粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法。所述方法包括：在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理0～21天，然后再進(jìn)行萌發(fā)。本發(fā)明提供了一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括了基于體細(xì)胞胚顏色變化的干化標(biāo)記策略，能夠極顯著地提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率；同時(shí)，體細(xì)胞胚萌發(fā)的質(zhì)量也得到明顯提高；而且不會(huì)受到基因型和細(xì)胞系的影響，具有普遍的適用性；為實(shí)現(xiàn)粗枝云杉體細(xì)胞胚的工廠化育苗奠定了理論基礎(chǔ)，并提供了切實(shí)可行的技術(shù)方案。
【專利說(shuō)明】粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及林業(yè)中細(xì)胞工程種苗繁殖領(lǐng)域，具體地，涉及一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)，是指在離體條件下，已分化的體細(xì)胞在特定的環(huán)境條件下，發(fā)育成與合子胚類似的胚狀體的過(guò)程。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是利用細(xì)胞工程手段實(shí)現(xiàn)植株再生的重要途徑之一，作為一種利用人工手段能夠最大限度地實(shí)現(xiàn)植物擴(kuò)繁的措施，尤其對(duì)于難以扦插繁殖且繁殖周期較長(zhǎng)的針葉樹樹種來(lái)說(shuō)具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)， 由于體細(xì)胞胚和合子胚具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育過(guò)程，體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程又具有相對(duì)的遺傳穩(wěn)定性；開展植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究，已經(jīng)為揭示植物胚胎的發(fā)生機(jī)理研究和開展遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了一種模式研究系統(tǒng)。[0003]一個(gè)完整的植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)包括胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的增殖、體細(xì)胞胚的分化和成熟體細(xì)胞胚的萌發(fā)等四個(gè)階段；其中，成熟體細(xì)胞胚的萌發(fā)階段作為整個(gè)技術(shù)體系的最后一步，體細(xì)胞胚萌發(fā)率的高低及萌發(fā)質(zhì)量，直接決定著最終體胚苗的收獲量和整個(gè)體胚技術(shù)體系構(gòu)建的成敗。目前，在針葉樹樹種體細(xì)胞胚萌發(fā)階段， 為提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和萌發(fā)質(zhì)量，國(guó)外常用的方法是將體細(xì)胞胚萌發(fā)之前進(jìn)行干化 (Desiccation)預(yù)處理。通常，失水現(xiàn)象是體細(xì)胞胚由成熟階段向萌發(fā)階段轉(zhuǎn)變的最直接響應(yīng)，可以促使體細(xì)胞胚由形態(tài)成熟向萌發(fā)所需的生理成熟轉(zhuǎn)變；因此，對(duì)體細(xì)胞胚而言，給予適當(dāng)?shù)母苫幚?，不僅能夠抑制分化培養(yǎng)基中體細(xì)胞胚的提早萌發(fā)，還能夠提高體細(xì)胞胚在萌發(fā)階段中的萌發(fā)數(shù)量和質(zhì)量。[0004]一般根據(jù)體細(xì)胞胚失水速率的變化，可以將體細(xì)胞胚的干化處理方法分為完全干化(Full Desiccation)和部分干化(Partial Desiccation)兩種；前者主要由滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)，而后者主要通過(guò)水蒸氣變化調(diào)節(jié)。盡管干化處理能夠提高萌發(fā)頻率，然而影響干化處理效果的因素有很多:干化方法的差異、干化處理持續(xù)的時(shí)間、樹種的不同、甚至相同樹種不同基因型之間對(duì)相同干化處理方法的響應(yīng)都存在很大差異。如果不考慮影響干化處理效果的因素，采用單一的干化處理?xiàng)l件，肯定不能夠滿足所有基因型或者細(xì)胞系體細(xì)胞胚的萌發(fā)需要。因此，國(guó)外有學(xué)者甚至提出，每一個(gè)細(xì)胞系都可能對(duì)應(yīng)一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的干化處理方案，若想建立合適的干化處理方案，需要對(duì)每個(gè)細(xì)胞系的體細(xì)胞胚干化條件逐一探索。這種逐一探索的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在實(shí)際生產(chǎn)中可行性較差。[0005]粗枝云杉(Picea asperata Mast)為松科,云杉屬樹種，國(guó)內(nèi)俗稱云杉,為我國(guó)特有種，也是我國(guó)分布最廣的云杉屬樹種。常綠喬木，高達(dá)45m，胸徑達(dá)lm。主要分布于川西高原、甘肅東南部和陜西西南部的亞高山地區(qū)，平均海拔分布在2400~3600m的高山丘陵地帶。木材黃白色，較輕軟，紋理直，結(jié)構(gòu)細(xì)，有彈性。是重要的造紙、建筑、家具及木纖維工業(yè)的原材料。材質(zhì)優(yōu)良，生長(zhǎng)快，適應(yīng)性強(qiáng)，是分布區(qū)的主要造林樹種。目前，人工造林用苗 主要通過(guò)實(shí)生繁殖，但粗枝云杉結(jié)實(shí)晚，種子成熟率低，且伴有嚴(yán)重的“大小年”現(xiàn)象，致使粗枝云杉優(yōu)良種苗供不應(yīng)求。[0006]在過(guò)去幾年，本申請(qǐng)的發(fā)明人嘗試首次構(gòu)建粗枝云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系。 在此過(guò)程中，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的增殖、體細(xì)胞胚的分化等階段的技術(shù)體系已經(jīng)非常成熟，并符合生產(chǎn)需要。然而，在體細(xì)胞胚的萌發(fā)過(guò)程中，盡管經(jīng)過(guò)大量的探索工作，對(duì)影響體細(xì)胞胚萌發(fā)的因素做了盡可能多的嘗試，篩選出的萌發(fā)條件雖能顯著地提高粗枝云杉體細(xì)胞胚的萌發(fā)率，但是萌發(fā)率還是不夠高(平均為20%左右)，仍然不能盡可能高地滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。[0007]因此，若能在粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)之前，確定其合適的干化處理方法，可以極顯著地提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和明顯提高體細(xì)胞胚萌發(fā)的質(zhì)量；并且該處理方法如果不會(huì)受到基因型和細(xì)胞系的影響，具有普遍的適用性，將為實(shí)現(xiàn)粗枝云杉體細(xì)胞胚的工廠化育苗， 提供了巨大的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法。[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理O~21天，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0010]本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選對(duì)體細(xì)胞胚采用“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理。[0011]本發(fā)明所述的方法，更優(yōu)選對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理。[0012]其中，所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0013]其中，所述的“空培養(yǎng)容器法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)， 在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0014]其中，所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)墊有一層以上濾紙的培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0015]其中，所述的“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器內(nèi)墊有濾紙的層數(shù)優(yōu)選I~4層，更優(yōu)選3層。[0016]本發(fā)明中，在培養(yǎng)容器內(nèi)放置的濾紙可以大小相同，也可以不同，但最好相同。[0017]本發(fā)明中，所用的培養(yǎng)容器可以為塑料培養(yǎng)皿或玻璃培養(yǎng)皿，優(yōu)選玻璃培養(yǎng)皿。[0018]本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選干化處理I~14天，更優(yōu)選7~14天，最優(yōu)選14天。[0019]其中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理的條件還包括:溫度為23~25°C ;光照強(qiáng)度為 15 ~18 μ mo I.m 2.s S 優(yōu)選 15 μ mo I ^m2-S10[0020]其中，采用液體懸浮`增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚。[0021]本發(fā)明所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，還包括:在對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0022]其中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化， 將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0023]進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0024]更進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0025]本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理O~21天，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0026]其中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化， 將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0027]進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0028]更進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0029]本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理O~21 天，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0030]其中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化， 將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0031]進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0032]更進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0033]其中，所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0034]其中，所述的“空培養(yǎng)容器法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)， 在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0035]其中，所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)墊有一層以上濾紙的培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0036]本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，再進(jìn)行干化標(biāo)記，然后進(jìn)行萌發(fā)。`[0037]其中，所述干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)體細(xì)胞胚顏色的變化情況，將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0038]其中，標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚，其所需的干化時(shí)間為O~21天,優(yōu)選I~14天,更優(yōu)選7~14天,最優(yōu)選14天。[0039]進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0040]更進(jìn)一步地，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0041]本發(fā)明所述方法中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)，所用的培養(yǎng)基為:1/4LM培養(yǎng)基，加入鹿糖20g.L_\凝膠6g.L—1和活性炭2g.L_\再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白 Ig.L'[0042]截至目前為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于針葉樹樹種體細(xì)胞胚的干化處理尚未見報(bào)道。本申請(qǐng)的發(fā)明人首次對(duì)國(guó)內(nèi)針葉樹樹種粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理，研究表明干化處理能夠普遍促進(jìn)粗枝云杉體細(xì)胞胚的萌發(fā)。基于干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化，將“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚作為最適合萌發(fā)的干化標(biāo)記，這種標(biāo)記極大地提高了體細(xì)胞的干化處理效率，避免了干化處理的盲目性。同時(shí)，這種標(biāo)記不依賴于基因型和細(xì)胞系， 避免了相同干化方法處理下不同來(lái)源的體細(xì)胞胚萌發(fā)率提高不一致的問(wèn)題。這種標(biāo)記研究思路，不僅在國(guó)內(nèi)屬于首創(chuàng)，國(guó)外很多學(xué)者進(jìn)行嘗試也未見成功報(bào)道。[0043]本發(fā)明提供的方法，是專門針對(duì)粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)率低和萌發(fā)質(zhì)量不高的問(wèn)題，體細(xì)胞胚的萌發(fā)狀況無(wú)法滿足利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)實(shí)現(xiàn)植株的規(guī)?；a(chǎn)的需要。和現(xiàn)有國(guó)際上同屬或同類樹種研究的報(bào)道相比，本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚的干化方式，操作更為簡(jiǎn)單，成本更加低廉；同時(shí)干化標(biāo)記的方法更加高效和新穎，目前尚未見干化標(biāo)記的應(yīng)用報(bào)道，研究處于領(lǐng)先水平。目前，針葉樹樹種的體細(xì)胞胚萌發(fā)率一直很低， 萌發(fā)質(zhì)量也不高，極大制約了體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。干化處理后基于體細(xì)胞胚顏色變化而進(jìn)行的體細(xì)胞胚的干化標(biāo)記，這種研究思路極大地提高了粗枝云杉體細(xì)胞胚的萌發(fā)率和萌發(fā)質(zhì)量，滿足了實(shí)際生產(chǎn)的需要。[0044]總之，本發(fā)明提供了一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括了基于體細(xì)胞胚顏色變化的干化標(biāo)記策略；本發(fā)明的方法能夠極顯著地提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率 (達(dá)到30%以上，最高可達(dá)80%以上);同時(shí)，體細(xì)胞胚萌發(fā)的質(zhì)量也得到明顯提高；而且不會(huì)受到基因型和細(xì)胞系的影響，具有普遍的適用性；為實(shí)現(xiàn)粗枝云杉體細(xì)胞胚的工廠化育苗奠定了理論基礎(chǔ)，并提供了切實(shí)可行的技術(shù)方案?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】[0045]圖1為液體懸浮增殖所分化產(chǎn)生的大量且同步化程度較高的體細(xì)胞胚。[0046]圖2為半固體增殖所分化產(chǎn)生的大量且同步化程度較高的體細(xì)胞胚。[0047]圖3為實(shí)施例2中，用“濾紙法”干化處理中的體細(xì)胞胚。[0048]圖4為實(shí)施例5中，干化處理14天后，“無(wú)變化型”的體細(xì)胞胚。[0049]圖5為實(shí)施例5中，干化處理14天后，“胚根淡紅色型”的體細(xì)胞胚；其中a為淡黃色的子葉和胚軸部分，b為淡紅色的胚根部分。[0050]圖6為實(shí)施例5中，干化處理14天后，“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚；其中a為綠色的子葉和胚軸部分，b為紅色的胚根部分。[0051]圖7為實(shí)施例6中，`“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚萌發(fā)3周后產(chǎn)生的高同步化和生長(zhǎng)健壯的幼苗?！揪唧w實(shí)施方式】[0052]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。[0053]本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，研究過(guò)程包括:[0054](I)高同步化粗枝云杉體細(xì)胞胚的獲得；[0055](2)篩選出適合粗枝云杉體細(xì)胞胚的干化方式；[0056](3)篩選合適的干化時(shí)間；[0057](4)干化處理方式的普遍適用性論證；[0058]( 5)干化標(biāo)記的對(duì)比篩選；[0059](6)干化方式的進(jìn)一步優(yōu)化篩選。[0060]上述高同步化粗枝云杉體細(xì)胞胚的獲得中:胚性愈傷組織采用液體懸浮增殖或半固體增殖的方式進(jìn)行，將這兩種方式增殖的胚性愈傷組織分別進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)， 由于分化培養(yǎng)基前期經(jīng)過(guò)優(yōu)化(即粗枝云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系中的條件篩選)，因此均可以獲得量大且高同步化的體細(xì)胞胚，為后續(xù)體細(xì)胞胚的干化處理提供均一化的材料奠定了基礎(chǔ)。[0061]上述適合粗枝云杉體細(xì)胞胚干化方式的篩選中:采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”和“濾紙法”三種干化方式進(jìn)行對(duì)比，優(yōu)選“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”，進(jìn)一步地優(yōu)選 “濾紙法”。采用“濾紙法”的干化方式，不僅能夠使體細(xì)胞胚處于相對(duì)干燥的環(huán)境，促進(jìn)體細(xì)胞胚經(jīng)歷一個(gè)充分的干化過(guò)程；同時(shí)，采用“濾紙法”的干化方式，體細(xì)胞胚能夠發(fā)生顏色變化，為基于顏色變化情況而進(jìn)行的干化標(biāo)記提供了可能。[0062]上述合適的干化時(shí)間的篩選中:干化時(shí)間為O~21天，優(yōu)選I~14天，更優(yōu)選7~ 14天，最優(yōu)選14天。干化14天后，能夠最大限度地提高體細(xì)胞胚的萌發(fā)率。[0063]上述干化處理方式的普遍適用性論中:采用液體懸浮增殖和半固體增殖兩種方式增殖的細(xì)胞系所分化得到的體細(xì)胞胚為材料，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行干化處理，然后進(jìn)行萌發(fā)，均得到了較高的萌發(fā)率，說(shuō)明本發(fā)明的干化處理對(duì)粗枝云杉不同細(xì)胞系的體細(xì)胞胚的萌發(fā)促進(jìn)作用具有普遍的適用性。 [0064]上述干化標(biāo)記的對(duì)比篩選中:根據(jù)對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，體細(xì)胞胚顏色的變化情況，將體細(xì)胞胚分成三種類型(即進(jìn)行干化標(biāo)記):“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。將干化處理并標(biāo)記后的這三種類型的體細(xì)胞胚分別進(jìn)行萌發(fā)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的萌發(fā)率較高，“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的萌發(fā)率最高。這種對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行的干化標(biāo)記研究， 屬于首次報(bào)道。[0065]上述干化方式的進(jìn)一步優(yōu)化篩選中:在采用“濾紙法”的干化方式中，在放置粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器內(nèi)墊有I層以上的干燥無(wú)菌濾紙，優(yōu)選I~4層，更優(yōu)選3層。此種干化方式不僅使得干化處理效率進(jìn)一步提高，同時(shí)極大地降低了干化處理成本。[0066]也就是說(shuō)，本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理O~21天，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0067]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚。[0068]所述體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為:1/2LM培養(yǎng)基+脫落酸16mg.L^+PEG (聚乙二醇)400050g.L-1+蔗糖30g.L-1+活性炭Ig.L-1+凝膠4g.L-1，附加谷氨酰胺 500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L'使用此種培養(yǎng)基，并添加上述相關(guān)成分可以獲得大量且同步化程度較高的體細(xì)胞胚。也可以采用其他培養(yǎng)基，但本發(fā)明的效果較優(yōu)。[0069]在液體懸浮增殖的胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)中，胚性愈傷組織的細(xì)胞體積和分化培養(yǎng)基的體積比為1:3。[0070]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)體細(xì)胞胚采用“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理。[0071]作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理。[0072]本發(fā)明所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置無(wú)菌水，用兩層潤(rùn)濕濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0073]本發(fā)明所述的“空培養(yǎng)容器法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)， 然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置無(wú)菌水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0074]本發(fā)明所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)墊有一層以上無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器(放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器)放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。[0075]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，在所述“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器內(nèi)墊有濾紙的層數(shù)為I~4層，更優(yōu)選3層。[0076]本發(fā)明中，在培養(yǎng)容器內(nèi)放置的濾紙可以大小相同，也可以不同，但最好相同。所用的培養(yǎng)容器可以為塑料培養(yǎng)皿或玻璃培養(yǎng)皿，優(yōu)選玻璃培養(yǎng)皿。[0077]作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，干化處理I~14天，更優(yōu)選7~14天，最優(yōu)選14天。[0078]而對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理的條件還包括:培養(yǎng)室溫度(24±1) °C, Ιδμ,ο?.,2.s-1光照下進(jìn)行干化處理。所有操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所采用的培養(yǎng)皿、濾紙和提供無(wú)菌環(huán)境的去離子水，全部需要高壓滅菌后使用。[0079]本發(fā)明所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，還包括:在對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記，然后再進(jìn)行萌發(fā)。[0080]所述對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化情況，將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
[0081]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0082]作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0083]本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，再進(jìn)行干化標(biāo)記，然后進(jìn)行萌發(fā)；對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化，將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。[0084]作為優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0085]作為進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。[0086]并且，在本發(fā)明提供的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法中，標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚，其所需的干化時(shí)間為O~21天，優(yōu)選I~14天，更優(yōu)選7~14天,最優(yōu)選14天。[0087]本發(fā)明所述方法中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)，所用的培養(yǎng)基為:1/4LM培養(yǎng)基+蔗糖 20g.I71+凝膠6g.I71+活性炭2g.I71,附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L' 也可以采用其他培養(yǎng)基，但本發(fā)明的效果較優(yōu)。[0088]本發(fā)明所述方法中，分化或萌發(fā)所用培養(yǎng)基中:由于使用的脫落酸和谷氨酰胺不耐高溫，可以采用過(guò)濾的方式滅菌，其他所有成分均采用高溫高壓方式滅菌。[0089]本發(fā)明所述方法中，體細(xì)胞胚的分化階段和萌發(fā)階段的培養(yǎng)基:加凝膠前將pH調(diào)至5.8，隨后在1211:、壓力IOlkp高溫、高壓條件下滅菌20分鐘后使用。也可以采用其他方式，但本發(fā)明的效果較優(yōu)。[0090]本發(fā)明所述方法中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)的條件包括:培養(yǎng)溫度為(24±1) V;第一周(以7天為周期)黑暗培養(yǎng)；第二周(以7天為周期),在20μηιο1.m_2.s—1光照下,每天的光周期為16小時(shí)光照培養(yǎng)和8小時(shí)黑暗培養(yǎng)；隨后在50 μ mo I.m_2.s—1光照下,每天的光周期為16小時(shí)光照培養(yǎng)和8小時(shí)黑暗培養(yǎng)。也可以采用其他方式，但本發(fā)明的效果較優(yōu)。[0091]本發(fā)明所述方法中，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)，在萌發(fā)過(guò)程中，將體細(xì)胞胚水平放置于半固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)皿傾斜45°角放置，有利于子葉伸展、胚軸和胚根伸長(zhǎng)；同時(shí)，生長(zhǎng)的胚根附著在培養(yǎng)基表面，避免了移栽時(shí)幼嫩苗根受損，有利于移栽成活。[0092]本發(fā)明所用凝膠,為植物凝膠gellan gum,采用Sigma品牌；它是一種冷凝膠,跟瓊脂的作用相同，但效果要好很多，具體表現(xiàn)為培養(yǎng)基的凝結(jié)速度和透明程度均明顯提高。 本發(fā)明所使用的活性炭activated carbon,同樣采用Sigma品牌,和一般市場(chǎng)上所售的活性炭相比，其活性吸附能力更強(qiáng)，能夠有效地清除培養(yǎng)基中的酚類等有毒物質(zhì)。本發(fā)明所使用的水為去離子水，純度為18.2兆歐。[0093]本發(fā)明所用其他原料和試劑均為從市場(chǎng)上購(gòu)得的常規(guī)試劑，未提及的操作方式和檢測(cè)方式也均為本領(lǐng)域常規(guī)的操作方式。[0094]LM培養(yǎng)基的成分為:[0095]大量元素:1.65g.IZ1NH4NO3, 1.9g.IZ1KNO3, 1.85g.IZ1MgSO4.7H20， 0.34g.L^1KH2PO4j0.022g.L-1CaCl2.2H20 ；[0096]微量元素:0.0304g.L^1H3BO3j0.043g.L-1ZnSO4.7H20，0.021g.L-1MnSO4.H2O, 0.00 126g.L^1Na2MoO4.2H20, 0.00415g.L-1KI, 0.0005g.L-1CuSO4.5H20, 0.000125g.T1CoCl2GH2O ；[0097]鐵鹽:0.0278g.L-1FeSO4.7H20，0.0373g.L-1EDTA.2H20 (乙二胺四乙酸)；[0098]肌醇:0.1g.L-1Myo-1`nositol ；[0099]有機(jī)鹽:0.0OOlg.L-1Thiamine-HCl (Vitamin B1), 0.0005g.T1Niacin acid(Vitamin B3), 0.0OOlg.L-1Pyroxidone-HCl (Vitamin B6)。
[0100]本發(fā)明出現(xiàn)的1/2LM培養(yǎng)基，就是對(duì)上述LM培養(yǎng)基的成分，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變。本發(fā)明出現(xiàn)的1/4LM培養(yǎng)基，就是對(duì)上述LM培養(yǎng)基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減到1/4，其他不變。本發(fā)明出現(xiàn)的半固體培養(yǎng)基，就是在上述1/2LM培養(yǎng)基中添加凝膠。本發(fā)明出現(xiàn)的1/2LM液體培養(yǎng)基，就是對(duì)上述LM基本培養(yǎng)基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變，同時(shí)培養(yǎng)基中不添加凝膠。
[0101]培養(yǎng)基中的各營(yíng)養(yǎng)成分實(shí)際使用時(shí)先配制母液，然后稀釋使用。將大量元素和鐵鹽的母液配制成100倍，微量元素配制成1000倍，肌醇和有機(jī)鹽配制成500倍。其中，為了避免大量元素中的CaCl2.2H20和其他成分結(jié)合而形成沉淀，將其單獨(dú)配制。
[0102]本發(fā)明的內(nèi)容是在2011~2013年間對(duì)粗枝云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系構(gòu)建的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。在粗枝云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系構(gòu)建過(guò)程中，通過(guò)大量對(duì)比試驗(yàn)，已經(jīng)獲得了體細(xì)胞胚最適合的分化培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基。所采用的實(shí)驗(yàn)材料，在實(shí)驗(yàn)室保存有一年時(shí)間，不同細(xì)胞系能夠代表粗枝云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系過(guò)程的普遍性，也能代表干化處理方式的普遍適用性。
[0103]本發(fā)明的萌發(fā)率均指所統(tǒng)計(jì)的平均萌發(fā)率。
[0104]實(shí)施例1
[0105]高同步化粗枝云 杉體細(xì)胞胚的獲得:根據(jù)胚性愈傷組織增殖的方式分為兩種分化方式獲得:一種是對(duì)建立起液體懸浮增殖(用的是1/2LM液體培養(yǎng)基)體系的細(xì)胞系1921和1931而言，將懸浮增殖的胚性愈傷組織按照靜置時(shí)細(xì)胞體積和無(wú)激素添加的液體增殖培養(yǎng)基(B卩1/2LM液體培養(yǎng)基)兩者的體積比為1:3的比例混合，取搖勻的添加胚性愈傷組織的培養(yǎng)基5mL放置在一張濾紙(Whatman?2 )上,用布氏漏斗抽濾掉液體培養(yǎng)基后，將附有胚性愈傷組織的濾紙轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；另一種是對(duì)于半固體增殖的細(xì)胞系1113、1911、1921、2322、2614和2711而言，將轉(zhuǎn)接增殖2周后的胚性愈傷組織直接平鋪到濾紙(Whatman?2)上，隨后在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。兩種方式米用相同的分化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件:1/2LM 培養(yǎng)基 + 脫落酸 16mg.r1+PEG400050g.L-1+ 蔗糖 30g.L-1+ 活性炭 Ig.L-1+ 凝膠4g.L-1，附加谷氨酰胺500mg.L-1和水解酪蛋白Ig.L-1 ;加凝膠前將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8，隨后在121°C、壓力IOlkp高溫、高壓條件下滅菌20分鐘后使用；(24±1)°C黑暗培養(yǎng)，7周(以7天為周期)后分化產(chǎn)生的成熟體細(xì)胞胚作為實(shí)驗(yàn)材料。
[0106]需要說(shuō)明的是:本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系1921同時(shí)采用兩種增殖方式進(jìn)行研究，能夠使得結(jié)果更加可靠。
[0107]這兩種增殖方式是目前胚性愈傷組織增殖過(guò)程中最常用的方式。采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織，分別進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化，并對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理，更能說(shuō)明干化處理作用的廣泛適用性。同時(shí)，由于分化培養(yǎng)基中有相同的最適合體細(xì)胞胚分化的培養(yǎng)基成分，因此黑暗分化7周后，兩種增殖方式下保持的胚性愈傷組織均能夠獲得數(shù)量較大和同步化程度非常高的體細(xì)胞胚(如圖1和圖2所示，其中圖1為液體懸浮增殖所分化產(chǎn)生的大量且同步化程度較高的體細(xì)胞胚，圖2為半固體增殖所分化產(chǎn)生的大量且同步化程度較高的體細(xì)胞胚)；保證了干化處理過(guò)程中體細(xì)胞胚的均一性，使得干化處理結(jié)果更加可靠。[0108]實(shí)施例2
[0109]粗枝云杉體細(xì)胞胚干化方式的篩選:以實(shí)施例1中1921液體懸浮增殖系分化的體細(xì)胞胚為材料，采用目前國(guó)外常用的“濾紙橋法”，“空培養(yǎng)容器法”和本實(shí)驗(yàn)室建立的“濾紙法”進(jìn)行三種干化方法的比較。具體地:“濾紙橋法”即將體細(xì)胞胚放置在塑料培養(yǎng)皿(35X12mm)中，隨后將塑料培養(yǎng)皿放置在更大的玻璃培養(yǎng)皿(87X 15mm)內(nèi)，在玻璃皿中放置IOmL無(wú)菌水，用兩層濕潤(rùn)濾紙覆蓋在塑料皿上做成“濾紙橋”，最后將玻璃皿用封口膜封口?！翱张囵B(yǎng)容器法”操作同“濾紙橋法”，只是不做“濾紙橋”?！盀V紙法”(如圖3所示，其反映干化處理過(guò)程中的整體狀態(tài))即將發(fā)育完全的體細(xì)胞胚放置在墊有兩層無(wú)菌干燥濾紙(相同大小)的塑料培養(yǎng)皿(35 X 12mm)中，隨后將塑料皿放置在更大的無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿(87X15mm)內(nèi)，玻璃皿中放置IOmL無(wú)菌水，這樣使得體細(xì)胞胚處于一個(gè)相對(duì)干燥的環(huán)境中，玻璃皿用封口膜封口。隨后，將這三種方法干化處理的體細(xì)胞胚放置在15 μ mol.π2 *s_1的弱光、并于(24±1) °C的溫度下干化培養(yǎng)2周(以7天為周期)。
[0110]觀察塑料培養(yǎng)皿內(nèi)體細(xì)胞胚的形態(tài)及顏色變化，干化結(jié)果如下表所示:
[0111]
【權(quán)利要求】
1.一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:在獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚后，對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理O~21 天，然后再進(jìn)行萌發(fā)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，對(duì)體細(xì)胞胚采用“空培養(yǎng)容器法”或“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理；優(yōu)選對(duì)體細(xì)胞胚采用“濾紙法”的方式進(jìn)行干化處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于， 所述的“濾紙橋法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，用濾紙覆蓋在放置有粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器上做成“濾紙橋”，最后將更大的培養(yǎng)容器封口 ；所述的“空培養(yǎng)容器法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口 ；所述的“濾紙法”為:將粗枝云杉體細(xì)胞胚放置在一個(gè)墊有一層以上濾紙的培養(yǎng)容器內(nèi)，然后將該培養(yǎng)容器放置在另一個(gè)更大的培養(yǎng)容器內(nèi)，在更大的培養(yǎng)容器內(nèi)放置水，最后將更大的培養(yǎng)容器封口。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，所述的“濾紙法”中，放置粗枝云杉體細(xì)胞胚的培養(yǎng)容器內(nèi)墊有濾紙的層數(shù)為I~4層，優(yōu)選 3層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，干化處理I~14天，優(yōu)選7~14天，更優(yōu)選14天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理的條件還包括:溫度為23~25 °C ;光照強(qiáng)度為15~ 18 μ mo I.π-2.s-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法， 其特征在于，采用液體懸浮增殖或半固體增殖的胚性愈傷組織分別進(jìn)行體細(xì)胞胚的分化培養(yǎng)，獲得粗枝云杉的體細(xì)胞胚。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7任意一項(xiàng)所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，該方法還包括:在對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記，然后再進(jìn)行萌發(fā)；對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)干化處理后體細(xì)胞胚顏色的變化，將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
9.一種粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，包括:對(duì)粗枝云杉的體細(xì)胞胚進(jìn)行干化處理后，再進(jìn)行干化標(biāo)記，然后進(jìn)行萌發(fā)；所述干化標(biāo)記的方式為:根據(jù)體細(xì)胞胚顏色的變化情況，將其標(biāo)記成三種類型:“無(wú)變化型”，“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法，其特征在于，標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚，其干化時(shí)間為O~21天，優(yōu)選1~14 天，更優(yōu)選7~14天，最優(yōu)選14天。
11.根據(jù)權(quán)利要求8~10任意一項(xiàng)所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法， 其特征在于，對(duì)標(biāo)記為“淡紅色胚根型”和“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)；優(yōu)選對(duì)標(biāo)記為“綠色子葉和胚軸及紅色胚根型”的體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~11任意一項(xiàng)所述的粗枝云杉體細(xì)胞胚萌發(fā)前的干化處理方法， 其特征在于，對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行萌發(fā)，所用的培養(yǎng)基為:1/4LM培養(yǎng)基，加入蔗糖 凝膠 6g.L—1和活性炭2g.L_S再附加谷氨酰胺500mg.L—1和水解酪蛋白Ig.L'
【文檔編號(hào)】C12N5/04GK103497928SQ201310462072
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】王軍輝, 張建偉, 張守攻 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所