專利名稱：北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法。
背景技術(shù)：
北五味子(Schisandra Chinensis Baill)屬于五味子科(Schisandraceae)多年生野生木質(zhì)藤本，其果實既是重要的傳統(tǒng)中藥、也可用于釀酒和制作果汁飲料。近年來在北五味子果實、種子和莖中發(fā)現(xiàn)藥物成分聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素，所以北五味子日益受到重視，發(fā)展前景十分廣闊。由于生態(tài)環(huán)境破壞和長期掠奪式采摘，野生資源破壞嚴(yán)重，北五味子市場供不應(yīng)求。我國北五味子無性系品種“紅珍珠”具有優(yōu)良的性狀，但因其采用實生繁殖，沒有成熟的無性繁殖體系，難以得到推廣。目前采用的無性繁殖法存在諸多缺陷，如扦插繁殖法插條必須帶2年生的枝才能生根，枝條數(shù)量少，培育周期長；地莖繁殖法根系太弱，離開母體后成活率低，不能應(yīng)用于生產(chǎn)；誘導(dǎo)腋芽發(fā)芽法增殖倍數(shù)低，只有3.2倍，芽生長速度慢，所以也不適合應(yīng)用于生產(chǎn)；合子胚誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生法方法繁瑣，而且以合子胚為體細(xì)胞胚誘導(dǎo)材料，再生植株的遺傳性狀不能保持與母本一致。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決目前北五味子無性繁殖法培育周期長、成活率低、增殖倍數(shù)低、芽生長速度慢、再生植株的遺傳性狀不能保持與母本一致的問題，而提供的一種北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法。北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～35天，之后再轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法還可按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5個月，之后選取生長旺盛的胚性愈傷組織切成25～35mg的小團轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。
北五味子體細(xì)胞胚的繼代培養(yǎng)周期為4周。本發(fā)明可誘導(dǎo)出具有幼根、幼芽的雙極性結(jié)構(gòu)，比需要兩種不同激素分別誘導(dǎo)不定芽、不定根的器官發(fā)生方式更利于實現(xiàn)苗木的自動化生產(chǎn)。本發(fā)明體細(xì)胞胚發(fā)生取材范圍廣，對母本破壞小，繁殖速度快，增殖倍數(shù)高，30mg胚性愈傷組織2個月內(nèi)可得到1800～2200個體細(xì)胞胚，芽生長速度快、培養(yǎng)15天生長2.0～3.0cm，成活率高達80％以上。本發(fā)明可固定雜種優(yōu)勢，大量生產(chǎn)與母本具有相同優(yōu)良性狀的再生植株，多年使用而無需三系配套等復(fù)雜的育種過程。而且本發(fā)明也可作為研究植物胚胎發(fā)生過程中不同生物事件的模式系統(tǒng)。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～35天，之后再轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。
北五味子體細(xì)胞胚的繼代培養(yǎng)周期為4周。本實施方式可通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)體細(xì)胞胚，擴大了培養(yǎng)規(guī)模，降低了成本，實現(xiàn)了優(yōu)良北五味子的工廠化生產(chǎn)和新品種的快速推廣。
具體實施例方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)選用“紅珍珠”品系的北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理。其它步驟與實施方式一相同。
本實施方式建立了北五味子無性系優(yōu)良品種“紅珍珠”的無性繁殖體系。
具體實施例方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)中的營養(yǎng)器官為無菌組織培養(yǎng)苗的根、莖、葉、芽或者為多年生植株的根、莖、葉、花、芽或頂端分生組織。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)中預(yù)處理是將營養(yǎng)器官用自來水沖洗一天后放入濃度為70％的酒精中浸泡30s，再用蒸餾水沖洗2次，放入濃度3％的次氯酸鈉溶液中消毒10min，之后用無菌蒸餾水沖洗4～6遍。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)中培養(yǎng)基先用1N的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值到5.75后再加入瓊脂。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)和(四)中的生長素為2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸或吲哚丁酸。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)和(四)中每升培養(yǎng)基加入2～8mg的2，4二氯苯氧乙酸。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)和(四)中每升培養(yǎng)基加入4mg的2，4二氯苯氧乙酸。其它步驟與實施方式一相同。
本實施方式通過測試選用每升培養(yǎng)基中加入4mg 2，4二氯苯氧乙酸的方案。2，4-D濃度對胚性愈傷組織誘導(dǎo)率影響的測試結(jié)果如表1所示。
表1

具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)至(五)中使用同一種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基、Gamborg B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基或Heller培養(yǎng)基中的一種。其它步驟與實施方式一相同。
本實施方式只使用一種培養(yǎng)基，這樣可以簡化操作步驟、可以節(jié)省勞動力和降低生產(chǎn)成本，有利于實現(xiàn)苗木的工廠化生產(chǎn)。
具體實施例方式
十本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(一)至(五)中使用MS培養(yǎng)基。其它步驟與實施方式一相同。
具體實施例方式
十一本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟(六)將生根并有3片以上葉片的再生植株用自來水洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭土的容器中，在溫室條件下覆膜培養(yǎng)2～4周、每天澆水1次，當(dāng)新葉片長出后去掉覆蓋的塑料薄膜。其它步驟與實施方式一相同。
本實施方式再生植株成活率高于80％。
具體實施例方式
十二本實施方式與具體實施方式
十一的不同點是步驟(六)中移栽到裝有草炭土容器中的再生植株在20℃條件下覆膜培養(yǎng)2～4周。其它步驟與實施方式十一相同。
本實施方式再生植株成活率可高達100％。
具體實施例方式
十三本實施方式北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5個月，之后選取生長旺盛的胚性愈傷組織切成25～35mg的小團轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。
本實施方式對胚性愈傷組織進行多次繼代培養(yǎng)，其結(jié)果如表2所示。胚性愈傷組織經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，生長旺盛，接種量增大，體細(xì)胞胚個數(shù)顯著增多。
表2

具體實施方式
十四本實施方式北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取“紅珍珠”北五味子4年生以上植株的一年生枝條上的飽滿冬芽進行預(yù)處理，然后接種到加入4mg/L 2，4二氯苯氧乙酸、30g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)8周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加4mg/L 2，4二氯苯氧乙酸的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5個月，之后選取生長旺盛的胚性愈傷組織切成28～32mg的小團轉(zhuǎn)移到添加了20g/L蔗糖和5.5g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/2的培養(yǎng)基上，在25℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)將生根并有3片以上葉片的再生植株用自來水洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭土的容器中，在溫室條件下覆膜培養(yǎng)3周，當(dāng)新葉片長出后去掉覆蓋的塑料薄膜，轉(zhuǎn)移到20℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，在土壤移栽培養(yǎng)過程中每天澆1次水，即得到北五味子苗木。
本實施方式中體細(xì)胞胚的發(fā)生率為1.7～3.5％，經(jīng)過步驟(三)培養(yǎng)20天，體細(xì)胞胚的鮮重增加10倍以上。
權(quán)利要求
1.北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25～35天，之后再轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)選用“紅珍珠”品系的北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)中的營養(yǎng)器官為無菌組織培養(yǎng)苗的根、莖、葉、芽或者為多年生植株的根、莖、葉、花、芽或頂端分生組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)和(四)中的生長素為2，4二氯苯氧乙酸、萘乙酸或吲哚丁酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)和(四)中每升培養(yǎng)基加入4mg的2，4二氯苯氧乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)至(五)中使用同一種培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、SH培養(yǎng)基、Gamborg B5培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基或Heller培養(yǎng)基中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(一)至(五)中使用MS培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(六)將生根并有3片以上葉片的再生植株用自來水洗去培養(yǎng)基，移栽到裝有草炭土的容器中，在溫室條件下覆膜培養(yǎng)2～4周、每天澆水1次，當(dāng)新葉片長出后去掉覆蓋的塑料薄膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于步驟(六)中移栽到裝有草炭土容器中的再生植株在20℃條件下覆膜培養(yǎng)2～4周。
10.北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，其特征在于北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法按以下步驟進行(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官進行預(yù)處理，然后接種到加入0.5～10mg/L生長素、10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂的培養(yǎng)基上；(二)在溫度為29±1℃，光周期是明16h/暗8h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)7～9周，得到體細(xì)胞胚；(三)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第一步成分相同的固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)2～3個月，得到愈傷組織；(四)將繼代培養(yǎng)的半透明乳白色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入外加0.5～10mg/L生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5個月，之后選取生長旺盛的胚性愈傷組織切成25～35mg的小團轉(zhuǎn)移到添加了10～60g/L蔗糖和5.0～8.0g/L瓊脂、無機鹽濃度為1/4～1/2的培養(yǎng)基上，在25±1℃、光周期是明16h/暗8h的條件下培養(yǎng)4～5周，得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)將發(fā)芽的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到與第四步成分相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5周，得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。
全文摘要
北五味子體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法，它涉及一種細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生方法。它解決了目前北五味子無性繁殖法培育周期長、成活率低、再生植株的遺傳性狀不能保持與母本一致的問題。其方法是(一)切取優(yōu)良北五味子個體營養(yǎng)器官預(yù)處理；(二)培養(yǎng)營養(yǎng)器官；(三)體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)；(四)培養(yǎng)胚性愈傷組織得到發(fā)芽的體細(xì)胞胚；(五)培養(yǎng)得到完整的再生植株；(六)再生植株土壤移栽培養(yǎng)，即得到北五味子苗木。本發(fā)明體細(xì)胞胚發(fā)生取材范圍廣，繁殖速度快，增殖倍數(shù)高，成活率高達80％以上，而且本發(fā)明可大量生產(chǎn)與母本具有相同優(yōu)良性狀的再生植株。
文檔編號C12N5/04GK1817106SQ20061000978
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者李成浩, 楊傳平, 劉桂豐, 牛遇達, 趙波, 韓君 申請人:東北林業(yè)大學(xué)