專利名稱：促進(jìn)針葉樹體細(xì)胞胚成熟的培養(yǎng)基和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外制備植物胚胎，和可選擇地從植物胚胎中生成植物的方法。
背景技術(shù)：
用針葉樹，如松樹和冷杉等樹木來生產(chǎn)木質(zhì)產(chǎn)品的需求不斷增加。一個(gè)有計(jì)劃的解決該問題的方案是對(duì)擁有需要的特性，如生長速率快的個(gè)體樹木進(jìn)行鑒別，并通過體細(xì)胞克隆生產(chǎn)眾多的，遺傳上完全相同的、優(yōu)勢樹木的克隆。
體細(xì)胞克隆是一種由不同于雌雄配子的樹木組織得到遺傳上完全相同的樹木的方法。在一種體細(xì)胞克隆的方法中，植物細(xì)胞培養(yǎng)在含有激素，如植物激素和/或細(xì)胞激動(dòng)素的初期培養(yǎng)基中，從而開始形成能夠發(fā)展成體細(xì)胞胚胎的胚胎發(fā)生細(xì)胞。然后，胚胎發(fā)生細(xì)胞被進(jìn)一步培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，從而促使胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖以形成前子葉胚胎(也就是不擁有子葉的胚胎)。增殖的胚胎發(fā)生細(xì)胞隨后被培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中以促進(jìn)子葉體細(xì)胞胚的發(fā)育，該細(xì)胞可以，比如被置于人造種子中并播種在土壤里，發(fā)芽長成針葉樹的秧苗。秧苗可以被移種到后續(xù)成長的生長位置，最終得到木材或木制產(chǎn)品。
有關(guān)針葉樹胚胎的體細(xì)胞克隆的一個(gè)持續(xù)性問題是刺激能夠發(fā)芽生成植體的體細(xì)胞胚的有效形成。優(yōu)選的是體外形成的針葉樹的體細(xì)胞，它們與針葉樹種子體內(nèi)形成的針葉樹合子胚細(xì)胞，在物理上和生理學(xué)上是相似的或完全相同的。因此一直需要一種由針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞制備能夠萌發(fā)的針葉樹的體細(xì)胞胚的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供了制備成熟的針葉樹體細(xì)胞胚的方法。本發(fā)明的方法含有如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)前子葉的針葉樹的體細(xì)胞胚以形成子葉的針葉樹體細(xì)胞胚；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)產(chǎn)生的子葉針葉樹體細(xì)胞胚，以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。在一些具體實(shí)施方式
中，成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步包含蔗糖和/或脫落酸。
依據(jù)本發(fā)明的方法制備的成熟針葉樹體細(xì)胞胚群與根據(jù)其它同等的對(duì)照方法得到的針葉樹體細(xì)胞胚群相比，發(fā)芽生成針葉樹植株的效率更高，對(duì)照方法中不包括在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠(gellangum)的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)子葉的針葉樹體細(xì)胞胚以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚的步驟。通過本發(fā)明方法的一些具體實(shí)施方式
產(chǎn)生的成熟針葉樹體細(xì)胞胚，其發(fā)芽生成植株的效率至少是以前對(duì)照方法的兩倍。
本發(fā)明的方法對(duì)于制備成熟的針葉樹體細(xì)胞胚是很有用的，如果需要的話，所述體細(xì)胞胚的特性可進(jìn)一步被鑒定，例如通過遺傳或生物化學(xué)的方法，和/或可發(fā)芽生成針葉樹。因此，本發(fā)明的方法例如可被用來制備單個(gè)的擁有一種或多種需要的特性，比如快速生長率或木材品質(zhì)提高的針葉樹的克隆。舉例來說，本發(fā)明的成熟的針葉樹的體細(xì)胞胚群可被用來生產(chǎn)擁有一種或多種需要的特性，如快速生長率或木材品質(zhì)提高的針葉樹的林分或森林。該樹木可用來生產(chǎn)木制產(chǎn)品。
另一方面，本發(fā)明提供依據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的成熟的針葉樹的體細(xì)胞胚。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述除非有特殊的定義，這里所用的所有術(shù)語與本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的意思相同。
這里所使用的術(shù)語“子葉胚胎”是指一種具有非常明確的，被延伸的雙極結(jié)構(gòu)的胚胎，該雙極結(jié)構(gòu)的一端是潛在的具有一個(gè)或多個(gè)清楚可見的子葉原型的分生組織中心，相對(duì)的一端是潛在的胚軸?！扒白尤~胚胎”是指一種還不具有子葉的胚胎。
除非另外規(guī)定，所有的濃度值都是以重量體積百分比的形式來表示。
一方面，本發(fā)明提供制備成熟的針葉樹體細(xì)胞胚的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)前子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成子葉針葉樹體細(xì)胞胚；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)中形成的子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。根據(jù)本發(fā)明，成熟的針葉樹體細(xì)胞胚是指能夠發(fā)芽生成植株的胚胎。本發(fā)明的方法可被用來從任何針葉樹，例如松屬(genus pinus)如水洼松木(Pinus taeda)和Radiata松木的成員中產(chǎn)生子葉體細(xì)胞胚。再次以實(shí)施例的方式給出了通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生花旗松(Douglas fir)的胚胎。
前子葉針葉樹的體細(xì)胞胚可以由針葉樹體細(xì)胞來制備，所述體細(xì)胞諸如從針葉樹的合子胚胎中得到的細(xì)胞。舉個(gè)例子，由針葉樹合子胚胎得到的細(xì)胞可用激素誘導(dǎo)以形成胚胎的胚柄細(xì)胞團(tuán)(ESMs)，該細(xì)胞團(tuán)依照本發(fā)明處理以產(chǎn)生成熟的針葉樹的體細(xì)胞胚。ESMs可以由例如分離自種子的前子葉胚胎來制備。比如，在分離前子葉胚胎前，種子進(jìn)行表面滅菌，然后將種子培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上或之中，通過萌芽和分裂使得ESMs形成，ESMs包含處在增殖過程中的早期胚胎。ESMs一般是培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，以形成前子葉體細(xì)胞胚。下面進(jìn)一步描述適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)和維持培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的方法中，前子葉體細(xì)胞胚是培養(yǎng)在含有低于0.5％結(jié)冷膠(gellan gum)的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上的，以促進(jìn)子葉胚胎的發(fā)育。雖然發(fā)育培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基，但通常是固體培養(yǎng)基。發(fā)育培養(yǎng)基一般含有營養(yǎng)物以供養(yǎng)體細(xì)胞胚。發(fā)育培養(yǎng)基中可以含有麥芽糖作為體細(xì)胞胚首要的或唯一的糖源。麥芽糖的使用濃度在大約1％到大約2.5％的范圍內(nèi)。
合適的發(fā)育培養(yǎng)基一般不包括生長促進(jìn)激素，如植物激素和細(xì)胞激動(dòng)素。發(fā)育培養(yǎng)基可以含有結(jié)冷膠。結(jié)冷膠是一種市售的，比如GELRITE和PHYTAGEL名下的膠凝劑。如果發(fā)育培養(yǎng)基中包含結(jié)冷膠，其濃度低于約0.5％，一般在大約0％到大約0.4％的濃度范圍內(nèi)。
發(fā)育培養(yǎng)基中的同滲重量摩爾濃度可以調(diào)整到需要的范圍內(nèi)，比如從大約250mM/Kg到大約450mM/Kg。一般350mM或較高是有利的。這里，適當(dāng)?shù)陌l(fā)育培養(yǎng)基的例子是實(shí)施例1所列的BM3培養(yǎng)基。
前子葉針葉樹的體細(xì)胞胚可以被培養(yǎng)在含有低于約0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上5周到12周的一段時(shí)間內(nèi)，例如從8周到10周，在10℃到30℃的溫度下，例如從15℃到25℃，或20℃到23℃。
依照本發(fā)明，子葉針葉樹體細(xì)胞胚從含有低于約0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)，以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。依照本發(fā)明方法制備的成熟的針葉樹體細(xì)胞胚比其它同等的方法而得到的針葉樹體細(xì)胞胚具有較高的發(fā)芽率，所述同等方法不包括在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚的步驟。成熟培養(yǎng)基可以是液體的或固體的。成熟培養(yǎng)基也可以包含營養(yǎng)物以供養(yǎng)體細(xì)胞胚，和一種或多種用來調(diào)整培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度到所需范圍，例如在130-250mOsomo/kg之間的試劑。培養(yǎng)基的pH也可以調(diào)整到所需的值，如pH5.5到pH5.8之間。麥芽糖可以被包含在培養(yǎng)基中作為首要的或唯一的可代謝糖源。采用的麥芽糖的濃度是在大約1％到大約2.5％的范圍內(nèi)。成熟培養(yǎng)基也可以含有吸收劑成分，例如活性炭，如前面誘導(dǎo)培養(yǎng)基所述。成熟培養(yǎng)基的范例是實(shí)施例1所列的BM4培養(yǎng)基。
在一些
具體實(shí)施例方式
中，成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步包含蔗糖和/或脫落酸。成熟培養(yǎng)基中脫落酸的濃度可以在0.5mg/L到500mg/L之間。在本發(fā)明方法的一些具體實(shí)施方式
中，成熟培養(yǎng)基中脫落酸的濃度是在1mg/L到100mg/L之間。在一些具體實(shí)施方式
中，發(fā)育培養(yǎng)基中的脫落酸的濃度是在5mg/L到20mg/L之間。
在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，成熟培養(yǎng)基含有蔗糖作為首要的或唯一的可代謝糖源。采用的蔗糖的濃度是在大約1％到大約6％的范圍內(nèi)。
子葉針葉樹體細(xì)胞胚一般是培養(yǎng)在含有濃度范圍在大約0.5％到1.5％之間的結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中，并且該培養(yǎng)基可選擇含有蔗糖和/或脫落酸，在大約10℃到大約30℃的溫度下，培養(yǎng)大約1周到大約5周，例如2周到4周。
在一些
具體實(shí)施例方式
中，培養(yǎng)在成熟培養(yǎng)基中的子葉胚胎隨后在成層培養(yǎng)基中或之上，在從大約2℃到大約10℃的溫度下，被培養(yǎng)大約2周到6周的時(shí)間。成層培養(yǎng)基一般與成熟培養(yǎng)基相似或完全相同，但不含有脫落酸，并且含有的結(jié)冷膠濃度較低，一般低于大約0.5％。成層培養(yǎng)基可以含有蔗糖作為首要的或唯一的可代謝糖源。成層培養(yǎng)基的范例是實(shí)施例1中所列的BM5培養(yǎng)基。
在一些
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供制備成熟針葉樹體細(xì)胞胚的方法，包括如下步驟(a)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)針葉樹體細(xì)胞以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞；(b)在維持培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)制備的胚胎發(fā)生細(xì)胞使得胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖并且形成前子葉針葉樹體細(xì)胞胚；(c)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(b)生成的前子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成子葉針葉樹體細(xì)胞胚；和(d)在含有大約0.5％到大約1.5％之間的結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(c)生成的子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。成熟培養(yǎng)基任選地可以含有蔗糖和/或脫落酸。
因此，在一些具體實(shí)施方式
中，針葉樹的體細(xì)胞被培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或之上以產(chǎn)生胚胎發(fā)生細(xì)胞。胚胎發(fā)生細(xì)胞是能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)子葉針葉樹體細(xì)胞胚和包括例如針葉樹胚柄細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)基一般含有無機(jī)鹽和有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度一般是大約160mg/kg或更低，但可以高到170mg/kg。誘導(dǎo)培養(yǎng)基一般含有生長激素。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可以含有的激素的例子是植物生長素(例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和細(xì)胞激動(dòng)素(如6-芐基氨基腺嘌呤(BAP))。舉例來說，植物生長素可采用從1mg/L到200mg/L的濃度。細(xì)胞激動(dòng)素可采用從0.1mg/L到10mg/L的濃度。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以含有吸收劑成分，特別是當(dāng)使用的生長激素在非常高的水平時(shí)。吸收劑成分可以是任何一種在本方法實(shí)踐中所使用的濃度下對(duì)胚胎發(fā)生細(xì)胞無害的成分，該成分能夠吸收生長促進(jìn)激素，以及培養(yǎng)基中存在的有毒成分，其是植物細(xì)胞在胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的。非限制性的有效的吸收劑成分的例子包括活性炭，可溶性的聚乙烯基吡咯烷酮，不溶性的聚乙烯基吡咯烷酮，活性氧化鋁和二氧化硅凝膠。吸收劑成分可以添加的量，比如是從大約0.1g/L到大約5g/L。這里，本發(fā)明實(shí)踐中有效的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的例子是實(shí)施例1列出的BM1培養(yǎng)基。一般誘導(dǎo)培養(yǎng)基是固體的，并且可通過夾雜膠凝劑而固化。
針葉樹的體細(xì)胞一般是培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中或之上3周到10周，例如從6周到8周這樣一段時(shí)間內(nèi)，溫度從10℃到30℃，如15℃到25℃，或從20℃到23℃。
維持培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基，或者是可以被攪動(dòng)以促進(jìn)胚胎發(fā)生組織生長和增殖的液體培養(yǎng)基。維持培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度一般比誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的要高，通常是在180-400mM/kg的范圍內(nèi)。維持培養(yǎng)基可以含有供養(yǎng)胚胎發(fā)生組織的營養(yǎng)物質(zhì)，并且也可以含有激素，如一種或多種的植物生長素和/或細(xì)胞激動(dòng)素，來促進(jìn)細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)生組織的生長。維持培養(yǎng)基中激素的濃度一般比在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的要低。
盡管不是必要的，一般希望在維持培養(yǎng)基中含有麥芽糖作為唯一的或首要的可代謝糖源。麥芽糖有效濃度的例子是在從大約1％到大約2.5％的范圍內(nèi)。這里，一個(gè)合適的維持培養(yǎng)基的例子是實(shí)施例1所列出的BM2培養(yǎng)基。一般每周一次將針葉樹的胚胎發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的維持培養(yǎng)基上。
正如上面所描述的，從針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞形成的前子葉針葉樹體細(xì)胞胚是培養(yǎng)在含有低于0.5％的結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上的。子葉胚胎進(jìn)一步被培養(yǎng)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的維持培養(yǎng)基中，并且優(yōu)選培養(yǎng)基中含有蔗糖和/或脫落酸。
依據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的成熟的針葉樹體細(xì)胞胚群比其它同等的方法而得到的針葉樹體細(xì)胞胚具有較高的發(fā)芽率，所述同等方法不包括在有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成成熟的針葉樹體細(xì)胞胚的步驟。本發(fā)明方法的一些具體實(shí)施方式
產(chǎn)生的成熟針葉樹體細(xì)胞胚比其它同等的方法而得到的成熟針葉樹體細(xì)胞胚的發(fā)芽率至少高100％，所述同等方法不包括在有大約0.5％到1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)子葉針葉樹體細(xì)胞胚的步驟。
本發(fā)明方法可例如被用來制備擁有一種或多種需要的特性，如快速生長率的個(gè)體針葉樹樹木的克隆。因此，一方面本發(fā)明提供制備遺傳上完全相同的成熟的針葉樹體細(xì)胞胚群的方法。本發(fā)明這方面中的方法分別包括如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)遺傳上完全相同的前子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成子葉胚胎；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)得到的子葉針葉樹體細(xì)胞胚，培養(yǎng)基中可選擇進(jìn)一步含有蔗糖和/或脫落酸。
另一方面，本發(fā)明提供利用本發(fā)明方法制備的成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。利用本發(fā)明方法制備的成熟的針葉樹體細(xì)胞胚如果需要的話可任選地使之發(fā)芽形成針葉樹的植株，它可以長成針葉樹樹木?；蛘撸墒斓呐咛ヒ部梢员恢糜谌斯しN子中用于隨后的發(fā)芽。例如成熟的針葉樹的體細(xì)胞胚可以在固體發(fā)芽培養(yǎng)基，例如實(shí)施例1中列出的BM6培養(yǎng)基中使之發(fā)芽。發(fā)芽的植株可被轉(zhuǎn)移到土壤中使之進(jìn)一步生長。例如，在移栽到室外之前，發(fā)芽的植株可種植在溫室土壤中使之成長。一般地，成熟的針葉樹體細(xì)胞胚用光照來刺激發(fā)芽。本發(fā)明方法中的所有步驟一般除發(fā)芽外都是在暗處進(jìn)行的。
下面的實(shí)施例是用來說明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1該實(shí)施例顯示了本發(fā)明代表性的方法用來從loblolly松木來產(chǎn)生松木體細(xì)胞胚。
含有合子胚胎的雌性配子體在受精4到5周后從種子中分離出來。種子外皮被除去，進(jìn)一步地，除了刪去珠心末端，胚胎不要從周圍的配體中剖出。錐體在使用前保存在4℃。在將不成熟的胚胎從種子中分離出來前，立即消毒，先清洗和用洗滌劑處理，接著用15％的H2O2滅菌10分鐘。每次處理后，外植體用無菌去離子水徹底地清洗。
表1和表2列出了有效制備松木體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基的成分。
表1Pinus Taeda基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM)成分 濃度(mg/L)NH4NO3150.0KNO3909.9KH2PO4136.1Ca(NO3)2.4H2O236.2CaCl2.4H2O50.0MgSO4.7H2O246.5Mg(NO3)2.6H2O256.5MgCl2.6H2O50.0KI 4.15H3BO315.5MnSO4.H2O 10.5ZnSO4.7H2O14.4NaMoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O0.125CoCl2.6H2O0.125FeSO4.7H2O27.86Na2EDTA37.36麥芽糖30000.
肌醇 200酪蛋白水解物 500L-谷氨酰胺1000鹽酸硫胺素1.0鹽酸吡哆醇0.50煙酸 0.50
甘氨酸2.00Gelrite+1600pH調(diào)整到5.7+如果需要固體培養(yǎng)基時(shí)采用表2用于不同處理階段的培養(yǎng)基的成分BM1-誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BM+2，4-D(15μM)+激動(dòng)素(2μM)+BAP(2μM)BM2-維持培養(yǎng)基 BM+2，4-D(5μM)+激動(dòng)素(0.5μM)+BAP(0.5μM)當(dāng)要用固體培養(yǎng)基時(shí)加入GELRITE(1600mg/L)BM3-發(fā)育培養(yǎng)基 BM+25mg/L脫落酸+13％PEG-8000+800mg/L附加的肌醇+0.1％活性炭。加入下述的混合氨基酸L-脯氨酸(100mg/L)，L-天冬酰胺(100mg/L)，L-精氨酸(50mg/L)，L-丙氨酸(20mg/L)，和L-絲氨酸(20mg/L)。當(dāng)要用固體培養(yǎng)基時(shí)加入GELRITE(2500mg/L)。
BM4-成熟培養(yǎng)基 通過刪去麥芽糖和PEG-8000、將脫落酸降低到10g/L并加入2％的蔗糖(2％)和GELRITE(10g/L)而改變的BM3培養(yǎng)基。
BM5-成層培養(yǎng)基 通過刪去脫落酸和PEG-8000而改變的BM3。當(dāng)要用固體培養(yǎng)基時(shí)加入GELRITE(2500mg/L)。
BM6-成層培養(yǎng)基 用2％的蔗糖替換麥芽糖而改變的BM培養(yǎng)基。肌醇降低到100.0mg/L，谷氨酰胺和酪蛋白水解物降低到0.0mg/L。
FeSO4.7H2O降到13.9mg/L，而Na2EDTA降到18.6mg/L。加入0.8％的瓊脂和0.25％的活性炭。
誘導(dǎo)帶有完整胚胎的無菌配子體放在BM1固體培養(yǎng)基上并置于22℃-25℃，24小時(shí)暗光周期的環(huán)境中3-5周的時(shí)間。時(shí)間的長短是基于被培養(yǎng)的具體基因型而確定的。該時(shí)間末了，形成與原始外植體結(jié)合的白色的粘性塊狀物。顯微鏡觀察一般可見與該塊狀物結(jié)合的許多早期胚胎。這通?？设b定為具有長薄壁的胚柄與具有濃密細(xì)胞質(zhì)和巨核的小頭結(jié)合。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度在一些例子中可以高到170mM/kg。一般是大約160mM/kg或甚至更低(如150mM/kg)。
維持和增殖從誘導(dǎo)階段產(chǎn)生的塊狀物中分離的早期胚胎先放在膠化的BM2維持和增殖培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同，其中生長激素(植物生長素和細(xì)胞激動(dòng)素)降低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。該培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度一般通過提高肌醇的濃度到0.5％w/v使其從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的值升高到大約180mM/kg或更高(對(duì)于Pinus taeda而言一般在大約180-400mM/kg的范圍內(nèi))。溫度和光周期也是22℃-25℃下暗中24小時(shí)。在BM2固體培養(yǎng)基上胚胎培養(yǎng)12-14天后被轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步繼代培養(yǎng)。該液體培養(yǎng)基除了沒有膠凝劑，與BM2的成分相同。在固體維持階段末期的胚胎在外觀上一般與從誘導(dǎo)階段得到的是相似的。在液體維持培養(yǎng)基上每周繼代培養(yǎng)5到6次后，使得已形成的早期胚胎的量有所增加。這些可通過光滑的胚胎頭來證明，一般估計(jì)有超過100個(gè)具有多胚柄的單個(gè)細(xì)胞。
胚胎發(fā)育同步化的早期胚胎被轉(zhuǎn)移到固體發(fā)育培養(yǎng)基上。發(fā)育培養(yǎng)基既可以完全沒有生長激素，也可以僅含有很低的激素。一般可含有脫落酸，以利于進(jìn)一步的發(fā)育。該培養(yǎng)基中進(jìn)一步含有吸收劑成分是很有益的。吸收劑成分可以從眾多具有大表面積和/或可控孔徑的化學(xué)物質(zhì)中選取，例如活性炭，可溶的和非可溶形式的聚乙烯基吡咯烷酮，活性氧化鋁和二氧化硅凝膠。吸收劑成分的濃度一般是大約0.1-5g/L，更通常的是大約0.25-2.5g/L。含有的結(jié)冷膠的濃度大約是0.25％。
該發(fā)育培養(yǎng)基的滲透潛力基本上可以比維持培養(yǎng)基有所提高。已發(fā)現(xiàn)同滲重量摩爾濃度高到350mM/kg或甚至更高是很有益的。發(fā)育優(yōu)選在22℃-25℃完全黑暗下進(jìn)行直到產(chǎn)生子葉胚胎。發(fā)育的時(shí)間一般是幾周，例如7到10周。
成熟在發(fā)育培養(yǎng)基上7到10周后，子葉胚胎被單一處理(singulated)并轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)基BM4上。胚胎被保持在暗處3℃到6℃的溫度范圍內(nèi)1到3周。
成層子葉胚胎被單一處理并被轉(zhuǎn)移到成層培養(yǎng)基BM5上。該培養(yǎng)基與發(fā)育培養(yǎng)基相似，只是缺少脫落酸，PEG-8000和結(jié)冷膠。胚胎在成層培養(yǎng)基上在暗處大約1℃到大約10℃下被培養(yǎng)3到6周。
干燥將仍保留在濾紙支持物上的成熟胚胎從襯墊上挖出并放在對(duì)水的封閉容器中，在相對(duì)濕度97％的條件下大約3周時(shí)間。
發(fā)芽干燥的成熟胚胎仍留在濾紙支持物上，通過將其放在用液體發(fā)芽培養(yǎng)基浸透的襯墊上24小時(shí)而再使之濕潤。隨后胚胎被逐個(gè)地放在BM6固體培養(yǎng)基上以使之發(fā)芽。這是一個(gè)缺乏生長激素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，已用降低蔗糖，肌醇和有機(jī)氮來調(diào)節(jié)。胚胎在BM6培養(yǎng)基上在23℃-25℃，和光照周期為16小時(shí)光照-8小時(shí)暗處理這樣一個(gè)環(huán)境條件下被培育大約10周，直到長出的苗有充分發(fā)育的胚根、胚軸、綠色的子葉結(jié)構(gòu)和上胚軸。
因?yàn)榻档土颂妓衔锏臐舛龋l(fā)芽培養(yǎng)基的滲透潛力被進(jìn)一步降低，低于發(fā)育培養(yǎng)基。通常低于大約150mM/kg(例如大約100mM/kg)。
當(dāng)本發(fā)明的優(yōu)先具體實(shí)施方式
已被說明和描述時(shí)，可以理解其中可有的各種改變并不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備成熟針葉樹體細(xì)胞胚的方法，包括如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)前子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成子葉針葉樹體細(xì)胞胚；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)中形成的子葉針葉樹體細(xì)胞胚以制備成熟的針葉樹體細(xì)胞胚。
2.權(quán)利要求1的方法，其中成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步含有蔗糖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中蔗糖是成熟培養(yǎng)基中唯一的可代謝糖源。
4.權(quán)利要求2的方法，其中成熟培養(yǎng)基中的蔗糖濃度在大約1％和大約3％之間。
5.權(quán)利要求1的方法，其中成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步含有脫落酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中成熟培養(yǎng)基中脫落酸的濃度是在大約20mg/L和大約50mg/L之間。
7.權(quán)利要求1的方法，其中將子葉胚胎在成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)大約1周和大約5周時(shí)間之間。
8.一種制備成熟松木體細(xì)胞胚的方法，包括如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)前子葉針葉樹體細(xì)胞胚，以形成子葉針葉樹體細(xì)胞胚；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠，大約2％蔗糖和大約10mg/L脫落酸的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)中形成的子葉針葉樹體細(xì)胞胚。
全文摘要
一方面，本發(fā)明提供制備成熟針葉樹體細(xì)胞胚的方法。本發(fā)明的方法包含如下步驟(a)在含有低于0.5％結(jié)冷膠的發(fā)育培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)前子葉針葉樹體細(xì)胞胚以形成子葉針葉樹體細(xì)胞胚；和(b)在含有大約0.5％到大約1.5％結(jié)冷膠的成熟培養(yǎng)基中或之上培養(yǎng)步驟(a)中形成的子葉針葉樹體細(xì)胞胚。在一些具體實(shí)施方式
中，成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步含有蔗糖和/或脫落酸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1572869SQ20041006161
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月23日
發(fā)明者普拉莫德·古普塔, 黛安娜·霍爾姆斯特倫, 博尼·拉松 申請(qǐng)人:韋爾豪澤公司