專利名稱：胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及家畜繁殖學領域，屬胚胎生物技術的范疇，作為提高牛繁殖力的輔助技術。
背景技術：
通過添加細胞因子，如牛滋養(yǎng)層蛋白質-l(bTP-l) (Thatcher et al. ， 1989 ;Bazer etal. ， 1991)，干擾素-a(IFN-a) (Plante et al. ， 1988 ;Plante et al.，1989)，干擾素-t (IFN- t )，重組蛋白(Mayer et al. ， 1995 ;Martal et al. ， 1997)，增強妊娠識別信號，有效地延長周期黃體壽命，提高胚胎移植后的受胎率。由于這些蛋白的分離純化和檢測過程復雜，因此在胚胎移植技術中并未廣泛應用。 楊亞衛(wèi)等(2002)試驗結果，波爾山羊單胚移植的妊娠率為54. 1% (53/98)、雙胚為57. 7 % (77/49)、三胚為66. 70 % ，差異不顯著(P > 0. 05)。陳軍等(2007)報道移植三胚、雙胚與移植單胚的受體羊妊娠率分別為71. 43%、64. 52%和52. 50%，差異不顯著。
有研究結果表明，受體牛妊娠率隨半胚移植數(shù)目的增加而上升，移植雙半胚較單一全胚妊娠率高，移植效果好，主要是因兩枚半胚有較多的滋養(yǎng)層細胞，為胚胎存活奠定了g石出。 Heyman等(1987)將2個滋養(yǎng)泡與凍胚共移植49頭受體牛，45d、60d和90d妊娠率分別為73% 、61 %和57% ;對照組53頭受體牛45d、60d和90d妊娠率分別為43% 、42%和40% 。試驗證明了由于冷凍對胚胎造成的損傷可以通過添加滋養(yǎng)泡來克服，提高妊娠率。2005年，Hashiyada等(2005)將體外受精體內培養(yǎng)的胚胎所獲得的不同直徑的滋養(yǎng)泡與半胚共移植，26-43d，38-73d分別獲得66.7X (16/24)和54.2% (13/24)的妊娠率，對照組兩次妊娠率均為34. 5% (10/29);試驗組產犢率為41.7% (10/24)，對照組為27. 6% (8/29)。實驗證明，添加滋養(yǎng)泡與半胚共移植能加強妊娠識別信號，提高胚胎妊娠率。通常，滋養(yǎng)泡(Trophoblastic Vesicles,TVs)是由供體受精后14d孕體獲得，即去除胚盤的胚泡。直徑為0. 4-2. 0mm滋養(yǎng)泡與胚胎共移植，都能夠阻止黃體溶解，但試驗證明妊娠率并不受滋養(yǎng)泡直徑大小的影響。實驗證明，添加滋養(yǎng)泡與半胚共移植能加強妊娠識別信號，提高胚胎妊娠率。實驗組和對照組受體牛所產牛犢的初生重無差異，具有正常的形態(tài)學特征；實驗組牛犢通過與親本血型鑒定，犢牛遺產同一性并未受到滋養(yǎng)泡的影響。同時試驗還證明了妊娠率并不受滋養(yǎng)泡直徑大小的影響。 我國胚胎移植發(fā)展起步較晚，尤其是在產業(yè)化方面，與美國和加拿大等發(fā)達國家有較大差距。胚胎移植妊娠率是直接影響其產業(yè)化效益的主要因素。本發(fā)明借鑒國外相關提高牛胚胎移植妊娠率的研究方法和研究思路，旨在探索出一種能夠提高牛胚胎移植妊娠率的有效途徑。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是從生產應用出發(fā)，通過將C級胚胎及用雄性胚胎(胚胎性別鑒定
3后的副產品)制作的胚胎塊和胚胎滋養(yǎng)層分別與可用胚胎共移植，達到增強妊娠識別信號的目的，從而提高胚胎移植妊娠率。 胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征是將胚胎組織塊或滋養(yǎng)層組織塊與可用胚胎共移植到一頭受體母牛子宮中。 所述組織塊來源為經超數(shù)排卵處理后所采集的7-8日齡體內受精牛胚胎，1級和2級用于胚胎冷凍、PCR性別鑒定和胚胎移植，3級胚胎和PCR性別鑒定后的奶牛雄性胚胎可用于制作胚胎組織塊。 所述胚胎組織塊的制作步驟為用雙面刀片線切割成顯微手術刀；做洗刀平皿清洗消毒，以減少污染，降低由于刀粘性增大對胚胎造成的損害；做分割液滴洗胚胎，將胚胎分割成8份并回收。 所述滋養(yǎng)層組織塊制作步驟為胚胎體外培養(yǎng)，將發(fā)育到囊胚或擴囊期的胚胎洗滌并切取滋養(yǎng)層(即囊胚腔)，將其再分為3-4份并回收。 所述胚胎體外培養(yǎng)的方法為二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)法或恒溫試管架培養(yǎng)法。
所述受體母牛為同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛。
所述共移植步驟為選1-2塊胚胎組織塊或滋養(yǎng)層組織塊與將要移植的胚胎放在一起，用4段液法裝入一支細管中段，細管裝入移植槍，將胚胎和組織塊一同移植到受體有黃體一側子宮角的上1/3——1/2處。 本發(fā)明將雄性胚胎或3級胚胎切割后與可用胚胎共移植，利用組織塊或滋養(yǎng)層中的滋養(yǎng)泡增強妊娠識別信號，相比較滋養(yǎng)層蛋白或干擾素等細胞因子的分離純化和檢測，本方法操作簡便，應用性強。


圖1 :胚胎培養(yǎng)裝管示意圖，左端為棉栓(未顯示)，右端用封口機封口 (未顯示)，
2-4陰影部分均為培養(yǎng)液，1和5陰影部分為Holding液，空白部分為氣泡(均為5mm)，第3
段為胚胎段。 圖2:囊胚。 圖3:胚胎滋養(yǎng)層。 圖4:4段液法裝管圖示。左端為棉栓(未顯示)，右端為細管塞(未顯示)，l-3陰影部分均為冷凍液，4-5陰影部分為Holding液或冷凍液，空白部分為氣泡。各段長度為1 :25mm ;2 :15mm ;3 :20mm，裝有胚胎;4 :不定，直到封滿口。
實體實施方式
實施例1 用冷凍-解凍后的雄性奶牛胚胎制作胚胎組織塊，與雌性奶牛冷凍胚胎共移植。
1.胚胎組織塊制作 儀器使用0LUMPUS倒置顯微鏡和一個顯微操作機械手。 工具用雙面刀片線切割成寬為1.5mm，長為7-8mm，尖端角度為40。 _50°之間的顯微手術刀，顯微手術刀刀柄為塑料材質，直徑為2mm，長臂長約48mm，短臂長約27mm長、短臂之間夾角約150° 。刀柄短臂與顯微操作機械手固定。器皿4孔或6孔培養(yǎng)皿1個(放置和洗滌胚胎)，C 60mm培養(yǎng)皿1個(蓋和底
4均可做分割液滴)，C 35mm培養(yǎng)皿4個(清洗消毒刀)。 溶液胚胎體外保存液Holding(含血清或血清替代品，Holding液的基本成分同于胚胎體外培養(yǎng)液，但其中的NaHC02被7mM H印es緩沖劑所替代。購買來源USA BIONICHECo. ， Ltd,貨號090511-1P);胚胎分割液Splitting(不含任何蛋白源，成分g/litre :CaCl2. 2H20 :0. 050 ;MgCl2. 6H20 :0. 040 ;KCL :0. 20 ;NaCl :8. 000 ;KH2P04 :0. 200 ;Na2HP04 :1. 150 ;Penici 11 in-G. sodium salt :0. 050 ;Str印tomycin sulphate :0. 025 ;EDTA.Na2. 2H20 :0. 0015) 操作(l)調節(jié)顯微手術刀的方位、角度刀面嚴格垂直于分割皿底面，刀刃線與分割皿底面幾乎平行，刀尖略低。 (2)做洗刀平皿清洗消毒顯微手術刀給4個C 35mm培養(yǎng)皿編號1#皿加超純水，2#皿加75%乙醇，3#皿加超純水，4#皿加Splitting。 4個培養(yǎng)皿放在一個邊長約120mm的正方皿中，便于移動洗刀。每切割l-2個胚胎按順序清洗刀一遍。 (3)做切割液滴洗胚胎在C 60mm培養(yǎng)皿的蓋或底上做分割液滴，每滴50_70ul，將1-2枚胚胎從Holding液中取出，在Splitting液中洗2-3次后放入分割液滴中，準備切割。 (4)將胚胎切割成8份用顯微手術刀以胚胎的內細胞團為中心先平分成2份，再將1/2胚平分成1/4胚，再將1/4胚平分成1/8胚，從而獲得8份胚胎組織塊， 一定將內細胞團切小且松散。分割后的胚胎組織塊用吸有Holding液的吸管進行回收，放入一個Holding液培養(yǎng)孔中待用。 2、胚胎組織塊與胚胎共移植用同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛做受體進行移植。選l-2塊胚胎組織塊或滋養(yǎng)層組織塊與將要移植的胚胎放在一起，用4段液法裝入一支0. 25ml細管的中段，細管裝入移植槍。將胚胎和組織塊一同移植到受體有黃體一側子宮角的上1/3——1/2處。 結果移植112頭，妊娠67頭，移植妊娠率為59. 8%，產犢雌性率為98. 5% ;對照組移植177頭，妊娠83頭，移植妊娠率為46. 9%，產犢雌性率為98. 8% 。移植妊娠率提高12.9%，產犢雌性率不受影響。
實施例2 用冷凍-解凍后的雄性奶牛胚胎制作胚胎組織塊，與常規(guī)冷凍胚胎共移植。操作步驟同實施例1. 結果移植140頭，妊娠87頭，移植妊娠率為62. 1%，公母比例為1 : l，雙犢率為0% ;對照組移植223頭，妊娠109頭，移植妊娠率為48. 9%，公母比例為1 : 1. Ol，雙犢率為0%。移植妊娠率提高13. 2%，犢牛性別比例不受影響。
實施例3 用冷凍-解凍后的雄性奶牛胚胎制作滋養(yǎng)層組織塊，與常規(guī)奶牛冷凍胚胎共移植。
1、滋養(yǎng)層組織塊的制作
(1)胚胎體外培養(yǎng) 二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)法于實驗前一天晚上用35mm平皿做好培養(yǎng)滴，每滴50 y L，滴好石蠟油后平衡，同時在培養(yǎng)箱中預熱適量的操作液。將解凍的雄性胚胎用培養(yǎng)液洗滌3遍后放入培養(yǎng)滴中，每滴培養(yǎng)液10枚胚胎，分別用HOLDING液和CRlaa(成分NaCl :114. 7mM， KC1 :3. lmM， NaHC03 :26. 2mM， Na Pyruvate :20. 4mM， Phenol Red :1 ii g/mL)培養(yǎng)液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.51:，100%濕度，5% C02。兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)時間均為3-5h。 恒溫試管架培養(yǎng)法將解凍的雄性胚胎用培養(yǎng)液洗滌3遍后，分別用HOLDING和CRlaa培養(yǎng)液裝入O. 25ml細管(圖2)，將口密封。再將細管放到裝有39。C水的50ml離心管中，密封，置于設定溫度為39t:恒溫試管架中(圖2)。 CRlaa培養(yǎng)液培養(yǎng)時間時間為3-6h，HOLDING培養(yǎng)液培養(yǎng)時間時間為7-17h。 (2)胚胎滋養(yǎng)層的獲得將發(fā)育到囊胚或擴囊期的胚胎(圖3)，用HOLDING液洗滌3-4遍，然后用切割液洗滌并放入切割盤，切取滋養(yǎng)層(即囊胚腔)(圖4)，將其再分為3-4份，并回收到HOLDING液中備用。
2.移植步驟同實施例1. 結果移植20頭，妊娠16頭，移植妊娠率為80%，公母比例為1.29 : l，雙犢率為0% ;對照組移植48頭，妊娠29頭，移植妊娠率為62. 4%，公母比例為1 : 1. 07，雙犢率為0% ;。移植妊娠率提高17.6%，犢牛性別比例不受影響。 以上研究表明，通過將胚胎組織塊和胚胎滋養(yǎng)層分別與可用胚胎共移植，操作簡便，且達到了提高胚胎移植妊娠率的目的，該方法能顯著提高牛胚胎移植技術的經濟效益。
權利要求
胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法，其特征是將胚胎組織塊或滋養(yǎng)層組織塊與可用胚胎共移植到一頭受體母牛子宮中。
2. 根據權利要求l所述方法，所述組織塊來源為3級胚胎或PCR性別鑒定后的奶牛雄性胚胎。
3. 根據權利要求1所述方法，所述胚胎組織塊的制作步驟為用雙面刀片線切割成顯微手術刀，做洗刀平皿清洗消毒，做分割液滴洗胚胎，將胚胎分割成8份并回收。
4. 根據權利要求l所述方法，所述滋養(yǎng)層組織塊制作步驟為胚胎體外培養(yǎng)，將發(fā)育到囊胚或擴囊期的胚胎洗滌并切取滋養(yǎng)層，將其再分為3-4份并回收。
5. 根據權利要求4所述方法，所述胚胎體外培養(yǎng)的方法為二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)法或恒溫試管架培養(yǎng)法。
6. 根據權利要求1所述方法，所述受體母牛為同期發(fā)情或自然發(fā)情后7. 0-8. 0天的黃體合格的母牛。
7. 根據權利要求1所述方法，所述共移植步驟為選1-2塊胚胎組織塊或滋養(yǎng)層組織塊與將要移植的胚胎放在一起，用4段液法裝入一支細管中段，細管裝入移植槍，將胚胎和組織塊一同移植到受體有黃體一側子宮角的上1/3——1/2處。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種胚胎組織塊與胚胎共移植提高牛移植妊娠率的方法，涉及家畜繁殖學領域，屬胚胎生物技術的范疇，作為提高牛繁殖力的輔助技術。本發(fā)明通過將C級胚胎及用雄性胚胎制作的胚胎塊和滋養(yǎng)層分別與可用胚胎共移植，達到增強妊娠識別信號的目的。該發(fā)明顯著提高了胚胎移植妊娠率，操作簡便且具有較好的經濟前景。
文檔編號A61D19/04GK101773417SQ201019114030
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權日2010年2月4日
發(fā)明者余文莉, 李樹靜 申請人:余文莉;李樹靜