專(zhuān)利名稱(chēng)：一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系及其制備方法與利用該體細(xì)胞系培育雄性哺乳動(dòng)物的方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究是生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它的應(yīng)用范圍已經(jīng)滲透到基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究是指借助各種實(shí)驗(yàn)手段，使按照特定目的構(gòu)建的外源基因結(jié)構(gòu)整合到宿主動(dòng)物的基因組中，在動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并通過(guò)生殖細(xì)胞傳給后代的過(guò)程。這種在基因組中穩(wěn)定地整合有人工導(dǎo)入的外源基因的動(dòng)物稱(chēng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
在家畜的繁育過(guò)程中雄性家畜的精液中存在含有X或Y染色體的兩種精子，在受精過(guò)程中含有X染色體的精子與卵子結(jié)合所產(chǎn)生的后代為雌性，而含有Y染色體的精子與卵子結(jié)合所產(chǎn)生的后代就為雄性。而在受精過(guò)程中精子和卵子結(jié)合是隨機(jī)的，所以在家畜的正常繁育過(guò)程中子代的性別是隨機(jī)和不可能預(yù)見(jiàn)的，而家畜中因性別的不同，其所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益差別巨大。在家畜的繁殖過(guò)程中人們都渴望能夠得到盡可能多的雌性個(gè)體，如在雞的繁育中人們希望得到盡可能多的母雞，在奶牛的繁育過(guò)程中人們總是希望得到母牛等。以奶牛為例，新出生的母牛與公牛的價(jià)格相差十倍以上，由于經(jīng)濟(jì)利益的巨大差距，人們發(fā)明了各種預(yù)先選擇或判定家畜性別的方法，例如利用細(xì)胞分離技術(shù)將家畜精液中含有Y染色體的精子分離出來(lái)，用分離后的精液進(jìn)行受精，從而提高后代中雌性家畜的比例，但這種方法需要價(jià)格十分昂貴的分離設(shè)備，而且分離的速度也很慢，不能達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的目的。分離后的精子活力也明顯下降，而且分離后的精子并不能達(dá)到100％的分離效果，用其進(jìn)行受精只能在一定程度上提高雌性后代的比例，不但費(fèi)時(shí)，而且成本很高。人們也嘗試用電泳、離心等方法將含有X染色體的精子與含有Y染色體的精子分離開(kāi)來(lái)，但到目前為止，還沒(méi)有任何一種方法可以有效的使X.Y精子完全分離的技術(shù)。人們還嘗試從家畜胚胎中取一些組織進(jìn)行PCR分析判定其性別，但這種方法對(duì)胚胎具有很大的損傷，且這種分析需要較長(zhǎng)時(shí)間，而胚胎在體外的時(shí)間和胚胎移入受體時(shí)間受到嚴(yán)格的限制，如果在時(shí)間上不能同步，將使移植效率受到影響。為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們不得不將進(jìn)行PCR分析的胚胎暫時(shí)冷凍保存起來(lái)，待PCR結(jié)果出來(lái)后再進(jìn)行解凍，這樣大大增加了操作的難度，并對(duì)胚胎產(chǎn)生進(jìn)一步的傷害。
1997年，首例體細(xì)胞克隆綿羊“Dolly”誕生的報(bào)道引起了社會(huì)各界的強(qiáng)烈關(guān)注，同時(shí)也標(biāo)志著生物領(lǐng)域的一種新的技術(shù)—哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)的成功建立。同年報(bào)道的首例利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育出的轉(zhuǎn)基因綿羊“Polly”的誕生才是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域真正的里程碑，它掀開(kāi)了體細(xì)胞核移植技術(shù)用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜的新篇章。隨后的幾年間，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的轉(zhuǎn)基因牛、山羊乃至定點(diǎn)整合有外源基因的綿羊相繼誕生。近2年來(lái)，科學(xué)家又相繼培育出定點(diǎn)敲除單拷貝(單敲除)和雙拷貝(雙敲除)α-1，3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，將該技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)展。
體細(xì)胞核移植技術(shù)與體細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)辟了一條有效途徑。該技術(shù)路線的最大特點(diǎn)主要體現(xiàn)在將基因轉(zhuǎn)移步驟提前到體細(xì)胞培養(yǎng)階段。細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移是指通過(guò)電穿孔，脂質(zhì)體，磷酸鈣沉淀以及顯微注射等轉(zhuǎn)染方法，使外源目標(biāo)基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用特定的篩選標(biāo)記，大量擴(kuò)增、富集轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，從而獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。直接利用這種已確定的整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體所培育出的克隆動(dòng)物必定全部為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜的優(yōu)勢(shì)非常明顯首先，該方法取材簡(jiǎn)便，卵母細(xì)胞可從屠宰場(chǎng)獲取，動(dòng)物體細(xì)胞來(lái)源更是豐富。其次，由于所產(chǎn)動(dòng)物絕大部分為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從而大幅度地壓縮了代孕母畜的數(shù)量，降低了生產(chǎn)成本。可以縮短原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得到形成具有生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物群系的時(shí)間；更可貴的是，利用該技術(shù)還可以獲得基因定點(diǎn)修飾的大家畜。在當(dāng)前條件下，這是其它轉(zhuǎn)基因方法所無(wú)法達(dá)到的。
熒光原位雜交(florescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標(biāo)記核酸(DNA)探針，可在染色體、細(xì)胞和組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，對(duì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)經(jīng)過(guò)缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素的抗生物素的抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用幾輪抗生物素蛋白-熒光素、生物素化的抗-抗生物素蛋白、抗生物素蛋白-熒光素的處理，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡(jiǎn)單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系。
本發(fā)明所提供的經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，它的Y染色體整合有標(biāo)記蛋白基因。
所述標(biāo)記蛋白基因優(yōu)選為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因、綠色熒光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因、或其它顏色的熒光蛋白基因。
為了便于細(xì)胞系的篩選，所述Y染色體還整合有選擇標(biāo)記基因；所述選擇標(biāo)記基因優(yōu)選新霉素抗性基因。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備上述經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系的方法，包括以下步驟1)將含有標(biāo)記蛋白基因的表達(dá)載體導(dǎo)入雄性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)；2)以所述雄性哺乳動(dòng)物Y染色體的特異序列為探針，與步驟1)中的體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交，篩選得到具有被所述標(biāo)記蛋白修飾的Y染色體的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞。
所述含有標(biāo)記蛋白基因的表達(dá)載體可通過(guò)電穿孔，脂質(zhì)體，磷酸鈣沉淀以及顯微注射等轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入雄性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)。
所述標(biāo)記蛋白基因可以選自熒光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因或β-葡萄糖醛酸酶基因，其中熒光蛋白基因優(yōu)選為增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因或綠色熒光蛋白基因，當(dāng)然也可以是其它顏色的熒光蛋白基因。
為了便于篩選，步驟1)中的表達(dá)載體還含有選擇標(biāo)記基因；所述選擇標(biāo)記基因優(yōu)選為新霉素抗性基因。
為了保證所述標(biāo)記蛋白基因和所述選擇標(biāo)記基因同時(shí)表達(dá)，所述表達(dá)載體還含有IRES(微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列。
與所述步驟1)中的體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交的探針還有標(biāo)記蛋白基因片段和/或選擇標(biāo)記基因片段。
所述雄性哺乳動(dòng)物可為雄性家畜或鼠等哺乳動(dòng)物；所述雄性家畜可為公牛、公羊、公兔或公豬等。
當(dāng)所述雄性哺乳動(dòng)物為公牛時(shí)，所述Y染色體的特異序列為公牛的Y染色體的任意特異序列；當(dāng)所述雄性哺乳動(dòng)物為公羊時(shí)，所述Y染色體的特異序列為公羊的Y染色體的任意特異序列；當(dāng)所述雄性哺乳動(dòng)物為公兔時(shí)，所述Y染色體的特異序列為公兔的Y染色體的任意特異序列；當(dāng)所述雄性哺乳動(dòng)物為公豬時(shí)，所述Y染色體的特異序列為公豬的Y染色體的任意特異序列；當(dāng)所述雄性哺乳動(dòng)物為雄鼠時(shí)，所述雄鼠的Y染色體的特異序列為雄鼠的的Y染色體的任意特異序列。
上述表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
所述熒光原位雜交中，探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接標(biāo)記法或間接標(biāo)記法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種培育雄性哺乳動(dòng)物的方法。
本發(fā)明所提供的培育雄性哺乳動(dòng)物的方法，是將上述經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞作為供核體細(xì)胞，經(jīng)體細(xì)胞克隆方法得到雄性哺乳動(dòng)物。
所述雄性哺乳動(dòng)物可為雄性家畜或鼠等哺乳動(dòng)物；所述雄性家畜可為公牛、公羊、公兔或公豬等。
所述體細(xì)胞克隆方法為常規(guī)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆方法。
本發(fā)明的原理不是將X.Y精子進(jìn)行分離，而是通過(guò)對(duì)Y染色體的基因標(biāo)記使受精后胚胎中Y染色體表達(dá)特異標(biāo)記蛋白(如熒光蛋白)，區(qū)分胚胎中有無(wú)標(biāo)記蛋白(熒光蛋白)的表達(dá)進(jìn)而對(duì)胚胎的性別進(jìn)行區(qū)分，表達(dá)標(biāo)記蛋白的胚胎為雄性胚胎，不表達(dá)標(biāo)記蛋白的胚胎為雌性胚胎。
利用本發(fā)明的細(xì)胞系經(jīng)體細(xì)胞克隆方法得到雄性哺乳動(dòng)物，用該雄性哺乳動(dòng)物受精后的胚胎將表達(dá)標(biāo)記蛋白，可大大降低篩選哺乳動(dòng)物后裔性別的成本，并使篩選的準(zhǔn)確率達(dá)100％，且對(duì)胚胎無(wú)任何損傷，將大大提高哺乳動(dòng)物的育種效率。


圖1為雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO的轉(zhuǎn)染用片段具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、Y染色體修飾有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的種公牛的體細(xì)胞的制備一、種公牛細(xì)胞系的建立取荷斯坦奶牛種公牛的耳部皮膚組織，耳部下緣背側(cè)去毛后以70％酒精清洗干凈，再用刀片從耳部下緣背側(cè)剔取面積為1cm2左右的皮膚，置于0℃的DMEM/F12中盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，以PBS和70％酒精清洗數(shù)遍后剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍后分批植塊于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6-7d，每2d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化傳代2-3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO凍存。這樣，經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、冷凍等體外培養(yǎng)操作，建立了種公牛成纖維細(xì)胞系。
二、構(gòu)建雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO1、雙標(biāo)記選擇載體的構(gòu)建以EcoRI、XbaI雙酶切質(zhì)粒pCE321-FL(購(gòu)自Clontech公司)和質(zhì)粒pCMV-EGFP-IRES-NEO(購(gòu)自Clontech公司)，將質(zhì)粒pCMV-EGFP-IRES-NEO中細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子后的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)攜帶的新霉素抗性基因(Neor)插入到質(zhì)粒pCE321-FL中由細(xì)胞巨化病毒增強(qiáng)子(CMV-IE Enhancer)和人延伸因子1α啟動(dòng)子(pEF321)組成的5’調(diào)控區(qū)pCE321后，以pCE321替代CMV啟動(dòng)子，形成雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO。經(jīng)過(guò)酶切鑒定，表明構(gòu)建好的雙標(biāo)記選擇載體pCE-EGFP-IRES-NEO與試驗(yàn)設(shè)計(jì)完全符合。
其中，新霉素抗性基因用于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選和富集；增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因用于有效地篩選出轉(zhuǎn)基因囊胚用于胚胎移植，以確保培育出的克隆動(dòng)物全為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，IRES(微小RNA病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))保證EGFP和Neor能同時(shí)表達(dá)。
質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO經(jīng)SalI和AscI雙酶切后，經(jīng)QIAGEN公司的QIAEX II試劑盒純化回收大片段，獲得線性雙標(biāo)記選擇載體，溶于滅菌超純水中，-20℃保存，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
三、基因轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選可用下述兩種方法中的任意一種進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。
1、電穿孔介導(dǎo)的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移方法(1)于轉(zhuǎn)染前2d，用胰蛋白酶溶液消化種公牛成纖維細(xì)胞系。將1×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)接于100ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加4ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2)轉(zhuǎn)染前，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，挑選生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)好的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。
(3)用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。以400g離心5min沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀用pH7.4的PBS洗1次。將細(xì)胞重新懸浮于1mlPBS中。
(4)在含有5×105細(xì)胞的細(xì)胞懸液中加入1-10ug純化的轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA?；旌虾筠D(zhuǎn)入電擊杯中。
(5)以1.2KV/cm的電場(chǎng)強(qiáng)度和1ms的脈沖時(shí)間，電擊細(xì)胞。
(6)將電擊后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入100ml的培養(yǎng)瓶中。加入4ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2d后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)恢復(fù)，加入G418使其終濃度為200-800ug/ml。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6-14d后，挑選陽(yáng)性克隆細(xì)胞。
2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染
(1)-(3)與步驟1相同。
(4)在兩個(gè)1.5ml離心管中分別配制下列溶液A將1-5ug轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA溶于100ul未添加血清的DMEM培養(yǎng)液中。
B將20ul脂質(zhì)體于80ul未添加血清的DMEM培養(yǎng)液混合。
(5)合并溶液A和B，輕輕混合后于室溫下放置20min。然后，加入800ul未添加血清的培養(yǎng)液。
(6)將質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體和未添加血清的培養(yǎng)液的混合物滴加在培養(yǎng)瓶中待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
(7)倒掉轉(zhuǎn)染液，加入4ml含10％的DMEM完全培養(yǎng)液。于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時(shí)，在培養(yǎng)瓶中加入G418溶液，使其終濃度為200-800ug/ml。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
(8)6-14d后挑選陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，消化后轉(zhuǎn)到96孔板中分別培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，每個(gè)細(xì)胞株取一部分細(xì)胞凍存，另一部分細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞染色體制備。
四、從貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞準(zhǔn)備中期染色體細(xì)胞為了獲得匯合度大約為70％且處于活性狀態(tài)的細(xì)胞，在標(biāo)本制備的前1-2天，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。其步驟為1.檢查有絲分裂細(xì)胞的存在情況。
a.在培養(yǎng)物中加秋水仙素酰胺至終濃度為0.1ug/ml，37℃孵育60-90分鐘。
b.用0.2％胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化。用銳利的吸頭吸取培養(yǎng)瓶上的變圓的有絲分裂細(xì)胞。
c.繼續(xù)對(duì)中期染色體細(xì)胞進(jìn)行低滲處理，便于染色體細(xì)胞涂片的制備。
2.800g離心5-10分鐘，沉淀細(xì)胞，保留0.2-0.6ml上清，棄去其余上清。
3.將細(xì)胞重懸于DMEM培養(yǎng)液上清中，小心加入大約1/2體積的37℃預(yù)熱的0.075mol/L KCL，邊加邊小心攪動(dòng)混合。
4.37℃孵育12-20分鐘。
5.按步驟2離心沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀重新懸浮。
6.逐滴加入新制備的冰冷的固定劑(甲醛∶冰醋酸∶水＝4∶1∶5)10ml以固定細(xì)胞，加時(shí)要攪動(dòng)混合。
7.將細(xì)胞置于冰上5分鐘。
8.按步驟5離心沉淀細(xì)胞，按步驟6重復(fù)固定細(xì)胞，細(xì)胞放置冰上30分鐘。
9.按步驟5和6重復(fù)固定5次，固定期間不需要冰浴。
10.將細(xì)胞懸液滴在預(yù)先洗好的載玻片上。
11.70％，90％和100％系列酒精脫水，每次5分鐘，然后空氣干燥。
五、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞染色體的原位雜交(FISH)分別以公牛Y染色體特異基因Sry(睪丸決定基因)的5.8Kb核苷酸序列片斷(購(gòu)自法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院(INRI)，基因編號(hào)INRIBac8784)和pCE-EGFP-IRES-NEO雙標(biāo)基因的10.2kb核苷酸序列片斷(用NotI酶切質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO后，經(jīng)QIAGEN公司的QIAEX II試劑盒純化回收得到的片段)為探針對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞染色體進(jìn)行原位雜交(FISH)。具體方法為1、DNA探針制備利用BioNick Labeling system試劑盒(Invitrogen)按照如下方法制備DNA探針1)將離心管置于冰上，加入下列組份5ul 10×dNTP混合物總量1ug的DNA加ddH2o至45ul5ul 10×酶混合物；2)混合均勻，12000rpm離心5秒鐘；3)16℃水浴，電泳檢測(cè)(檢測(cè)過(guò)程中探針置于冰上，暫時(shí)中止)，達(dá)到所要片段大小(360bp)后，加入5ul終止緩沖液，終止反應(yīng)；4)加入1/10體積3M NaAc和2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，混合均勻后放入-70℃冰箱15分鐘。12000rpm離心10分鐘，空氣干燥沉淀，用50ul ddH2o重懸，保存于-20℃。
2、探針及標(biāo)本變性1)探針變性探針中加10ul雜交液(50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、2×SSC)，吹打均勻，離心，65℃預(yù)熱5分鐘，于75℃變性5分鐘，立即冰置5-10分鐘(放至雜交前)。
2)玻片標(biāo)本變性雜交標(biāo)本于50℃烤片至少2小時(shí)。標(biāo)本置于70-75℃，70％甲酰胺/2×SSC中變性2-3分鐘。立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)70％、90％和100％冰乙醇系列脫水各5分鐘。室溫干燥。
3、原位雜交1)雜交將已變性的DNA探針滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，RubberCement封片，置于潮濕暗盒中37℃雜交過(guò)夜(約15-17h)。
2)洗脫①雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，去掉蓋玻片。
②將已雜交的玻片標(biāo)本于42-50℃，50％甲酰胺/2×SSC中洗滌4次，每次5分鐘。
③于42-50℃，1×SSC中洗滌3次，每次5分鐘。
④在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗。
3)免疫熒光檢測(cè)與信號(hào)放大，其步驟為①加100-200ul封閉液I(3％BSA/4×SSC/0.1％Tween20)于標(biāo)本上，37℃溫育15-30分鐘。再加100-200ul avidin-FITC于標(biāo)本上，37℃溫育30-60分鐘。
②取出標(biāo)本，于42-50℃，4×SSC/0.1％Tween20中洗滌3次，每次5分鐘。
③加100-200ul封閉液II(3％BSA/4×SSC/5％羊血清/0.1％Tween20)于標(biāo)本上，37℃溫育15-30分鐘。加100-200ul antiavidin于標(biāo)本上，37℃溫育30-60分鐘。
④重復(fù)步驟②-①-②步驟。
⑤于2×SSC中室溫輕洗。
⑥玻片于洗滌液中取出，自然干燥，PI/antifade復(fù)染，蓋上蓋玻片，熒光下觀察。挑選在同一染色體上雜交有公牛Y染色體特異序列和雙標(biāo)基因2種探針熒光信號(hào)的細(xì)胞，并以同批冷凍保存的細(xì)胞作為體細(xì)胞克隆和核供體細(xì)胞。
實(shí)施例2、利用Y染色體修飾有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的種公牛的體細(xì)胞培育種公牛1、卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)致密的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/mLbFSH+0.01U/mL bLH+1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)18-20h后，將成熟的卵母細(xì)胞放入0.1％透明質(zhì)酸酶的管內(nèi)振蕩2-3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全脫離，選擇形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體。
2、核移植程序和克隆胚胎的體外培養(yǎng)將帶有第一極體的卵母細(xì)胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/mL細(xì)胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內(nèi)徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細(xì)胞內(nèi)的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養(yǎng)箱中備用。
將血清饑餓2-4d的通過(guò)染色體原位雜交(FISH)鑒定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，用20μm直徑玻璃管將直徑為10-12μm的公牛轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移入去了核的卵母細(xì)胞透明帶內(nèi)，然后將其放入Zimmerman液中平衡(現(xiàn)用現(xiàn)配)3-5分鐘后放入融合槽內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)卵細(xì)胞使供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸而與電場(chǎng)垂直，同時(shí)在場(chǎng)強(qiáng)為2.5kV/cm的直流脈沖場(chǎng)中，在脈沖時(shí)間為10μs、脈沖次數(shù)為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速移入M199+10％FBS液中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，挑選融合胚進(jìn)行下一步激活處理。將重組胚放入5mMA23178(sigma C-7522)液中5分鐘后換到含有5ug/ml細(xì)胞松馳素B+10ug/ml放線菌酮的激活液中5小時(shí)，待重組胚被激活后換入CR1aa+5％FBS在38.5℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后觀察核移植胚的囊胚發(fā)育率，結(jié)果表明克隆囊胚發(fā)育率為20％-60％。
3、胚胎移植與妊娠檢測(cè)將形態(tài)優(yōu)良的第7d的雙標(biāo)記基因克隆囊胚移入同期的受體牛的子宮角內(nèi)。在移植后的第30d對(duì)受體母牛進(jìn)行B超檢測(cè)以確定受胎情況，并分別在移植后的第60d和第90d進(jìn)行直腸檢測(cè)以確定妊娠率，妊娠率為40％。
4、對(duì)妊娠母牛按常規(guī)飼養(yǎng)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)280天，妊娠母牛正常分娩，得到體細(xì)胞克隆種公牛。
實(shí)施例3、Y染色體修飾有增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性基因的種公牛的生物學(xué)鑒定采集轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆牛耳部組織樣，按常規(guī)方法提取基因組DNA。按照下述方法進(jìn)行PCR鑒定和性別鑒定1、PCR鑒定用一對(duì)PCR引物(上游5’-TGC AGT GCT TCA GCC GCT AC-3’下游5’-CTCAGG TAG TGG TTG TCG GG-3’)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因克隆?；蚪MDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以普通荷斯坦奶牛基因組DNA作為陰性對(duì)照，以雙標(biāo)記載體質(zhì)粒pCE-EGFP-IRES-NEO作為陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min；94℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因牛的擴(kuò)增產(chǎn)物為全長(zhǎng)約384bp的DNA片段，而非轉(zhuǎn)基因牛的擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)該條帶。
2、標(biāo)記基因修飾Y染色體轉(zhuǎn)基因牛的表達(dá)和子代性別的鑒定；(1)將培育得到的其Y染色體被熒光蛋白基因修飾的轉(zhuǎn)基因公牛與同期發(fā)情的母牛進(jìn)行交配四至七天后將母牛體內(nèi)的胚胎回收，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，將發(fā)有熒光的胚胎挑出。
再用PCR法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，用一對(duì)PCR引物(上游5’-TGC AGT GCT TCAGCC GCT AC-3’，下游5’-CTC AGG TAG TGG TTG TCG GG-3’)對(duì)該胚胎基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min；94℃30sec，62℃30sec，72℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。結(jié)果表明該胚胎的擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)為約384bp，說(shuō)明該胚胎為雄性胚胎。
(2)取Y染色體轉(zhuǎn)有熒光蛋白基因的轉(zhuǎn)基因公牛的精液，加入到含有肝素(50ug/ml)、咖啡因(0.01nmol/ml)、BSA(3.0mg/ml)的BO液中稀釋洗滌兩遍(以1800轉(zhuǎn)/分鐘，離心8分鐘)，去上清后再加入1ml相同BO液混合均勻后，取50ul加到50ul的含有20-30枚卵母細(xì)胞的受精液(含10mg/ml BSA，不含脂肪酸的BO液)中共培養(yǎng)5小時(shí)后，轉(zhuǎn)入到體外培養(yǎng)液CR1aa中繼續(xù)培養(yǎng)5到7天，待受精卵發(fā)育到桑椹至囊胚期用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，含有綠色熒光的胚胎表明該胚胎含有Y染色體，是雄性胚胎，反之為雌性胚胎。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，它的Y染色體整合有標(biāo)記蛋白基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，其特征在于所述標(biāo)記蛋白基因?yàn)闊晒獾鞍谆?、?半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因或β-葡萄糖醛酸酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，其特征在于所述熒光蛋白基因?yàn)樵鰪?qiáng)綠色熒光蛋白基因或綠色熒光蛋白基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，其特征在于所述Y染色體還整合有選擇標(biāo)記基因，所述選擇標(biāo)記基因優(yōu)選為新霉素抗性基因。
5.一種獲得經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系的方法，包括以下步驟1)將含有標(biāo)記蛋白基因的表達(dá)載體導(dǎo)入雄性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)；2)以所述雄性哺乳動(dòng)物Y染色體的特異序列為探針，與步驟1)中的體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交，篩選得到具有被所述標(biāo)記蛋白修飾的Y染色體的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的表達(dá)載體還含有選擇標(biāo)記基因，所述選擇標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾乜剐曰颉?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述標(biāo)記蛋白基因?yàn)闊晒獾鞍谆颉ⅵ?半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因或β-葡萄糖醛酸酶基因；所述表達(dá)載體還含有IRES序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于與所述步驟1)中的體細(xì)胞進(jìn)行熒光原位雜交的探針還有標(biāo)記蛋白基因片段和/或選擇標(biāo)記基因片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述雄性哺乳動(dòng)物為雄性家畜或鼠；所述雄性家畜為公牛、公羊、公兔或公豬。
10.一種培育雄性哺乳動(dòng)物的方法，是將權(quán)利要求1、2、3或4所述的經(jīng)標(biāo)記基因修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞作為供核體細(xì)胞，經(jīng)體細(xì)胞克隆方法得到雄性哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系，它的Y染色體整合有標(biāo)記蛋白基因；所述標(biāo)記蛋白基因?yàn)闊晒獾鞍谆颉ⅵ拢肴樘擒彰富?、熒光素酶基因或β－葡萄糖醛酸酶基因。本發(fā)明還提供了制備上述經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系的方法與利用上述經(jīng)修飾的雄性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞系培育雄性哺乳動(dòng)物的方法。
文檔編號(hào)C12N5/16GK1745626SQ20041007450
公開(kāi)日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2004年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月6日
發(fā)明者戴蘊(yùn)平, 李寧 申請(qǐng)人:戴蘊(yùn)平, 李寧