專利名稱：一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎移植技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法。
背景技術(shù)：
胚胎移植技術(shù)是一項應(yīng)用于哺乳動物的繁育高新技術(shù)。利用胚胎移植，可以開發(fā)遺傳特性優(yōu)良的母畜繁殖潛力，較快地擴大良種畜群，在自然情況下，牛、馬等母畜通常一年產(chǎn)I胎，一生繁殖后代僅僅16只左右；豬也不過百頭。采用胚胎移植則使優(yōu)良母畜免去 了冗長的妊娠期，胚胎取出后不久即可再次發(fā)情、配種和受精，從而能在一定時間內(nèi)產(chǎn)生較多的后代。目前在許多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家胚胎移植均已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展階段。在我國，這一技術(shù)起步較晚，我國從七十年代開始對胚胎生物工程技術(shù)進(jìn)行研究，八十年代后發(fā)展迅速。先后采用胚胎移植技術(shù)成功對奶牛、波爾山羊進(jìn)行擴繁。由于各種原因，建國以來我國養(yǎng)馬業(yè)日漸消退，因此國內(nèi)馬的胚胎移植技術(shù)也鮮有研究。但是隨著現(xiàn)代馬術(shù)運動的興起，我國養(yǎng)馬業(yè)開始復(fù)蘇，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)進(jìn)行良種馬匹的擴繁成為改良我國馬匹品種以適應(yīng)現(xiàn)代馬術(shù)運動的一條捷徑。由于馬屬動物的卵巢結(jié)構(gòu)有其獨特性，因此導(dǎo)致了馬屬動物的生理特點及排卵規(guī)律有別于其他動物。雖然牛羊等胚胎移植技術(shù)已經(jīng)成熟化，但并不適用于馬屬動物。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高進(jìn)口良種馬匹的繁育能力，本發(fā)明實施例提供了一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其中，所述移植方法包括以下步驟
檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養(yǎng)液的多孔培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗6 10次；
裝胚步驟在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
所述檢胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括備胚步驟，所述備胚步驟為于供體母馬排卵后6^8天使用Y型管沖胚裝置進(jìn)行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液，或者準(zhǔn)備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養(yǎng)液的胚胎混合液。所述備胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括排卵調(diào)控步驟，所述排卵調(diào)控步驟為于供體母馬和/或受體母馬發(fā)情期、卵泡直徑> 35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1200-1800單位/匹O
所述備胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括發(fā)情調(diào)控步驟，所述發(fā)情調(diào)控步驟為于供體母馬和/或受體母馬黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 15-0. 3mg/匹。
所述裝胚步驟之后還可以進(jìn)一步包括移植步驟，所述移植步驟為將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內(nèi)，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內(nèi)，插入移植槍內(nèi)芯，將胚胎送入受體母馬子宮。
所述備胚步驟中的所述Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導(dǎo)管和集卵杯，所述Y型管·的一端連接所述帶氣囊導(dǎo)管，用于通過所述Y型管向供體母馬子宮內(nèi)灌注沖胚液，或者通過所述Y型管向所述集卵杯內(nèi)輸送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端帶有集卵控制開關(guān)，連接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端帶有沖胚控制開關(guān)，連接盛放沖胚液的容器。
所述洗胚步驟中的所述胚胎營養(yǎng)液包含以下成分氯化鈉6 10g/L，氯化鉀O. Γ0. 3g/L，磷酸氫二鈉f I. 5 g/L，磷酸二氫鉀O. f0. 3 g/L，氯化鈣O. 05、. 15 g/L，氯化鎂0.05、. 15 g/L，體積百分比為O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或體積百分比為1% 10%的犢牛血清，青霉素9(Γ110萬單位/升，鏈霉素5(Γ100萬單位/升。
所述洗胚步驟中的所述多孔培養(yǎng)板優(yōu)選為8孔培養(yǎng)板，且體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次。
本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是本發(fā)明實施時選擇進(jìn)口優(yōu)良馬匹作為供體母馬，選擇國產(chǎn)母馬作為受體母馬，根據(jù)母馬生理特點、排卵規(guī)律，采用非手術(shù)法進(jìn)行沖胚、體視顯微鏡下檢胚以及洗胚，并采用非手術(shù)法將胚胎移植給生理周期同步的受體母馬；還可以采用人工干預(yù)的方式對供受體母馬進(jìn)行發(fā)情調(diào)控、排卵調(diào)控。本發(fā)明可使每匹供體母馬年產(chǎn)有效胚胎6 12枚，鮮胚移植成功率可達(dá)85%，本發(fā)明不需要麻醉和手術(shù)，極大地提高了供受體母馬的利用率。檢胚時，按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，能夠全面徹底的把所有胚胎找到，并利于判斷哪個或哪些是適合移植的胚胎；裝胚時，將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，能夠使胚胎始終處于液體中間，不會向兩側(cè)滑落而造成胚胎丟失。
具體實施例方式為了提高進(jìn)口良種馬匹的繁育能力，使進(jìn)口良種馬匹可年產(chǎn)胚胎6-12枚，從而達(dá)到快速繁育進(jìn)口優(yōu)良馬種以適應(yīng)現(xiàn)代馬術(shù)運動的需要的目的，本發(fā)明提供了一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法。
實施例I:
一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
備胚步驟準(zhǔn)備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養(yǎng)液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養(yǎng)液的8孔培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。其中，洗胚步驟中的胚胎營養(yǎng)液包含以下成分氯化鈉8g/L，氯化鉀O. 2 g/L，磷酸氫二鈉I. 2 g/L，磷酸二氫鉀O. 15 g/L，氯化鈣O. 12 8/1，氯化鎂0.08 g/L，體積百分比為O. 4 %的牛血清白蛋白，青霉素100萬單位/升，鏈霉素80萬單位/升。
實施例2
一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
備胚步驟于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進(jìn)行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養(yǎng)液的8孔培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。移植步驟將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內(nèi)，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內(nèi)，插入移植槍內(nèi)芯，將胚胎送入受體母馬子宮。其中，備胚步驟中的Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導(dǎo)管和集卵杯，Y型管的一端連接帶氣囊導(dǎo)管，用于通過Y型管向供體母馬子宮內(nèi)灌注沖胚液，或者通過Y型管向集卵杯內(nèi)輸送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端帶有集卵控制開關(guān)，連接集卵杯；￥型管的第三端帶有沖胚控制開關(guān)，連接盛放沖胚液的容器。其中，洗胚步驟中的胚胎營養(yǎng)液包含以下成分氯化鈉10g/L，氯化鉀O. 3 g/L，磷酸氫二鈉I. 35g/L，磷酸二氫鉀O. 2g/L，氯化鈣O. 08g/L,氯化鎂O. I g/L,體積百分比為6%的犢牛血清，青霉素110萬單位/升，鏈霉素60萬單位/升。
實施例3
一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟
發(fā)情調(diào)控步驟為于黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 2mg/匹。使用PGF2 α后I 3天母馬即可進(jìn)入發(fā)情期。
排卵調(diào)控步驟為于母馬發(fā)情期、卵泡直徑> 35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1500單位/匹。使用hCG后24 48小時母馬即可完成排卵。備胚步驟于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進(jìn)行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液。檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，直至找到適合移植的胚胎；
洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養(yǎng)液的8孔培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次，最后一孔液體留作裝胚用；
裝胚步驟在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
·
移植步驟將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內(nèi)，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內(nèi)，插入移植槍內(nèi)芯，將胚胎送入受體母馬子宮。其中，備胚步驟中的Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導(dǎo)管和集卵杯，Y型管的一端連接帶氣囊導(dǎo)管，用于通過Y型管向供體母馬子宮內(nèi)灌注沖胚液，或者通過Y型管向集卵杯內(nèi)輸送胚胎或混有胚胎的混合液；Y型管的另一端帶有集卵控制開關(guān)，連接集卵杯；￥型管的第三端帶有沖胚控制開關(guān)，連接盛放沖胚液的容器。其中，洗胚步驟中的胚胎營養(yǎng)液包含以下成分氯化鈉10g/L，氯化鉀O. 3 g/L，磷酸氫二鈉I. 35g/L，磷酸二氫鉀O. 2g/L，氯化鈣O. 08g/L,氯化鎂O. I g/L,體積百分比為6%的犢牛血清，青霉素110萬單位/升，鏈霉素60萬單位/升。
移植試驗
種公馬歐洲進(jìn)口良種溫血馬4匹。供體母馬歐洲進(jìn)口良種溫血馬10匹。受體母馬國產(chǎn)母馬120匹。試驗時間及移植方法采用本發(fā)明實施例3的移植方法進(jìn)行移植試驗。移植數(shù)量按月統(tǒng)計。實驗地點青島即墨鰲山衛(wèi)馬匹繁育基地。試驗數(shù)據(jù)見表I。表I每月移植數(shù)量和懷孕數(shù)量統(tǒng)計表
—|3月|4月|5月 |6月|7月|8月|9月|10月
移植數(shù)28~ 12 ~ 15了4Ti125
懷孕數(shù)26~ 10 ~ 13了312114
移植成功率1100%175% 183. 3% |86. 7%\92. 9%|80% |91. 7%丨80%
由表I能夠看到，通過本發(fā)明實施例3的移植方法進(jìn)行胚胎移植，能夠大大提高進(jìn)口良種馬匹的繁育能力，每匹每年能成功產(chǎn)胎6-12枚,移植成功率平均為86. 2%。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述移植方法包括以下步驟 檢胚步驟將含有胚胎的胚胎混合液，在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下按照從左到右、從上到下的“S”路線逐格進(jìn)行檢查，直至找到適合移植的胚胎； 洗胚步驟將檢胚步驟找到的胚胎放入裝有胚胎營養(yǎng)液的多孔培養(yǎng)板中，體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗6 10次； 裝胚步驟在無菌操作臺內(nèi)的體視顯微鏡下將胚胎按照液體-氣體-液體-胚胎-液體-氣體-液體的順序裝入移胚管，備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述檢胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括備胚步驟，所述備胚步驟為于供體母馬排卵后61天使用Y型管沖胚裝置進(jìn)行沖胚獲得包含胚胎和沖胚液的胚胎混合液，或者準(zhǔn)備好通過體外受精方式獲得的含有胚胎和培養(yǎng)液的胚胎混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括排卵調(diào)控步驟，所述排卵調(diào)控步驟為于供體母馬和/或受體母馬發(fā)情期、卵泡直徑≥35mm時靜脈注射hCG，使用劑量為1200-1800單位/匹。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟之前還可以進(jìn)一步包括發(fā)情調(diào)控步驟，所述發(fā)情調(diào)控步驟為于供體母馬和/或受體母馬黃體生成的第5 14天肌肉注射PGF2 α，使用劑量為O. 15-0. 3mg/匹。
5.根據(jù)權(quán)利要求I一4任一所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述裝胚步驟之后還可以進(jìn)一步包括移植步驟，所述移植步驟為將裝好胚胎的移植管放入胚胎移植槍內(nèi)，清洗并擦干受體母馬外陰后，將移植槍送入母馬子宮內(nèi)，插入移植槍內(nèi)芯，將胚胎送入受體母馬子宮。
6.根據(jù)權(quán)利要求I一5任一所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述備胚步驟中的所述Y形管沖胚裝置包括Y型管、帶氣囊導(dǎo)管和集卵杯，所述Y型管的一端連接所述帶氣囊導(dǎo)管，用于通過所述Y型管向供體母馬子宮內(nèi)灌注沖胚液，或者通過所述Y型管向所述集卵杯內(nèi)輸送胚胎或混有胚胎的混合液；所述Y型管的另一端帶有集卵控制開關(guān)，連接有所述集卵杯；所述Y型管的第三端帶有沖胚控制開關(guān)，連接盛放沖胚液的容器。
7.根據(jù)權(quán)利要求I一6任一所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步驟中的所述胚胎營養(yǎng)液包含以下成分氯化鈉6 10g/L，氯化鉀O. Γ0. 3 g/L，磷酸氫二鈉Γ1. 5 g/L，磷酸二氫鉀 O. Γ0. 3 g/L，氯化鈣 O. 05、. 15 g/L，氯化鎂 O. 05、. 15 g/L，體積百分比為O. 3、. 6%的牛血清白蛋白或體積百分比為1% 10%的犢牛血清，青霉素9(Γ110萬單位/升，鏈霉素5(Γ100萬單位/升。
8.根據(jù)權(quán)利要求I一7任一所述的馬的非手術(shù)胚胎移植方法，其特征在于，所述洗胚步驟中的所述多孔培養(yǎng)板為8孔培養(yǎng)板，且體視顯微鏡下逐孔洗胚，共洗7次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種馬的非手術(shù)胚胎移植方法，移植方法包括以下步驟發(fā)情調(diào)控步驟；排卵調(diào)控步驟；備胚步驟；檢胚步驟；洗胚步驟；裝胚步驟；移植步驟。本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是本發(fā)明實施時選擇進(jìn)口優(yōu)良馬匹作為供體母馬，選擇國產(chǎn)母馬作為受體母馬，根據(jù)母馬生理特點、排卵規(guī)律，采用非手術(shù)法進(jìn)行沖胚、體視顯微鏡下檢胚以及洗胚，并采用非手術(shù)法將胚胎移植給生理周期同步的受體母馬；還可以采用人工干預(yù)的方式對供受體母馬進(jìn)行發(fā)情調(diào)控、排卵調(diào)控。本發(fā)明可使每匹供體母馬年產(chǎn)有效胚胎6~12枚，鮮胚移植成功率可達(dá)85%，本發(fā)明不需要麻醉和手術(shù)，極大地提高了供受體母馬的利用率。
文檔編號A61D19/04GK102836014SQ20121032923
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者張志鵬, 榮美潔, 李成修, 邢金鳳, 張肖軍 申請人:青島德瑞駿發(fā)生物科技有限公司