適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及植株再生方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及植株再生方法，所述方法包括前處理、愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)、完整植株的形成、煉苗和移栽步驟。在前處理過(guò)程中，所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為濃度為0.01-0.1mg/L的TDZ；在愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)過(guò)程中，所用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為6-BA和IAA，6-BA的濃度為2-4mg/L，IAA的濃度為0.01-0.5mg/L。本發(fā)明不僅適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞誘導(dǎo)，還具有愈傷組織誘導(dǎo)率高、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率高、每外植體的體細(xì)胞胚數(shù)目多、實(shí)施步驟簡(jiǎn)單，實(shí)施條件不苛刻的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及植株再生方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及 植株再生方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜是一種重要的蔬菜作物，在世界10大果品中居第5位，作為一種高產(chǎn)值的經(jīng) 濟(jì)作物在世界各地被廣泛種植。隨著人民生活水平的提高，人們對(duì)西瓜種類和品質(zhì)的要求 越來(lái)越高，西瓜的育種目標(biāo)也趨向于多元化的發(fā)展。但是傳統(tǒng)的遺傳育種存在種質(zhì)資源匱 乏，育種周期太長(zhǎng)，后代表現(xiàn)出的遺傳性狀不穩(wěn)定等不足；而通過(guò)離體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化等生 物技術(shù)獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種已成為重要的植物育種手段之一。
[0003] 離體培養(yǎng)下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的類胚結(jié) 構(gòu)稱為體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚不僅可為研究細(xì)胞分化、細(xì)胞全能性機(jī)理和人工種子提高理想 實(shí)驗(yàn)體系和技術(shù)基礎(chǔ)，還具有可長(zhǎng)期保存、遺傳穩(wěn)定性商、再生頻率商的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還利于 突變體的選擇，還可作為制備原生質(zhì)體的材料。具體的，經(jīng)體細(xì)胞胚途徑再生植株對(duì)于西瓜 的快速繁殖、種質(zhì)資源的保存、優(yōu)良性狀的培育以及基因工程受體系統(tǒng)的優(yōu)化等都具有十 分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 然而，現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于西瓜體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及植株再生的成功報(bào)道卻很少，且不同 西瓜品種的組培條件差異極為顯著，成功的報(bào)道可重復(fù)性很低，且只能針對(duì)一到兩個(gè)基因 型。1993年Compton和Gray用西瓜幼胚子葉為外植體成功誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚再生，誘導(dǎo)率最 高只有7%左右，且不同基因型之間的差異很大，之后牛姍姍（2006)和宋尚偉等（2007)以 西瓜幼苗子葉為外植體，報(bào)道了最高25%和27. 5%的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率，而誘導(dǎo)所得體細(xì)胞胚 的質(zhì)量和每外植體體細(xì)胞胚發(fā)生數(shù)量也均較低或者無(wú)據(jù)可查。在組織培養(yǎng)過(guò)程中，尤其重 要的是培養(yǎng)基的選擇及其激素的添加，這對(duì)于無(wú)菌苗的質(zhì)量、愈傷組織的誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚 的發(fā)生具有重要的影響，是決定外植體體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，不同培 養(yǎng)基及激素在不同基因型上的表現(xiàn)具有很大差異性，現(xiàn)有技術(shù)仍未找到一種適用于多基因 型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及植株再生方法。
[0005] 因此，建立一個(gè)適用于多基因型的西瓜高頻體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生方法，具有 重大意義，可為西瓜的優(yōu)良育種及轉(zhuǎn)基因研究等其它相關(guān)方面研究提供良好的受體再生系 統(tǒng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適用于多基因型的西瓜高頻體 細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生方法。該方法包括以下步驟： 1)前處理：將西瓜種子剝?nèi)シN皮后進(jìn)行滅菌，再將種胚接種在含TDZ的MS培養(yǎng)基進(jìn)行 培養(yǎng)，每瓶接種8粒，接種后先置于黑暗條件下培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)溫度為23_27°C，再轉(zhuǎn)移到光 照時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，TDZ的濃度為 0- 0. I mg/L，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和6. O g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 2) 愈傷組織的誘導(dǎo)：切取子葉外植體，放入含6-BA和IAA的1/2 MS培養(yǎng)基中，先置于 黑暗條件下培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)移到光照時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C， 光照強(qiáng)度為3000 lx，6-BA的濃度為2-4mg/L，IAA的濃度為0. 01-0. 5mg/L，培養(yǎng)基中添加 30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 3) 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)：將步驟2)所得愈傷組織放入含6-BA和IAA的1/2 MS培養(yǎng)基中， 在光照時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)28 d獲得體細(xì)胞胚，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為 3000 lx，6-BA的濃度為2-4mg/L，IAA的濃度為0. 01-0. 5mg/L，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗 糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 4) 完整植株的形成：將步驟3)所得的體細(xì)胞胚放入無(wú)激素的裝有1/2 MS培養(yǎng)基的培 養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為28 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為 16 h/d，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 5) 煉苗：選取經(jīng)步驟4)培養(yǎng)后的具有3個(gè)以上葉片和5-6 cm強(qiáng)直根的健壯小苗，將 培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松放置2 d，再半開(kāi)2 d，然后再全開(kāi)2 d，半開(kāi)和全開(kāi)蓋子期間需要不斷 補(bǔ)充水分； 6) 移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)， 1- 2周后再移到室外進(jìn)行培養(yǎng)。
[0007] 所述的滅菌過(guò)程為：剝?nèi)ノ鞴戏N子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 0. 1%升萊浸泡消毒5min,最后用無(wú)菌水沖洗5次。
[0008] 所述營(yíng)養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
[0009] 優(yōu)選的，步驟1)中的TDZ濃度為0. 01mg/L。當(dāng)TDZ的濃度為0. 01mg/L時(shí)，可以獲 得最理想的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率和每外植體所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)。
[0010] 優(yōu)選的，步驟2)和步驟3)中的6-BA的濃度為3mg/L，IAA的濃度為0. 05mg/L。當(dāng) IAA的濃度為0. 05mg/L時(shí)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率和每外植體上體細(xì)胞胚數(shù)量達(dá)到最優(yōu)。
[0011] 本發(fā)明具有如下有益效果： 1、 適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚誘導(dǎo)； 2、 愈傷組織誘導(dǎo)率高、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率高、每外植體的體細(xì)胞胚數(shù)目多； 3、 實(shí)施步驟簡(jiǎn)單，實(shí)施條件不苛刻。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1 :西瓜子葉上誘導(dǎo)出的愈傷組織； 圖2 :愈傷組織上產(chǎn)生的體細(xì)胞胚； 圖3 :體細(xì)胞胚出芽； 圖4 :體細(xì)胞胚生根； 圖5 :再生苗； 圖6 :移栽苗。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 實(shí)施例1 選取大小均勻、飽滿的西瓜種子，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)シN皮，先用75%的酒精浸泡消毒 lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒6min，然后用無(wú)菌水沖洗5次，然后置于培養(yǎng)皿內(nèi)的無(wú)菌濾紙 上，用消毒后的鑷子將種胚接種在含TDZ的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種8粒。接種后先 置于黑暗條件下培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)移到16 h/d光周期條件培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照 強(qiáng)度為3000 lx，TDZ的濃度為0-0.1 mg/L，培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L，瓊脂6.0 g/L，pH值 調(diào)至6。誘導(dǎo)時(shí)，設(shè)三組實(shí)驗(yàn)組，第一組中6-BA的濃度為2. Omg/，IAA的濃度為0. 01mg/L ; 第二組中6-BA的濃度為4. Omg/L，IAA的濃度為0. 5mg/L ;第三組中6-BA的濃度為3. Omg/ L，IAA的濃度為0. lmg/L ;實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值。
[0015] TDZ前處理對(duì)愈傷組織及體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響見(jiàn)表1。

【權(quán)利要求】
1. 適用于多基因型的西瓜體細(xì)胞胚高效誘導(dǎo)及植株再生方法，其特征在于：包括以下 步驟： 前處理：將西瓜種子剝?nèi)シN皮后進(jìn)行滅菌，再將種胚接種在含TDZ的MS培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)，每瓶接種8粒，接種后先置于黑暗條件下培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，再轉(zhuǎn)移到光照 時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，TDZ的濃度為 0- 0? I mg/L，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 愈傷組織的誘導(dǎo)：切取子葉外植體，放入含6-BA和IAA的1/2 MS培養(yǎng)基中，先置于黑 暗條件下培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)移到光照時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光 照強(qiáng)度為3000 lx，6-BA的濃度為2-4mg/L，IAA的濃度為0. 01-0. 5mg/L，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)：將步驟2)所得愈傷組織放入含6-BA和IAA的1/2 MS培養(yǎng)基中，在 光照時(shí)間為16 h/d的條件培養(yǎng)28 d獲得體細(xì)胞胚，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，6-BA的濃度為2-4mg/L，IAA的濃度為0. 01-0. 5mg/L，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和 6.0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 完整植株的形成：將步驟3)所得的體細(xì)胞胚放入裝有不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基的培 養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為28 d，培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度為3000 lx，光照時(shí)間為 16 h/d，培養(yǎng)基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的瓊脂，pH值調(diào)至6 ; 5) 煉苗：選取經(jīng)步驟4)培養(yǎng)后的具有3個(gè)以上葉片和5-6 cm強(qiáng)直根的健壯小苗，將 培養(yǎng)瓶的蓋子先擰松放置2 d，再半開(kāi)2 d，然后再全開(kāi)2 d，半開(kāi)和全開(kāi)蓋子期間需要不斷 補(bǔ)充水分； 6) 移栽：將煉苗完成后的植株拔起，用水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有泥炭土、珍珠巖、 草木灰和腐葉土基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，在23-27°C下，套上保鮮袋置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)， 1- 2周后再移到室外進(jìn)行培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)所述的滅菌過(guò)程為：剝?nèi)ノ鞴戏N 子的種皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最后用無(wú)菌水沖 洗5次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟6)所述營(yíng)養(yǎng)缽中泥炭土、珍珠巖、草 木灰和腐葉土基質(zhì)的質(zhì)量比為1:1:1:1。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104304032SQ201410621737
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月7日
【發(fā)明者】李煥秀, 唐懿, 孫國(guó)超, 汪志輝, 涂利華, 賴云松, 夏惠, 王迅, 呂秀蘭, 黃志 , 姜建業(yè), 謝永東, 余雪娜 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)