專利名稱：E4bp4基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及E4BP4基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胚胎著床(又稱胚胎植入)是哺乳動物生殖過程中所特有的一個重要步驟，是指處于活化狀態(tài)的胚胎與處于接受態(tài)的子宮相互作用，最后導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜建立緊密聯(lián)系的過程。它是哺乳動物和人類特有的一個生殖生理步驟，也是進(jìn)行生育調(diào)控的理想環(huán)節(jié)。著床過程是一個復(fù)雜的生理過程，涉及胚胎與子宮間極其復(fù)雜而精細(xì)的協(xié)同作用，包括胚胎的發(fā)育、分化，子宮內(nèi)膜的同步變化，以及胚胎與子宮間的相互作用。研究和了解這些變化和相互作用的分子基礎(chǔ)，將有助于揭示細(xì)胞的生長、分化、遷移和侵入性，細(xì)胞間的相互識別、粘附、信息交換、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及局部免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受的形成等具共性的生理機(jī)制，因而能為發(fā)展生育調(diào)節(jié)新技術(shù)和腫瘤治療新技術(shù)提供新途徑和新思路。并且，因著床過程完成后才算真正懷孕，所以針對胚胎著床過程進(jìn)行生育調(diào)控，不存在倫理問題，是一個理想的生育調(diào)控作用環(huán)節(jié)。
腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白-4基因(E4BP4，adenovirus E4 promoter-bindingprotein 4)，又名NFIL3或NFIL3/E4BP4。最初被發(fā)現(xiàn)能識別和抑制腺病毒E4啟動子，并因此而得名，它是一種由462個氨基酸構(gòu)成的蛋白分子，為DNA結(jié)合蛋白bZIP轉(zhuǎn)錄因子超家族的成員之一(Cowell，I.G.，1992，Transcriptionalrepression by a novel member of the bZIP family of transcription factors.Mol.CellBiol.，123070-3077)，可通過與cAMP應(yīng)答元件/活性轉(zhuǎn)錄因子樣位點(diǎn)結(jié)合而抑制啟動子的活性。目前已在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)E4BP4蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖的作用，包括造血細(xì)胞(Kuribara.，R.等，1999，Two distinctinterleukin-3-mediated signal pathways，Ras-NFIL3(E4BP4)and Bcl-xL，regulatethe survival of murine pro-B lymphocytes.Mol.Cell Biol.，192754-2762)、血管平滑肌細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞(Cowell，I.G.，2002，E4BP4/NFIL3，a PAR-related bZIPfactor with many roles.Bioessays，241023-1029.)、神經(jīng)元細(xì)胞(Junghans，D.，S.Chauvet，E.Buhler，K.Dudley，T.Sykes&C.E.Henderson，2004，The CES-2-related transcription factor E4BP4 is an intrinsic regulator of motoneuron growthand survival.Development，1314425-4434)等。同時，細(xì)胞內(nèi)鈣離子可以通過CaM途徑誘導(dǎo)E4BP4基因的表達(dá)，而且Th2細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)對E4BP4基因的表達(dá)也有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，E4BP4蛋白分子可能通過與誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)基因啟動子結(jié)合而抑制該基因的表達(dá)。
雖然已有研究報(bào)道表明，在大鼠胚胎中也有E4BP4基因的表達(dá)，并在胚胎神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)量最高，是一種參與調(diào)節(jié)運(yùn)動神經(jīng)元存活和生長的胚胎內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子(Junghans，D.，等，2004，The CES-2-related transcription factorE4BP4 is an intrinsic regulator of motoneuron growth and survival.Development，1314425-4434.)，但至今未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于E4BP4基因及其表達(dá)產(chǎn)物參與調(diào)控胚胎著床過程的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供E4BP4基因的一種新的用途，用于調(diào)控胚胎著床(即胚胎植入)過程。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種E4BP4基因或其編碼蛋白的用途，所述的E4BP4基因或其編碼蛋白被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種E4BP4基因或其編碼蛋白的用途，所述的E4BP4基因或其編碼蛋白被用于制備調(diào)節(jié)胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種E4BP4拮抗劑的用途，所述的E4BP4拮抗劑被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種E4BP4拮抗劑的用途，所述的E4BP4拮抗劑被用于制備調(diào)節(jié)胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)胚胎著床的藥物選自避孕藥、或輔助生育藥。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的拮抗劑是E4BP4的反義核酸、或抗E4BP4多肽的抗體。
在另一優(yōu)選例中，在胚胎著床前期(對于人，于月經(jīng)周期第19天～第24天)，給予所述的E4BP4拮抗劑，阻斷E4BP4基因的表達(dá)，或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，從而抑制胚胎著床，達(dá)到避孕目的。
在另一優(yōu)選例中，在胚胎著床后期(對于人，于月經(jīng)周期第26天～第28天)，給予所述的E4BP4拮抗劑，阻斷E4BP4基因的表達(dá)，或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，從而促進(jìn)胚胎著床，達(dá)到輔助生育目的。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種E4BP4激動劑的用途，所述的E4BP4激動劑被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種E4BP4激動劑的用途，所述的E4BP4激動劑被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的藥物選自避孕藥、或輔助生育藥。
在另一優(yōu)選例中，在胚胎著床前期(對于人，于月經(jīng)周期第19天～第24天)，給予所述激動劑，促進(jìn)E4BP4基因的表達(dá)，或向細(xì)胞內(nèi)定向?qū)隕4BP4蛋白或其類似物，可促進(jìn)胚胎的著床，從而達(dá)到輔助生育目的。
在另一優(yōu)選例中，在胚胎著床后期(對于人，于月經(jīng)周期第26天～第28天)，給予所述激動劑，促進(jìn)E4BP4基因的表達(dá)，或向細(xì)胞內(nèi)定向?qū)隕4BP4蛋白或其類似物，可抑制胚胎的著床，從而達(dá)到避孕目的。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種藥物組合物，它含有安全有效量的E4BP4多肽、其激動劑或其拮抗劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了不同孕期小鼠子宮和胚胎組織中E4BP4基因表達(dá)水平的Northern印跡分析。其中，1未孕成年雌小鼠子宮；2孕第1天小鼠子宮；3孕第2天小鼠子宮；4孕第3天小鼠子宮；5孕第4天小鼠子宮；6孕第6天小鼠子宮著床位點(diǎn)；7孕第6天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；8孕第7天小鼠子宮著床位點(diǎn)；9孕第7天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；10孕第7天小鼠胚胎；11孕第8天小鼠子宮著床位點(diǎn)；12孕第8天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；13孕第8天小鼠胚胎；14孕第9天小鼠子宮著床位點(diǎn)；15孕第9天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；16孕第9天小鼠胚胎。
圖2顯示了孕早期小鼠子宮組織中E4BP4蛋白表達(dá)水平的Western印跡分析。其中，(A)各樣品的Western印跡，(B)各樣品的考馬斯亮藍(lán)染色。1未孕成年雌小鼠子宮；2孕第2天小鼠子宮；3孕第3天小鼠子宮；4孕第4天小鼠子宮；5孕第6天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；6孕第6天小鼠子宮著床位點(diǎn)；7孕第7天小鼠子宮非著床位點(diǎn)；8孕第7天小鼠子宮著床位點(diǎn)。
圖3顯示了小鼠子宮組織中E4BP4 mRNA的原位(in situ)雜交分析。其中，A.孕第1天子宮；B.孕第4天子宮；C.孕第5天子宮著床位點(diǎn)；D.孕第6天子宮著床位點(diǎn)；E.孕第7天子宮著床位點(diǎn)；F.孕第8天子宮著床位點(diǎn)；G.人工蛻膜化對照子宮組織；H.人工蛻膜化子宮組織；I.孕第8天子宮著床位點(diǎn)(陰性對照)。并且，圖中1為子宮腔；g為腺體；sc為基質(zhì)細(xì)胞；dc為蛻膜細(xì)胞；em為胚胎；標(biāo)尺＝10μm。箭頭所指處為雜交信號。
圖4顯示了E4BP4蛋白在著床期小鼠子宮組織中的表達(dá)。其中，A.孕第5天子宮非著床位點(diǎn)；B.孕第5天子宮著床位點(diǎn)；C.孕第6天子宮非著床位點(diǎn)；D.孕第6天子宮著床位點(diǎn)；E.孕第6天子宮著床位點(diǎn)(陰性對照)；F.孕第7天子宮著床位點(diǎn)。并且，圖中1為子宮腔；g為腺體；sc為基質(zhì)細(xì)胞；dc為蛻膜細(xì)胞；em為胚胎；標(biāo)尺＝10μm。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白-4基因(E4BP4基因)參與調(diào)控胚胎著床過程中的蛻膜化反應(yīng)，從而可調(diào)控胚胎的著床。基于此完成本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“E4BP4蛋白”、“E4BP4多肽”、“E4BP4因子”或“腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白-4”等可互換使用，都指具有腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白-4氨基酸序列(如SEQ ID NO2和SEQ ID NO4)的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，這些術(shù)語還包括在其他哺乳動物(如狗、牛、羊、猴)中的具有調(diào)控胚胎著床功能的同系物或同源蛋白。
小鼠E4BP4基因cDNA序列(GenBank登錄號AY061760)如SEQ ID NO1；其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4。人E4BP4基因cDNA序列(GenBank登錄號X64318)如SEQ ID NO3；其編碼的氨基酸序列如SEQ IDNO4。小鼠E4BP4基因與人E4BP4基因具有同源性。小鼠E4BP4基因cDNA序列中的第1位堿基“T”至第1397位“T”的長度為1397bp的cDNA序列與人E4BP4基因cDNA序列中的第208位堿基“T”至第1604位“T”的長度為1397bp的cDNA序列有79％的同源性。小鼠E4BP4基因編碼的氨基酸序列(462 aa)與人E4BP4基因編碼的氨基酸序列(462aa)有81％的同源性。
人和小鼠的E4BP4蛋白分子中都含有2個功能區(qū)域，第一個功能域是由53個aa殘基組成的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(basic region leucin zipper，BRLZ)(氨基酸序列下劃線標(biāo)出的第一段序列)；第二個功能域是由333個aa殘基組成的受白介素-3調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子序列(Vertebrate interleukin-3 regulated transcriptionfactor)(氨基酸序列下劃線標(biāo)出的第二段序列)。
應(yīng)理解，由于人和鼠等哺乳動物的E4BP4蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領(lǐng)域常規(guī)的DNA重組技術(shù)而獲得其蛋白。
一類特別優(yōu)選的蛋白是E4BP4類似物，即在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴等)中E4BP4的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)E4BP4的序列，通過雜交或擴(kuò)增的方法而獲得，進(jìn)而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。
如本文所用，“分離的E4BP4蛋白或多肽”是指E4BP4多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化E4BP4多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括E4BP4多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然E4BP4因子相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“E4BP4多肽”指具有調(diào)控胚胎著床功能的E4BP4因子活性的SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與E4BP4因子相同功能的、SEQ ID NO2或SEQ ID NO4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括E4BP4因子的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與E4BP4 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗E4BP4多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含E4BP4多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了E4BP4多肽的可溶性片段。通常，該片段具有E4BP4多肽序列的至少約50個連續(xù)氨基酸，通常至少約100個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約150個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約200個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約300個連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還涉及E4BP4多肽的類似物。這些類似物與天然E4BP4多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明的E4BP4核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
E4BP4多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接作為調(diào)控胚胎的著床過程的藥物，比如通過阻斷E4BP4基因的表達(dá)，或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，影響子宮內(nèi)膜的蛻膜化而干擾胚胎的著床過程，從而達(dá)到避孕目的；以及用于篩選促進(jìn)或?qū)笶4BP4因子功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組E4BP4因子篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激E4BP4因子功能的多肽分子。另一方面，本發(fā)明還包括對E4BP4 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于E4BP4基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與E4BP4基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制E4BP4因子的分子，也包括那些并不影響E4BP4因子功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的E4BP4基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的E4BP4基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)E4BP4因子或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷E4BP4功能的抗體以及不影響E4BP4功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用E4BP4基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與E4BP4基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗E4BP4的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的E4BP4。
本發(fā)明中的抗體作為E4BP4的拮抗劑，還可用于抑制胚胎著床，從而用于避孕。給予適當(dāng)劑量的抗體可以阻斷E4BP4的產(chǎn)生或活性。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與E4BP4生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。例如，能與E4BP4結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、透皮、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、陰道內(nèi)或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明E4BP4多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的E4BP4蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
E4BP4的多聚核苷酸也可用于多種治療目的，通過調(diào)節(jié)E4BP4的表達(dá)來調(diào)節(jié)受孕和避孕。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測E4BP4水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，包括放射免疫測定等方法。試驗(yàn)中所檢測的E4BP4水平，可以用作解釋E4BP4因子在不孕等疾病中的重要性和用于診斷。
一種檢測檢測樣品中是否存在E4BP4因子的方法是利用E4BP4因子的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與E4BP4因子特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在E4BP4因子。
E4BP4基因主要在妊娠早期的小鼠子宮內(nèi)膜子宮腔周圍的基質(zhì)細(xì)胞及其蛻膜化后形成的初級蛻膜細(xì)胞中表達(dá)，而未受孕小鼠子宮組織中則未檢測到該基因的表達(dá)。在妊娠初始期，E4BP4基因的表達(dá)水平最初是隨著孕期的增加而逐步提高，至孕第6天(以查見陰栓為孕第1天)，即胚胎著床后期和原羊膜腔形成期，其表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后開始降低，至孕第9天，即使在胚胎著床位點(diǎn)也已檢測不到該基因的表達(dá)。同時，E4BP4基因在人工誘導(dǎo)蛻膜化的假孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化區(qū)也有較高水平的表達(dá)，表明該基因的表達(dá)與基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化有關(guān)。
由于蛻膜與母胎間的營養(yǎng)供應(yīng)和免疫耐受有關(guān)，因此子宮內(nèi)膜的蛻膜化對于妊娠的建立和維持至關(guān)重要。在蛻膜化過程中，蛻膜細(xì)胞是以不依賴于胚胎的形式同時經(jīng)歷增殖和凋亡。由于目前已在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)E4BP4具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖的作用，因此可知，在小鼠孕第1天-孕第4天期間，E4BP4基因在子宮組織中的表達(dá)逐步增強(qiáng)，有助于基質(zhì)細(xì)胞的增殖，為蛻膜化作準(zhǔn)備；在孕第5天和孕第6天，E4BP4基因主要在蛻膜細(xì)胞中的高表達(dá)，將有效抑制蛻膜細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)蛻膜的形成；而自孕第7天開始，E4BP4基因在蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)急速下調(diào)，則有助于蛻膜的退化，以協(xié)調(diào)蛻膜細(xì)胞的數(shù)量和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜組織的侵潤性。此外，因E4BP4蛋白可通過與誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)基因啟動子的結(jié)合而抑制iNOS基因的表達(dá)(見Wallace等人，BBRC232403，1997)，因此，E4BP4基因在孕第6天后的表達(dá)水平快速下調(diào)，將有利于iNOS基因的高表達(dá)，從而能提高細(xì)胞內(nèi)NO的合成，促進(jìn)胚胎的著床。
因此，在胚胎著床前期，如果能阻斷E4BP4基因的表達(dá)，或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，就可能通過影響子宮內(nèi)膜的蛻膜化而干擾胚胎的著床過程，從而達(dá)到避孕目的。在胚胎著床后期，如果能促進(jìn)E4BP4基因的表達(dá)，或向細(xì)胞內(nèi)定向?qū)刖哂信cE4BP4蛋白相同生物功能的類似物，就可能通過抑制iNOS基因的表達(dá)而抑制胚胎的著床和胎兒的發(fā)育，同樣可達(dá)到抗著床避孕的目的。
此外，胚胎組織與腫瘤組織都是高度增殖和高度分化的組織，而且都屬于異常組織，并對正常機(jī)體組織有侵潤性，只是胚胎組織對子宮內(nèi)膜組織的侵潤是有限制的，而腫瘤組織對人體組織的侵潤是無限制的。鑒于E4BP4基因具有調(diào)節(jié)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜組織侵潤性的作用，因而其可能在調(diào)節(jié)腫瘤組織對機(jī)體組織的侵入方面中也具有潛在的應(yīng)用價值。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于首次發(fā)現(xiàn)腺病毒E4啟動子結(jié)合蛋白-4基因(E4BP4基因)及其表達(dá)產(chǎn)物參與調(diào)控胚胎著床中的蛻膜化反應(yīng)，因而為胚胎著床過程的控制提供了新的依據(jù)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1E4BP4基因的表達(dá)本發(fā)明人分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測和比較了E4BP4基因在小鼠圍著床期子宮組織中的表達(dá)狀況。取8～10周齡的成年ICR小鼠，雌、雄小鼠按2∶1比例合籠飼養(yǎng)，次日早晨通過檢查雌小鼠陰道栓以判斷是否交配，并以見栓當(dāng)日作為孕第1天。對于未孕雌小鼠，以及孕第1天-孕第4天小鼠，分別于當(dāng)天上午8:00以脫頸法處死后，收集其子宮組織。對于孕第5天和孕第6天小鼠，分別于當(dāng)天上午8:00先從尾靜脈注射芝加哥藍(lán)溶液(1％生理鹽水，每只小鼠注射0.1ml)后，以脫頸法處死，收集呈藍(lán)色的著床部位和不著色的非著床部位子宮組織。對于孕第6天-孕第9天小鼠，其著床部位和非著床部位可以肉眼分辨，分別于當(dāng)天上午8:00以脫頸法處死后，收集著床部位和非著床部位的子宮組織，并將孕第7-第9天的胚泡從相應(yīng)的著床部位組織中分離出來。對于假孕小鼠，則于假孕第4天上午8:00，在其一側(cè)子宮腔內(nèi)注射25μl芝麻油，另一側(cè)子宮不注射芝麻油，作為人工蛻膜化對照。然后于假孕第8天上午8:00處死小鼠，注油的一側(cè)子宮角應(yīng)發(fā)生蛻膜化，另一側(cè)子宮角應(yīng)沒有變化，分別收集兩側(cè)子宮組織，即為人工蛻膜化子宮組織及其對照組子宮組織。收集到的組織樣品用于Northern印跡分析、Western印跡分析、原位(in situ)雜交分析和免疫組織化學(xué)分析。
結(jié)果見圖1-4。圖1為不同孕期小鼠子宮和胚胎組織中E4BP4基因轉(zhuǎn)錄水平的Northern印跡分析結(jié)果；圖2為孕早期小鼠子宮組織中E4BP4蛋白表達(dá)水平的Western印跡分析結(jié)果；圖3為小鼠子宮組織中E4BP4 mRNA的原位雜交分析結(jié)果；圖4為小鼠子宮組織中E4BP4蛋白的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。由圖可知，E4BP4基因主要在妊娠早期的小鼠子宮內(nèi)膜子宮腔周圍的基質(zhì)細(xì)胞及其蛻膜化后形成的初級蛻膜細(xì)胞中表達(dá)，而未受孕小鼠子宮組織中則未檢測到該基因的表達(dá)。在妊娠初始期，E4BP4基因的表達(dá)水平最初是隨著孕期的增加而逐步提高，至孕第6天(以查見陰栓為孕第1天)，即胚胎著床后期和原羊膜腔形成期，其表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后開始降低，至孕第9天，即使在胚胎著床位點(diǎn)也已檢測不到該基因的表達(dá)。
此外，還發(fā)現(xiàn)E4BP4基因在人工誘導(dǎo)蛻膜化的假孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化區(qū)也有較高水平的表達(dá)(圖3)，表明該基因的表達(dá)與基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化有關(guān)。由于目前已在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)E4BP4具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖的作用，因此結(jié)合前面的結(jié)果可知，在小鼠孕第1天-孕第4天期間，E4BP4基因在子宮組織中的表達(dá)逐步增強(qiáng)，有助于基質(zhì)細(xì)胞的增殖，為蛻膜化作準(zhǔn)備；在孕第5天和孕第6天，E4BP4基因主要在蛻膜細(xì)胞中的高表達(dá)，可有效抑制蛻膜細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)蛻膜的形成；而自孕第7天開始，E4BP4基因在蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)急速下調(diào)，則有助于蛻膜的退化，以協(xié)調(diào)蛻膜細(xì)胞的數(shù)量和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜組織的侵潤性。
此外，E4BP4蛋白可通過與誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)基因啟動子的結(jié)合而抑制iNOS基因的表達(dá)(見Wallace等人，BBRC232403，1997)，因此，E4BP4基因在孕第6天后的表達(dá)水平快速下調(diào)，有利于iNOS基因的高表達(dá)，從而能提高細(xì)胞內(nèi)NO的合成，促進(jìn)胚胎的著床。
實(shí)施例2E4BP4 mRNA的反義寡核苷酸鏈在小鼠體內(nèi)對胚胎的著床呈抑制作用針對小鼠mRNA編碼區(qū)中20個核苷酸序列5’-AUCAAAAAGGAGCCCGCACC-3’(SEQ ID NO5)，本發(fā)明人合成了其反義DNA片段5’-GGTGCGGGCTCCTTTTTGAT-3’(SEQ ID NO6)。同時，合成了隨機(jī)序列的對照DNA片段5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAG-3’(SEQ IDNO7)。以美國Madison公司的Mirus TransITRPolymer為轉(zhuǎn)染劑，進(jìn)行了體內(nèi)E4BP4基因功能封閉實(shí)驗(yàn)，方法如下(1)將10μL(1μg/μL)Mirus TransITRPolymer溶液和20μL Delivery溶液混合后，分別加入10μL反義DNA溶液、10μL對照DNA溶液、10μL DNA-溶液，配制成三種不同的注射溶液；(2)于孕第4天下午3:00～4:00，將注射溶液注入小鼠的子宮腔內(nèi)，每側(cè)子宮腔注射40μL溶液，同一小鼠的兩側(cè)子宮腔內(nèi)注射同一種溶液；(3)于孕第8天上午9:00處死小鼠，取出子宮組織，對每側(cè)子宮內(nèi)的胚胎數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
結(jié)果如表1所示。
表1

表中，a與空白對照組相比；b與空白對照組相比將反義DNA組(低)與對照DNA組(低)相比，抑制率為32％；將反義DNA組(高)與對照DNA組(高)相比，抑制率為55％；顯示出一定的劑量效應(yīng)。
這表明，E4BP4反義核酸能夠明顯降低正常著床的胚胎數(shù)。
實(shí)施例3篩選E4BP4的拮抗劑按實(shí)施例2所述方法，將以下兩組物質(zhì)(替換反義核酸和轉(zhuǎn)染劑)施用于懷孕小鼠，然后觀察對胚泡著床的體內(nèi)抑制作用(a)候選物質(zhì)+E4BP4因子；(b)E4BP4因子。
如果組(a)的胚泡著床率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著低于組(b)的胚泡著床率，則表明該候選物質(zhì)是E4BP4的拮抗劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所<120>E4BP4基因在胚胎著床過程中的功能及其應(yīng)用<130>059723<160>7<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1665<212>DNA<213>Mus musculus<400>1tttctaatgc agctgagaaa aatgcagacc atcaaaaagg agcccgcacc cctagatcct 60accagcagct cagacaagat gctgctgctg aactctgcct tagctgaggt ggccgaggac120ctagcctcag gtgaagattt gctcctgaac gaagggagca tggggaaaaa caaatcctcg180gcgtgtcgga gaaaacggga attcattccg gacgagaaga aagacgccat gtattgggag240aaacggcgga aaaacaacga agctgccaaa agatctcggg agaagcgccg cctcaatgac300ctggttttgg agaacaagct gattgccctg ggagaagaaa atgccacttt aaaagctgag360ctgctctccc tgaaattaaa gtttggttta attagctcca cggcgtatgc ccaagaaatc420cagaaactca gtaattccac agctgtctac tttcaggact accagacatc caaggctgcc480gtgagctctt ttgtggacga gcatgagcct gcgatggtag ccggaagttg catctcagtc540atcaagcact ctccccagag ctcgctctcc gatgtgtcag aggtgtcctc ggtggagcac600actcaggaaa gccccgcaca gggaggctgc cggagccctg agaacaagtt ccctgtgatc660aagcaggagc ccgtggagtt ggagagcttt gccagggagg ccagggagga gcggggcacg720tattccacct ccatctacca gagctacatg ggaagctctt tctccactta ctcccactcc780ccacccctct tgcaggtcca tgggtccact agcaactccc caagaacctc agaggccgat840gagggtgtag tgggcaagtc ttctgatggg gaagacgaac aacaggtccc taagggcccc900atccattctc cagtggagct gcaacgggtt cacgccacgg tggtgaaggt tccggaagtg960aacccttctg ccttaccgca caagcttcgg attaaagcca aggccatgca ggtcaaagtg 1020
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Met Gln Leu Arg Lys Met Gln Thr Val Lys Lys Glu Gln Ala Ser Leu1 5 10 15Asp Ala Ser Ser Asn Val Asp Lys Met Met Val Leu Asn Ser Ala Leu20 25 30Thr Glu Val Ser Glu Asp Ser Thr Thr Gly Glu Asp Val Leu Leu Ser35 40 45Glu Gly Ser Val Gly Lys Asn Lys Ser Ser Ala Cys Arg Arg Lys Arg50 55 60Glu Phe Ile Pro Asp Glu Lys Lys Asp Ala Met Tyr Trp Glu Lys Arg65 70 75 80Arg Lys Asn Asn Glu Ala Ala Lys Arg Ser Arg Glu Lys Arg Arg Leu85 90 95Asn Asp Leu Val Leu Glu Asn Lys Leu Ile Ala Leu Gly Glu Glu Asn100 105 110Ala Thr Leu Lys Ala Glu Leu Leu Ser Leu Lys Leu Lys Phe Gly Leu115 120 125Ile Ser Ser Thr Ala Tyr Ala Gln Glu Ile Gln Lys Leu Ser Asn Ser130 135 140Thr Ala Val Tyr Phe Gln Asp Tyr Gln Thr Ser Lys Ser Asn Val Ser145 150 155 160Ser Phe Val Asp Glu His Glu Pro Ser Met Val Ser Ser Ser Cys Ile165 170 175Ser Val Ile Lys His Ser Pro Gln Ser Ser Leu Ser Asp Val Ser Glu180 185 190Val Ser Ser Val Glu His Thr Gln Glu Ser Ser Val Gln Gly Ser Cys195 200 205Arg Ser Pro Glu Asn Lys Phe Gln Ile Ile Lys Gln Glu Pro Met Glu210 215 220Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Glu Pro Arg Asp Asp Arg Gly Ser Tyr Thr225 230 235 240Ala Ser Ile Tyr Gln Asn Tyr Met Gly Asn Ser Phe Ser Gly Tyr Ser245 250 255His Ser Pro Pro Leu Leu Gln Val Asn Arg Ser Ser Ser Asn Ser Pro
260 265 270Arg Thr Ser Glu Thr Asp Asp Gly Val Val Gly Lys Ser Ser Asp Gly275 280 285Glu Asp Glu Gln Gln Val Pro Lys Gly Pro Ile His Ser Pro Val Glu290 295 300Leu Lys His Val His Ala Thr Val Val Lys Val Pro Glu Val Asn Ser305 310 315 320Ser Ala Leu Pro His Lys Leu Arg Ile Lys Ala Lys Ala Met Gln Ile325 330 335Lys Val Glu Ala Phe Asp Asn Glu Phe Glu Ala Thr Gln Lys Leu Ser340 345 350Ser Pro Ile Asp Met Thr Ser Lys Arg His Phe Glu Leu Glu Lys His355 360 365Ser Ala Pro Ser Met Val His Ser Ser Leu Thr Pro Phe Ser Val Gln370 375 380Val Thr Asn Ile Gln Asp Trp Ser Leu Lys Ser Glu His Trp His Gln385 390 395 400Lys Glu Leu Ser Gly Lys Thr Gln Asn Ser Phe Lys Thr Gly Val Val405 410 415Glu Met Lys Asp Ser Gly Tyr Lys Val Ser Asp Pro Glu Asn Leu Tyr420 425 430Leu Lys Gln Gly Ile Ala Asn Leu Ser Ala Glu Val Val Ser Leu Lys435 440 445Arg Leu Ile Ala Thr Gln Pro Ile Ser Ala Ser Asp Ser Gly450 455 460<210>5<211>20<212>RNA<213>人工序列<400>5aucaaaaagg agcccgcacc 20<210>6<211>20<212>DNA
<213>人工序列<400>6ggtgcgggct cctttttgat 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7tgaggagcag cccacagaag 20
權(quán)利要求
1.一種E4BP4基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，所述的E4BP4基因或其編碼蛋白被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
2.一種E4BP4基因或其編碼蛋白的用途，其特征在于，所述的E4BP4基因或其編碼蛋白被用于制備調(diào)節(jié)胚胎著床的藥物。
3.一種E4BP4拮抗劑的用途，其特征在于，所述的E4BP4拮抗劑被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
4.一種E4BP4拮抗劑的用途，其特征在于，所述的E4BP4拮抗劑被用于制備調(diào)節(jié)胚胎著床的藥物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的藥物選自避孕藥、或輔助生育藥。
6.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑是E4BP4的反義核酸、或抗E4BP4多肽的抗體。
7.一種E4BP4激動劑的用途，其特征在于，所述的E4BP4激動劑被用作調(diào)節(jié)胚胎著床的調(diào)節(jié)劑。
8.一種E4BP4激動劑的用途，其特征在于，所述的E4BP4激動劑被用于制備促進(jìn)胚胎著床的藥物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的藥物選自避孕藥、或輔助生育藥。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的E4BP4多肽、其激動劑或其拮抗劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了E4BP4基因的新用途，其可被用作調(diào)節(jié)胚胎著床(即胚胎植入)的調(diào)節(jié)劑。在胚胎著床前期阻斷E4BP4基因的表達(dá)或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，可抑制胚胎著床，反之則促進(jìn)著床；在胚胎著床后期阻斷E4BP4基因的表達(dá)或封閉其表達(dá)產(chǎn)物E4BP4蛋白的生物功能，可促進(jìn)胚胎著床，反之則抑制著床。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)E4BP4基因及其表達(dá)產(chǎn)物參與調(diào)控胚胎著床，因而為胚胎著床過程的控制提供了新的依據(jù)。
文檔編號A61K31/7088GK101024089SQ20061002404
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日
發(fā)明者王健, 申慶祥, 黃哲平 申請人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所