè)非常重要的內(nèi)容。
[0003]目前分離差異表達(dá)基因的技術(shù)主要包括mRNA差異顯不(differential displayof reverse transcriptase-polymerase chain reaction, DDRT-PCR)> 代表性差異分析(representational difference analysis, RDA)、消減雜交(subtractive hybridization,SH)、抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization, SSH)、基因表達(dá)的序列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、基因芯片技術(shù)(DNA microarray)及轉(zhuǎn)錄組測序。
[0004]mRNA差異顯示(DDRT-PCR)是一種極其有效的研究差異基因的方法，該方法簡單、快速，靈敏度高、重復(fù)性好、所需起始材料少、同時(shí)可在多個(gè)材料之間或不同處理材料之間進(jìn)行比較等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)顯示多種生物性狀的差異及同時(shí)獲得高豐度和低豐度表達(dá)的基因等優(yōu)點(diǎn)。在分離與植物胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、信號傳導(dǎo)、植物抗逆、抗病蟲等相關(guān)的基因方面得到了廣泛應(yīng)用。但是假陽性率高，特異的cDNA片段太短且差異片段一般需要變性聚丙烯酰胺凝膠分離嚴(yán)重限制了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年來，大型熒光差異顯示系統(tǒng)的出現(xiàn)，在一定程度上克服了這些不足，但是設(shè)備價(jià)格昂貴，使其不能普及使用，依然制約了它的發(fā)展。代表性差異分析(RDA)的出現(xiàn)，避免了一些無關(guān)基因被篩選和克隆，克服了 mRNA差異顯示方法中易于出現(xiàn)的假陽性率高的問題，減少了后續(xù)基因片段鑒定的工作量和挑選差異克隆的隨意性，同時(shí)RDA還可使mRNA差異顯示方法中難以顯示的稀有mRNA的cDNA得以富集，更具有代表性、富集效率更高。目前，該方法已經(jīng)在動(dòng)物、人類及植物的基因克隆中發(fā)揮作用。但是它步驟繁多，工作量大，周期長，易被污染，這些缺點(diǎn)也成為RAD在實(shí)際應(yīng)用中的限制因素。
[0005]基因表達(dá)的序列分析(SAGE)通過快速而詳細(xì)地分析成千上萬個(gè)EST來尋找出表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組表達(dá)信息。它不但能快速、詳細(xì)地同時(shí)分析成千上萬個(gè)基因轉(zhuǎn)錄子的豐富信息，還能發(fā)現(xiàn)新基因，因此是基因表達(dá)定性和定量研究的一種有效工具。但是該方法操作較為復(fù)雜，這成為該技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)主要限制因素?；蛐酒夹g(shù)(DNA microarray)是近年發(fā)展起來的一種新型實(shí)用的高新生物技術(shù)，已成為目前國際上生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。其突出特點(diǎn)是具有高度的并行性、多樣性、微型性和自動(dòng)化，已成為高效、快速、大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段。雖然基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行檢測、樣品用量少、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)，但是仍然存在許多不足之處，如靶分子濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度及溫度等對雜交的動(dòng)力學(xué)影響，探針對雜交體的穩(wěn)定性影響還不是很清楚。目前存在的主要問題是芯片制作與分析系統(tǒng)的價(jià)格較昂貴，使其實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。SSH是基于PCR技術(shù)的簡單有效的分離差異表達(dá)基因的技術(shù)，具有較明顯的優(yōu)越性:(1)操作簡便、周期短:SSH方法設(shè)計(jì)巧妙，操作簡便，前后只需3~4天，即可得到PCR擴(kuò)增的差減cDNA群體。由于巧妙地引入抑制PCR擴(kuò)增，擺脫了傳統(tǒng)的物理方法分離單雙鏈這一繁瑣困難的操作，能選擇性地?cái)U(kuò)增目的cDNA片段，使目的分子得到有效富集。(2)具有高度敏感性:SSH方法可以使低豐度的mRNA得以高于I OOO倍的富集，較適于在轉(zhuǎn)錄水平上研究生物受生物或非生物逆境脅迫后基因的差異表達(dá)。(3)效率高:一次SSH反應(yīng)可同時(shí)分離上百至上千個(gè)差異表達(dá)的基因片段。適用于大規(guī)模的基因表達(dá)分析。(4)組織特異性cDNA能被用作雜交篩選的探針，這使得該技術(shù)在克隆差異表達(dá)基因方面更為通用。(5)提高了基因差異表達(dá)的特異性，降低了假陽性率:這是該方法的最大優(yōu)點(diǎn)。以抑制PCR為基礎(chǔ)，補(bǔ)平接頭后非特異的基因片段由于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)不能被擴(kuò)增，較高程度地分離了特異cDNA片段。
[0006]當(dāng)前，SSH cDNA文庫的篩選方法主要是基于PCR技術(shù)的點(diǎn)陣膜雜交。該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、價(jià)格昂貴。因此，開發(fā)一種簡單、高效的從SSH cDNA文庫中篩選差異表達(dá)基因的技術(shù)具有很重要的意義。
[0007]鈣對花生莢果的發(fā)育產(chǎn)生重要作用。當(dāng)莢果在結(jié)實(shí)區(qū)內(nèi)不能獲得足夠的鈣時(shí)，雖然能夠膨大、成熟，但飽滿度降低，空殼率增加。缺鈣不僅嚴(yán)重影響花生莢果的發(fā)育，而且引起花生莢果出現(xiàn)某種病害。長期以來，花生胚敗育而出現(xiàn)大量空莢導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)的現(xiàn)象長期困擾著我省尤其是沿海地區(qū)砂質(zhì)土壤的花生生產(chǎn)，其中一個(gè)主要原因是土壤缺鈣。福建省紅黃壤酸性強(qiáng)，土壤鹽基飽和度低，加上南方雨水多，易造成鈣元素大量淋失。這種現(xiàn)狀嚴(yán)重地制約當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)民增收。然而，花生胚胎發(fā)育的分子機(jī)理，特別是缺鈣導(dǎo)致的花生胚胎敗育的分子機(jī)理尚未明確。因此，分離缺鈣條件下花生胚中的差異表達(dá)基因?qū)τ诮沂净ㄉ咛グl(fā)育的分子機(jī)理具有重要意義。
[0008]本發(fā)明針對以上研究背景，建立了一種高效篩選缺鈣誘導(dǎo)的花生早期胚重要基因的方法(SSHaLL)并利用該方法篩選到一個(gè)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A并對其進(jìn)行了表達(dá)鑒定。該發(fā)明為高效篩選花生胚發(fā)育的重要差異表達(dá)基因，從而進(jìn)一步闡明花生胚發(fā)育的分子機(jī)理奠定了良好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種分離調(diào)控花生胚發(fā)育基因的方法，建立了一種高效篩選缺鈣誘導(dǎo)的花生早期胚重要基因的方法(SSHaLL)并利用該方法篩選到一個(gè)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的重要基因4--/?辦并對其進(jìn)行了表達(dá)鑒定。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種調(diào)控花生胚發(fā)育重要基因，基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0011] 一種調(diào)控花生胚發(fā)育基因的分離方法，篩選得到受鈣誘導(dǎo)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的密切相關(guān)重要基因4--/?辦，并通過改良的RACE技術(shù)從所構(gòu)建的全組織全長文庫得到了 AhHsfa4A基因的全序列。
[0012]qRT-PCR鑒定所述基因在缺、足鈣誘導(dǎo)的花生早期胚中及花生果針入土不同時(shí)期花生胚中必的表達(dá)。
[0013]所述的入土不同時(shí)期為10、20、30、40、50、60DAP。
[0014]所述的4--/?辦基因可用于研究花生胚發(fā)育的機(jī)理。
[0015]本發(fā)明的高效篩選差異表達(dá)基因的SSHaLL方法主要是在構(gòu)建SSH cDNA文庫基礎(chǔ)上，利用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者文庫構(gòu)建過程中實(shí)驗(yàn)組或驅(qū)動(dòng)組二次PCR產(chǎn)物以地高辛標(biāo)記探針，用菌落雜交進(jìn)行文庫篩選。具體來說本發(fā)明利用SSH技術(shù)構(gòu)建了缺、足鈣條件下花生早期胚的正反向抑制消減雜交文庫，經(jīng)鑒定后利用菌落雜交的方法進(jìn)行文庫篩選，通過對比缺鈣、足鈣探針雜交缺鈣差異cDNA文庫的信號差別，找出缺鈣條件下差異表達(dá)的克隆，進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析。
[0016]本發(fā)明的利用高效篩選差異表達(dá)基因的SSHaLL方法篩選得到的引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的重要基因4--/?辦，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。利用qRT-PCR的方法對其在 缺、足鈣條件下的花生胚發(fā)育不同時(shí)期(6、9、15、30DAP)及正常條件下花生胚發(fā)育不同時(shí)期(10、20、30、40、50、60DAP)中的表達(dá)情況進(jìn)行了鑒定和分析。在正常條件下，花生果針入土 15d之前，該基因在花生胚中表達(dá)量很低，在30DAP時(shí)表達(dá)量急劇增加，之后下降并一直保持表達(dá)量較低的水平。缺鈣條件下該基因在6、9、15DAP時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)一定的誘導(dǎo)，但在30DAP時(shí)表達(dá)量急劇下降。即在缺鈣脅迫初期，該基因受到誘導(dǎo)表達(dá)量有增加的趨勢，這是植物的防御反應(yīng)。但是當(dāng)花生胚到了迅速生長發(fā)育階段，缺鈣條件下該基因表達(dá)量急劇下降，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的生物化學(xué)過程，從而導(dǎo)致了花生胚的細(xì)胞性程序死亡。
[0017]本發(fā)明的篩選差異表達(dá)基因的SSHaLL方法簡單、經(jīng)濟(jì)、高效，為進(jìn)一步高效篩選與花生胚發(fā)育相關(guān)的重要功能基因奠定了基礎(chǔ)。利用該方法篩選得到的辦基因能夠引起花生早期胚的程序性細(xì)胞死亡。這為闡明缺鈣導(dǎo)致花生胚敗育的分子機(jī)制提供了有力的證據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為缺、足鈣條件下花生胚發(fā)育對比圖；A為足鈣條件下花生胚發(fā)育正常；B為缺鈣條件下花生果針入土 15d之前外觀發(fā)育正常，但30d時(shí)表現(xiàn)空癟；C.(a)足鈣條件下花生成熟莢果飽滿(b)缺鈣條件下花生成熟莢果胚敗育；其中A、B分別5 mm，C為10 mm。
[0019]圖2為缺鈣誘導(dǎo)的花生早期胚抑制消減雜交文庫菌落雜交結(jié)果；A為足鈣探針雜交缺鈣差異文庫.B為缺鈣探針雜交。
[0020]圖3為AhHsfA4a基因在缺、足鈣條件下的表達(dá)鑒定。(圖A，為花生汝/基因在足鈣下的相對表達(dá)情況；圖B，為汝/基因在花生缺鈣下不同的時(shí)間的表達(dá)情況；圖C，為Hsf基因在缺足鈣的表達(dá)的對比。
【具體實(shí)施方式】
[0021]【實(shí)施例1】缺、足鈣花生早期胚總RNA的提取
以福建農(nóng)林大學(xué)油料所選育的花生優(yōu)良品種閩花6號為材料，在福建省平潭縣選擇典型缺鈣的花生空莢產(chǎn)地，土壤中可交換鈣含量為49.54 ug/kg,以此水平為缺鈣處理，在此基礎(chǔ)上，每畝施石灰75kg，土壤中可交換鈣含量達(dá)129.61 mg/kg(引起花生缺鈣的土壤中可交換鈣含量為100mg/kg)，以此為足鈣處理。取缺、足鈣條件下花生果針入土后的第6、9、15天的幼果，剝?nèi)∮着哐杆偻度胍旱?，貯于_80°C備用。將1.7mlCTAB抽提液(65°C)與80μ I巰基乙醇預(yù)熱至65°C ;加入研磨好的材料，潤旋2min,65°C溫浴15_30min,其間顛倒混勻3-4次，加入1/10體積的無水乙醇，1/10體積的3MKAc，等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:I)，于室溫下顛倒混勻lOmin。4°C, 12000r/min離心15min ;取上清,加入等體積的氯仿/異戍醇(24:1),于室溫下顛倒混勻10分鐘。4°C, 12000r/min離心15min。上清液加1/3體積的 IOmol.L-1 LiCl, -80°C過夜沉淀;4°C, 12000r/min 離心 15min,棄上清，用 75% 乙醇洗滌I次，室溫干燥或者真空干燥沉淀；加入TE (10 mmol.I Tris-HCl pH8.0.1 mmol/LEDTA)溶解沉淀，再加入等體積水飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，混勻，12000 r / min離心15 min，移上清至新離心管；上清液加1/3體積的IOmol.L-1 LiCl，_80°C沉淀Ih ；4°C,12000r/min離心15min，棄上清，用75%乙醇洗滌2次。室溫干燥，或者真空干燥后保存于水或適量去離子甲酰胺中，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]【實(shí)施例2】抑制消減雜交文庫的構(gòu)建
缺、足鈣條件下花生早期胚抑制消減雜交文庫的構(gòu)建按照PCR-SelectTM cDNASubtraction Kit 試劑盒(BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA)進(jìn)行。當(dāng)缺鈣條件下花生早期胚為檢測組時(shí)，足鈣條件下花生早期胚為驅(qū)動(dòng)組；反之，當(dāng)足鈣條件下花生早期胚為檢測組時(shí)，缺鈣條件下花生早期胚為驅(qū)動(dòng)組。分別取檢測組與驅(qū)動(dòng)組I μ g mRNA按照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,檢測組 cDNA 用Tfea I 于 37。C 酶切 1.5 h,之后于 16。C，過夜連接接頭 I (5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3 ’/5 ’ -TGGACGGGCC-3 ’)與 2R (5 ’ -CTMTACGACTCACTATAGGGCAGCGTG GTCGCGGCCGAGGT-3，/5，-TGGAGCCGGC-3 ’)。之后驅(qū)動(dòng)組cDNA分別加入每一個(gè)檢測組樣本中，加入雜交液。上述混合液經(jīng)高溫變性后，于68° C退火雜交8h。將第一次雜交后的兩個(gè)樣本混合，加入新的變性的驅(qū)動(dòng)組cDNA于68° C雜交過夜。用巢式引物(Nested PCR primerl:5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ ; Nested PCR primer2R: 5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增差異表達(dá)基因。消減后的差異cDNA連接到pGEM-T Easy載體(Promega，Madison, WI)中，電擊(BTX ECM 630)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，將菌液均勻涂布于LB培養(yǎng)基(含有100mg/L Amp與X-gal/IPTG)中放于37° C過夜培養(yǎng)。
[0023]【實(shí)施例3】缺鈣誘導(dǎo)的花生早期胚抑制消減雜交文庫的篩選
分別取2 μ g消減后的缺、足鈣條件下花生早期胚雙鏈cDNA，用DIG-dUTP (Roche)根據(jù)DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche)進(jìn)行探針標(biāo)記。分別取I μ I _70°C保存的擴(kuò)增文庫，用LB液體培養(yǎng)基分別稀釋至IO3, IO4,105，分別取I μ 1，加Λ 100 μ I液體LB，涂在含100 μ g/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基平板上，過夜培養(yǎng)后，計(jì)算長出的克隆數(shù)。將Hybond-N+尼龍膜(Amersham)鋪在含有100 μ g/ml氨芐的LB平板上，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。根據(jù)滴度檢測結(jié)果，按照每板2000 clones取適量的文庫菌液均勻涂板，于超凈臺(tái)上吹干，大約lh，放于37°C培養(yǎng)箱過夜。超凈臺(tái)上鋪一層保鮮膜，上面放一張15cm的高壓滅菌過的濾紙，用鑷子夾起主膜，輕輕鋪在濾紙上。將一新的雜交膜鋪在新的氨芐板上，濕潤后，用鑷子輕輕夾起，小心鋪在主膜上，使之與主膜完全吻合，之后，在上面鋪一層濾紙，用手輕輕壓進(jìn)行復(fù)制。然后用針頭在邊緣處扎三個(gè)孔，用鉛筆作標(biāo)記。完后，將主膜與copyl都放在新的氨芐板上于37°C培養(yǎng)。每張主膜復(fù)制兩張即Copyl，Copy2。主膜板培養(yǎng)3-5h后拿出，放于4°C保存；Copy膜培養(yǎng)數(shù)小時(shí)直至克隆大小合適時(shí)為止,之后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。分別用 Solutionl (0.5MNaOH, 1.5M NaCl)與 Solution2 (0.5M Tris, 1.5M NaCl)處理長有克隆的尼龍膜7min，之后用Solution3 (0.4MNaOH), Solution4 (4XSSPE)各處理7min，于80°C烘干lh。將膜置于雜交管中，用磷酸鈉/SDS緩沖液(2% (w/v) SDS, 0.15M Sodium Phosphate, pH 7)洗膜。加入預(yù)熱的雜交液(1% (w/v) BSA, ImMEDTA, 7% (w/v)SDS, 0.5 M Sodium Phosphate, pH 7)于65° C進(jìn)行預(yù)雜交lh。倒掉預(yù)雜交液,加入新的含有50ng/ml的預(yù)熱的雜交液20ml，65° C雜交過夜。倒掉并收集含有探針的雜交液(可重復(fù)利用)。用磷酸鈉/SDS 緩沖液(2% (w/v) SDS, 0.15 M Sodium Phosphate, pH 7)于 65° C 洗膜三次，每次 lOmin，用 TST(0.1% (v/v) Tween 20, 0.5 MNaCl, 25mMTris-Cl, ρΗ7.5)于室溫洗膜三次，每次 5min。用 TST plus Milk(0.1% (v/v) Tween 20, 4% (w/v) Powered Milk, 0.5M NaCl, 25mMTris-Cl, pH 7.5)于室溫洗膜 5min。在含有 1:10，000 的 Ant1-DigoxigeninAlkaline Phosphatase 的 TST plus Milk 中培養(yǎng) lh。用 TST 洗三次。然后置于 Detectionbuffer (0.1 MTris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5)中，之后按照 DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit II進(jìn)行免疫檢測。通過對比缺韓、足韓探針雜交缺韓差異cDNA文庫的信號差別，找出缺鈣條件下差異表達(dá)的克隆，重新?lián)u菌，做穿刺培養(yǎng)后送上海生工測序。
[0024]【實(shí)施例\'AhHsfA4a 的 qRT-PCR 鑒定
利用改良CTAB法分別提取缺、足鈣條件下花生早期胚(6，9，15，30 DAP)及正?；ㄉ甙l(fā)育不同時(shí)期(10，20，30，40，50，60DAP)的總RNA，分別取3 μ g用Primescript(TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照 SYBR Premix Ex Taq kit (Takara)用 Mastercylcer ep realplex(Eppendorf)以特異引物(Ah HsfA4a_RT_F:5，-CAAGCTCCACTGACAGAATCAG-3，)；Ah HsfA4a_RT_R 5’ -CAGGTTTCTGCAGTACACTGG A_3’ )進(jìn)行 qRT-PCR。按照 Λ Λ CT 法分析該基因在樣本中的表達(dá)情況。
[0025]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控花生胚發(fā)育重要基因，其特征在于:所述4--/?辦基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的調(diào)控花生胚發(fā)育基因的分離方法，其特征在于:篩選得到受鈣誘導(dǎo)引起花生早期胚細(xì)胞程序性死亡的密切相關(guān)重要基因4--/?辦，并通過改良的RACE技術(shù)從所構(gòu)建的全組織全長文庫得到了 4--/?辦基因的全序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2我所述的調(diào)控花生胚發(fā)育基因的分離方法，其特征在于:qRT_PCR鑒定所述基因在缺、足鈣誘導(dǎo)的花生早期胚中及花生果針入土不同時(shí)期花生胚中4--/?辦的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2我所述的調(diào)控花生胚發(fā)育基因的分離方法，其特征在于:所述的入土不同時(shí)期為 10、20、30、40、50、60 DAP。
5.一種如權(quán)利要求1所述的一種調(diào)控花生胚發(fā)育重要基因的應(yīng)用，其特征在于:所述mAhHsfei4A基因用于研究花生胚發(fā)育的機(jī)理。
【文檔編號】C12N15/10GK104004753SQ201410202769
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】莊偉建, 陳華, 張沖, 蔡鐵城, 周雙彪, 鄧燁 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)