專利名稱：：一種克隆胚胎移植方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，具體地說，是關于一種克隆胚胎移植方法。
背景技術：
：通常意義上的胚胎移植，是指是將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到另一頭處在同步發(fā)情期的母畜體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新的個體，又稱借腹懷胎，該方法可以極大地提高優(yōu)良母畜的利用率和繁殖率，充分挖掘母畜的遺傳和繁殖能力。動物克隆技術是將供體體細胞核經(jīng)顯微操作和/或細胞融合的方法移植到去核卵母細胞胞質中，重新組成胚胎(重構胚)。重構胚經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育至囊胚，再將囊胚移植到同步發(fā)情的代孕體子宮內(nèi)，待發(fā)育成熟后分娩出動物，該動物被稱為"克隆動物"，該技術則被稱為"體細胞克隆技術"或"體細胞核移植技術，，(somaticcellnucleartransfer,SCNT)。其中將囊胚移植到同步發(fā)情的代孕體子宮內(nèi)這一過程，稱為克隆胚胎的移植。自從克隆羊多莉誕生以來(Wilmut,I.,Schnieke,A.E.,Mcwhir，J.，Kind,etal.Nature1997,385:810-813)，體細胞核移植技術作為一種生物技術成為研究的熱點，利用體細胞核移植技術可以大量繁殖性狀優(yōu)良的家畜、拯救瀕危動物、培育轉基因動物、進行治療性克隆等。哺乳動物體細胞克隆發(fā)展近十年來,克隆胚胎在體外的發(fā)育已與體外受精胚胎的囊胚率和早期受孕率相當(GomezMC,PopeCE，GiraldoA,etal.CloningStemCell2004,6:247-258;DeanW，SantosF,ReikW.SeminCellDevBiol2003,14:93-100)，但克隆胚胎移植到受體動物子宮內(nèi)以后受孕效率較低，仍然是制約體細胞核移植技術廣泛應用的瓶頸。近年來，申請人針對形成重構胚所需的供體細胞和受體細胞進行了深入的研究，相繼申請了一系列中國發(fā)明專利，如"一種同體細胞核移植方法"(申請?zhí)?00410016219.7)，"一種哺乳動物體細胞核移植方法"(申請?zhí)?00510023872.0)以及"一種細胞核移植方法"(申請?zhí)?00610029674.X)的專利。研究過程中申請人發(fā)現(xiàn)，在進行牛的體細胞核移植時，不同亞種的克隆囊胚形成率存在一定的差異(YangXY,ZhaoJG,LiHWetal.2005.Theriogenology.64(6):1263-72)。發(fā)明人由此聯(lián)想到，目前常規(guī)胚胎移植方法，對亞種沒有特別的選擇，只要代孕體處在同步發(fā)情期時即移植，這樣由于克隆胚胞質與代孕體亞種間內(nèi)環(huán)境的不同，可能會導致受孕率的降低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于提供一種克隆胚胎移植方法，該方法選取與克隆胚受體胞質亞種相同的代孕體進行移植。為了達到上述目的，發(fā)明人將發(fā)育到囊胚的重構胚移植到與克隆胚受體胞質亞種相同的代孕體子宮內(nèi)，結果發(fā)現(xiàn)采用亞種相同的胚胎移植能夠有效提高移植后的受孕率。具體地，本發(fā)明的克隆胚胎方法包括以下步驟a、選取某非人哺乳動物，以其皮膚成纖維細胞或卵丘細胞作為供核體細胞b、選取步驟a哺乳動物的某一亞種，以其卵母細胞作為受體細胞；C、受體卵母細胞去核；d、將供核體細胞的細胞核移入去核卵母細胞的細胞質中，使細胞核融入卵母細胞，形成重構胚。e、待重構胚發(fā)育至囊胚，將克隆囊胚移植到與克隆胚受體胞質同一亞種的代孕體子宮內(nèi)。本發(fā)明的同種(克隆胚胎受體胞質亞種與代孕體亞種相同)克隆胚胎移植方法能夠有效提高移植后受孕率，相比異種(克隆胚胎受體胞質亞種與代孕體亞種不同)胚胎移植受孕率提高了約3倍。因為通過同種克隆胚胎移植，增加了胚胎與代孕體間的兼容性，從而有利于受孕。因此，利用克隆胚受體胞質與代孕體來自同一亞種的方法可有效解決胚胎受孕過程中的不兼容問題，從而提高受孕率。具體實施例方式以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1、受體卵母細胞的準備黃牛和奶牛為哺乳綱偶蹄目?？婆贈r5V7/v'肌'《e/7iM種的兩個亞種。對黃?；蚰膛５那嗄昴概＿M行活體取卵，具體方法見申請?zhí)枮?00510023510.1的中國發(fā)明專利申請。將收集液倒入揀卵杯中，用無鈣鎂杜氏磷酸緩沖液(DPBS,1升去離子水中含8gNaCl，0.2gKCl,1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04,30gBSA和2000u肝素)沖洗，揀出卵母細胞復合體(cumulusoocytecomplexes,COCs)移入培養(yǎng)皿，在體視顯微鏡下對COCs進行分級，選擇胞質均勻，周圍卵丘細胞排列緊密，包繞三層以上的卵母細胞，放入成熟液(TCM-199(Gibco，GrandIsland,NY)外加10%胎牛血清(FBS)、lOjig/ml促黃體生成激素、l嗎/ml雌二醇和lUg/ml促卵泡生成素)中培養(yǎng)1530h。實施例2、供核體細胞的準備1、分別取青年牛成纖維細胞和卵丘細胞，用含10%FBS的DMEM/F12(Gibco公司，產(chǎn)品號為11039-021)進行培養(yǎng)。①成纖維細胞的原代培養(yǎng)取新生牛耳組織，置于含雙抗(2%青鏈霉素)的0.9%生理鹽水中，耳組織經(jīng)碘釘和75%酒精浸泡消毒后，無菌生理鹽水洗35遍，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37'C消化2h，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。②卵丘細胞的原代培養(yǎng)將成熟20h小時的COCs(見實施例l)放入含0.5%透明質酸酶的無鈣鎂的DPBS中，消化l2min，同時用吸胚管反復吹吸，脫去外層疏松、擴展的卵丘細胞。收集這部分的卵丘細胞，盡快移入無鈣鎂的DPBS中，1200rpm離心5min，棄上清；加入100^10.25%胰酶吹打lmin，加入DMEM/F12+10%FBS(1體積FBS+9體積DMEM/F12培養(yǎng)液)終止消化，lOOOrpm離心5min，DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2次。用DMEM/F12+10XFBS懸浮細胞，輕輕吹打，使細胞充分吹散，接種至25cm2培養(yǎng)瓶(接種密度約為1X105,內(nèi)含DMEM/F12+10XFBS培養(yǎng)液5ml)，于38.5。C，5%C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、約35天生長匯合后，進行傳代。3、取培養(yǎng)15代的細胞用作核移植的供核細胞。核移植前，用0.25%胰酶消化貼壁細胞，將消化下來的細胞用3mg/ml的鏈霉蛋白酶處理50秒，并離心洗滌，最后用DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)10(^1重懸，并反復吹打成單個細胞的懸液，保存于恒溫箱中待用。實施例3、細胞核移植1、核移植所需ACM培養(yǎng)液的配制ACM培養(yǎng)液的配方如下NaCl(SigmaS掘6)0.580gKC1(SigmaP-5405)0.022gNaHC03(SigmaS-5761)0.209gL-谷氨酰胺(SigmaG-8540)0.015gCaCl22H20(SigmaC-7卯2)O扁g丙酮酸(2.2mg/ml貯存于PBS中)2mlBME氨基酸(SigmaB-6766)2mlMEM氨基酸(SigmaM-7145)lml青鏈霉素(GIBCO-BRL公司)lml乳酸(SigmaL-7900)14pl酚磺酞(SigmaP-0290)lOOplBSA(無脂肪酸)(SigmaA-6003)0.300g將除BSA外的所有干粉成分溶解于盛有70ml胚胎水的燒杯中，為防止BME/MEM受到污染，加入所有液體成分并用罩子罩住燒杯進行攪拌，然后加入BSA干粉繼續(xù)攪拌直至完全溶解，用量筒定容至100ml，最后用0.2pm的濾膜過濾，于4。C貯存不超過兩周。2、細胞核移植將卵母細胞在煙酸己可堿Hoechst33342(Sigma公司)中染色，在帶有紫外燈的顯微操作儀下，用內(nèi)徑為15~20um的玻璃細管將受體卵母細胞的第一極體及其附近區(qū)域的卵核去除，然后將供體細胞核注入去核卵母細胞卵周隙，以2.5KV/cm_3V/cm和6—10ns的融合參數(shù)，將供核細胞核融入卵母細胞，獲得克隆重構胚。融合操作后的卵移入羥乙基哌嗪乙磺酸TL-HEPES(配方見后)中洗3遍，置于ACM培養(yǎng)微滴中，于5%<302、38.5°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后，用5ng/ml離子霉素(Ionomycin，Sigma1-0634)禾口10ug/ml亞胺環(huán)己酮(cyclohemixide，Sigma公司)，活化5h后將重構胚放入ACM和胎鼠成纖維細胞(MEF)的共培養(yǎng)體系中，在5%C02、38.5°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后更換ACM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。TL-HEPES操作液配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>NaHCCbSigmaS57610.0840g<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>加胚胎水至500ml，調(diào)節(jié)pH至7.4放置4'C冰箱備用，貯存不超過三周。實施例4、克隆胚胎移植將活化后培養(yǎng)6—7d的囊胚挑選形態(tài)正常，內(nèi)細胞團致密的進行移植，代孕體挑選有穩(wěn)定的發(fā)情周期，良好的健康狀況，黃體要在1.0cm以上且彈性要好的黃牛和奶牛。將裝有胚胎的移植管裝入移植套管再裝入移植槍內(nèi)，移植套膜套在最外層。將用于胚胎移植的受體母牛站立保定，lml"846合劑"(5ml/l支，解放軍農(nóng)牧大學軍事獸醫(yī)研究所)肌注及2ml利多卡因(100mg/5ml/支，上海福達制藥有限公司)尾椎硬膜外麻醉。清除直腸糞便，消毒外陰，將移植槍緩慢的推至子宮角處進行移植。分別在60天，90天，120天時則通過直腸觸診來診斷受孕情況，結果如表l所示。表l克隆胚受體胞質與代孕體亞種不同搭配受孕效率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注受孕率=受孕頭次/移植頭次根據(jù)表1的結果，分別統(tǒng)計同種克隆胚受體胞質與代孕體亞種(黃牛-黃牛，奶牛-奶牛)以及異種克隆胚受體胞質與代孕體亞種(黃牛-奶牛，奶牛-黃牛)的受孕效率，結果如表2所示。表2不同類型胚胎移植受孕率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1和表2的數(shù)據(jù)可以看出，同種間的胚胎移植(黃牛-黃牛，奶牛-奶牛)在60天，90天，120天的受孕率均優(yōu)于異種間的胚胎移植(黃牛-奶牛，奶牛-黃牛)，60天、90天同種組的受孕率約為異種組的2.6—2.7倍，120天時達到3倍。綜上所述，采用本發(fā)明的方法可以克服現(xiàn)有技術中由于代孕體選擇不當所導致的受孕率低下的問題，選擇與克隆胚受體胞質相同亞種的代孕體進行胚胎移植，可以有效提高克隆胚移植后的受孕率。雖然以上僅以牛為例對本發(fā)明的方法進行了驗證，但是本領域的技術人員根據(jù)說明書的內(nèi)容，顯然可以看出本發(fā)明的方法同樣適用于其它非人哺乳動物，例如豬、羊以及老鼠等，因此，針對這些非人哺乳動物的同種胚胎移植方法同樣應當屬于本發(fā)明的范圍。權利要求1、一種克隆胚胎移植方法，其特征在于，該方法是以選擇與克隆胚胎受體胞質亞種相同的代孕體進行克隆胚胎移植。2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a、選取某非人哺乳動物，以其皮膚成纖維細胞或卵丘細胞作為供核體細胞b、選取步驟a哺乳動物的某一亞種，以其卵母細胞作為受體細胞；C、受體卵母細胞去核；d、將供核體細胞的細胞核移入去核卵母細胞的細胞質中，使細胞核融入卵母細胞，形成重構胚。e、待重構胚發(fā)育至囊胚，將克隆囊胚移植到與克隆胚胎受體胞質同一亞種的代孕體子宮內(nèi)。3、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述供核體細胞是鏈霉蛋白酶處理后，經(jīng)DMEM/F12培養(yǎng)液重懸的細胞。4、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述作為受體細胞的卵母細胞通過活體取卵的方法獲得。5、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述卵母細胞去核是通過煙酸己可堿染色，紫外燈輔助下將卵母細胞的第一極體及其附近區(qū)域的卵核去除。6、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞核融入卵母細胞的融合參數(shù)為2.5KV/cm_3V/cm,6—10ps。7、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述重構胚經(jīng)離子霉素和亞胺環(huán)己酮活化處理后，在ACM和胎鼠成纖維細胞體系中共培養(yǎng)。8、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述移植的克隆胚指活化后培養(yǎng)6—7天的囊胚。9、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述代孕體有穩(wěn)定的發(fā)情周期，且黃體在l.Ocm以上。10、如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述克隆胚的移植是使用移植槍的非手術方法。11、如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述非人哺乳動物包括牛、羊、豬和老鼠。12、如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物為牛。全文摘要本發(fā)明公開了一種克隆胚移植方法，該方法是以選擇與克隆胚胎受體胞質亞種相同的代孕體進行克隆胚胎移植。本發(fā)明的方法增加了克隆胚胎與代孕體間的兼容性，能夠顯著提高克隆胚移植后的受孕率。文檔編號C12N15/06GK101380254SQ20071004569公開日2009年3月11日申請日期2007年9月7日優(yōu)先權日2007年9月7日發(fā)明者曾溢滔,趙磊文,黃淑幀申請人:上海交通大學附屬兒童醫(yī)院;上海滔滔轉基因工程股份有限公司