專利名稱：利用水牛eg樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬動物生物技術(shù)、特別是利用水牛胚胎生殖(Embryonic Germ, EG) EG樣細(xì)胞 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的方法。.
背景技術(shù)：
水牛是我國南方的一種極具開發(fā)前景的重要家畜，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐高溫高濕、抗 病力強(qiáng)、耐粗詞、易詞養(yǎng)、使用年限長和乳品營養(yǎng)價值高等特性，倍受人們關(guān)注與重視。然 而，目前我國水牛的產(chǎn)奶量和繁殖率均普遍較低，嚴(yán)重制約了水牛奶業(yè)的發(fā)展，急需應(yīng)用基 因工程技術(shù)對其進(jìn)行改良。干細(xì)胞具有多能性和無限分裂增殖的特性，非常適合在體外進(jìn)行 遺傳操作，可以通過胚胎嵌合或核移植獲得轉(zhuǎn)基因動物。但由于水牛體細(xì)胞的活力低，通過 基因轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)篩選后，再進(jìn)行核移植很難獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用水牛EG樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，以適 應(yīng)水牛品種改良的需要。
本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題 本發(fā)明方法的主要步驟為-
首先對水牛EG樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選傳代培養(yǎng)兩代的水牛EG樣細(xì)胞用線性質(zhì)粒DNA (pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB)經(jīng)脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后， 用杜貝科斯最低成分培養(yǎng)液(DMEM) +10%胎牛血清+200 y g/ml抗生素G418的培養(yǎng)液 篩選培養(yǎng)6 8天，獲得G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。將G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在不含G418 的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞的綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況， 將表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞用于轉(zhuǎn)基因胚胎的生產(chǎn)。
當(dāng)制作水牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎時，體外受精的卵母細(xì)胞受精后第三天，將10 15個表達(dá) GFP的EG樣細(xì)胞顯微注射到8 16細(xì)胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細(xì)胞的單 層細(xì)胞共培養(yǎng)4 5天，將培養(yǎng)獲得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選獲得水 牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎。
當(dāng)制作水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎時，將表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞血清饑餓培養(yǎng)1~2天，然后 移植到去核的體外成熟水牛卵母細(xì)胞中構(gòu)建核移植胚胎。重構(gòu)胚經(jīng)孤雌激活和與顆粒細(xì)胞的單層細(xì)胞共培養(yǎng)6 7天后，將獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選 獲得水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。
用本發(fā)明的方法，成功獲得了一批水牛轉(zhuǎn)基因嵌合囊胚和轉(zhuǎn)基因克隆囊胚，且證明約 60%的囊胚能表達(dá)外源基因，嵌合法的轉(zhuǎn)基因胚胎陽性率達(dá)到62.6°/。，核移植法的轉(zhuǎn)基因克 隆胚胎陽性率達(dá)到58.3%，為下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛邁出了重要的一步。


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圖1是用本發(fā)明的方法獲得的表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因水牛EG細(xì)胞的顯微照片。
圖2.是用本發(fā)明的方法獲得的水牛轉(zhuǎn)基因嵌合囊胚顯微照片。
圖3.是用本發(fā)明的方法獲得的水牛轉(zhuǎn)基因克隆囊胚顯微照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是一種利用已獲得的水牛胚胎生殖(Embryonic Germ, EG)樣細(xì)胞，通過胚胎嵌 合或核移植建立一種生產(chǎn)水牛轉(zhuǎn)基因胚胎的方法。
從屠宰場收集水牛卵巢，在實(shí)驗室用注射器回收卵母細(xì)胞，然后進(jìn)行體外成熟和體外受 精。體外成熟20小時的卵母細(xì)胞去核后用于制作轉(zhuǎn)基因克隆胚胎；體外成熟24小時的卵母 細(xì)胞體外受精和體外培養(yǎng)3天后，將8 16細(xì)胞階段的體外受精胚胎用于制作轉(zhuǎn)基因嵌合胚 胎。
從屠宰場收集30 60日齡的水牛胎兒，將胎牛的生殖脊或生殖腺用解剖器械分離出來, 放到平皿中。用杜貝科斯磷酸緩沖液(PBS)洗3次后,轉(zhuǎn)移到另一平皿。利用1 mL注射器 的針頭將其機(jī)械分離成單個細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，然后將分離出來的細(xì)胞接種到預(yù)鋪了飼養(yǎng)層(IO ng/mL絲裂霉素C處理2h)的35 mm培養(yǎng)皿中，添加1. 5 mL用DMEM+20X胎牛血清 +0.1 mM非必需氨基酸+0.1 mM P —巰基乙醇+1 mM丙酮酸鈉+ 10 20 ng / ml小鼠 重組白血病抑制因子mrLIF+20 40 ng / ml人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子hrbFGF和 20 40 ng /ml小鼠重組干細(xì)胞因子mrCSF的培養(yǎng)基，置于37 'C 、 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)6 8天后，將形成的EG樣細(xì)胞克隆挑出，用lmL注射器的針頭將其分成單個細(xì)胞或 細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)接種到飼養(yǎng)層培養(yǎng)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。EG樣細(xì)胞克隆傳代培養(yǎng)2代后，用線性質(zhì) 粒DNA (pCE-EGFP-IRES-Neo-dNdB)經(jīng)脂質(zhì)體(LipofectamineTM 2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞 轉(zhuǎn)染后，用DMEM+10W胎牛血清+200 y g/mlG418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)6 8天，獲得G418 抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。然后，將G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在不含G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培 養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，將表達(dá)GFP的細(xì)胞用于轉(zhuǎn) 基因胚胎的生產(chǎn)。
水牛卵母細(xì)胞體外受精后第三天，將10 15個表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞顯微注射到8 16細(xì)胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細(xì)胞的單層細(xì)胞共培養(yǎng)4 5天，將培養(yǎng)獲 得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選獲得轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎。
將表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞血清饑餓培養(yǎng)1 2天，然后移植到去核的體外成熟水牛卵母 細(xì)胞中構(gòu)建核移植胚胎。重構(gòu)胚經(jīng)孤雌激活和與顆粒細(xì)胞的單層細(xì)胞共培養(yǎng)6 7天后，將 獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。
實(shí)施例1
2006至2007年間，我們對104枚8-細(xì)胞階段的水牛體外受精胚胎，分別注入10 15 個轉(zhuǎn)染GFP基因的陽性水牛EG樣細(xì)胞，有37枚(占所有受注胚胎的35.6%)進(jìn)入發(fā)育囊 胚階段，其中23枚囊胚(占囊胚總數(shù)的62.2%)表達(dá)GFP。證明可通過注射轉(zhuǎn)基因EG樣 細(xì)胞到8 16細(xì)胞階段的體外受精胚胎的轉(zhuǎn)基因胚胎制作方法，可有效生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚 胎。
實(shí)施例2
2007至200S年間，我們將138個轉(zhuǎn)染GFP基因的陽性水牛EG樣細(xì)胞移植到138枚去 核的水牛卵母細(xì)胞中，其中109枚融合(占去核的水牛卵母細(xì)胞總數(shù)的79.0°/。)形成重構(gòu)胚， 其中68枚重構(gòu)胚(占融合細(xì)胞總數(shù)的62.4°/。)分裂，11枚(占分裂重構(gòu)胚的11.8°/。)發(fā)育 成囊胚，囊胚中的7枚(占囊胚總數(shù)的58.3%)表達(dá)GFP。這一實(shí)施例證明，本發(fā)明的通過 核移植轉(zhuǎn)基因EG樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛胚胎的方法是可行的。
權(quán)利要求
1.一種利用水牛EG樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎的方法，其特征是制作水牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎的主要步驟是(1)水牛EG樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選傳代培養(yǎng)兩代的水牛EG樣細(xì)胞用線性質(zhì)粒DNA經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后，用DMEM+10％胎牛血清+200μg/ml G418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)6～8天，獲得G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；然后，將G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在不含G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，將表達(dá)GFP的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)基因胚胎的生產(chǎn)；(2)制作水牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎體外受精后第三天，將10～15個表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞顯微注射到8～16細(xì)胞階段的水牛體外受精胚胎中，然后與顆粒細(xì)胞的單層細(xì)胞共培養(yǎng)4～5天，將培養(yǎng)獲得的囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選獲得水牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎。
2. —種利用水牛EG樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的方法，其特征是制作水牛轉(zhuǎn)基因克隆 胚胎的主要步驛是-(1) 水牛EG樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選傳代培養(yǎng)兩代的水牛EG樣細(xì)胞用線性質(zhì)粒DNA 經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后，用DMEM+10X胎牛血清+200 n g/ml G418的培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)6 8 天，獲得G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；然后，將G418抗性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在不含G418的培養(yǎng)液 中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞的綠色熒光蛋白GFP表達(dá)情況，將表達(dá)GFP 的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)基因胚胎的生產(chǎn)；(2) 制作水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎將表達(dá)GFP的EG樣細(xì)胞血清饑餓培養(yǎng)1 2天，然后 移植到去核的體外成熟水牛卵母細(xì)胞中構(gòu)建核移植胚胎；重構(gòu)胚經(jīng)孤雌激活和與顆粒細(xì)胞的 單層細(xì)胞共培養(yǎng)6 7天后，將獲得的核移植囊胚在熒光顯微鏡下檢測GFP表達(dá)情況，篩選 獲得水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。
全文摘要
一種利用水牛EG樣細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎的方法，其工藝步驟為先對水牛EG樣細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選，再分別制作水牛轉(zhuǎn)基因嵌合胚胎或水牛轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。用本發(fā)明的方法，成功獲得了轉(zhuǎn)基因水牛嵌合囊胚和轉(zhuǎn)基因克隆囊胚，且證明60％左右的囊胚能表達(dá)外源基因，為下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水牛邁出了重要的一步。
文檔編號C12N15/85GK101591673SQ20091011418
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者劉慶友, 石德順, 陸鳳花, 奔 黃 申請人:廣西大學(xué)