專利名稱：固定化乳糖酶生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物制劑的生產(chǎn)方法，具體地說是一種微生物細(xì)胞破壁及固定化乳糖酶的生產(chǎn)方法。
(二)技術(shù)背景人體小腸中可分解乳糖的酶有乳糖酶(lactase)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，乳糖酶位于小腸粘膜刷狀緣，而β-半乳糖苷酶位于溶酶體內(nèi)，不能分解腸腔中的乳糖。乳糖酶缺乏是指小腸刷狀緣絨毛膜細(xì)胞的膜結(jié)合酶即乳糖酶活性低下。乳糖酶缺乏有三種類型(1)先天性乳糖酶缺乏是指自出生時(shí)機(jī)體乳糖酶活性即低下或缺乏，是機(jī)體常染色體上隱性基因所致，這一類型很少見。(2)繼發(fā)性乳糖酶缺乏是指由于各種原因致使小腸上皮損傷而導(dǎo)致的暫時(shí)性乳糖酶活性低下，如感染性腹瀉、免疫球蛋白缺乏癥、乳糜瀉、局限性回腸炎、營養(yǎng)不良等疾病，可在機(jī)體疾病康復(fù)后恢復(fù)正常。(3)原發(fā)性乳糖酶缺乏(又稱成人型乳糖酶缺乏)是最常見的一種，不是由疾病的影響所致，主要是由于乳糖酶活性隨年齡逐漸降低而引起，發(fā)生時(shí)間因種族和地區(qū)不同而不同，在嬰兒斷乳后就開始發(fā)生，有的20歲左右時(shí)開始出現(xiàn)。我國人群多在7～8歲時(shí)發(fā)生。一般認(rèn)為乳糖酶缺乏是與世代形成的飲食習(xí)慣不同所造成的遺傳基因突變有關(guān)。乳糖酶缺乏發(fā)生率隨不同國家、不同種族人群的變化而變化。歐洲人群30％以上乳糖酶缺乏，亞洲人群乳糖酶缺乏占75％～100％，美國白人12％、黑人70％，非洲90％～100％；日本100％，中國3～13歲兒童乳糖酶缺乏發(fā)生率為87％。
牛乳中的乳糖進(jìn)入小腸后，由于乳糖酶的缺乏，乳糖不能被分解成葡萄糖和半乳糖被吸收，稱為乳糖消化不良和乳糖吸收不良。當(dāng)乳糖進(jìn)入結(jié)腸后，被細(xì)菌發(fā)酵生成短鏈有機(jī)酸如醋酸、丙酸、丁酸等和氣體如甲烷、H2、CO2等，乳糖發(fā)酵過程可引起腸鳴、腹痛、直腸氣體和滲透性腹瀉，存在這些癥狀時(shí)稱為乳糖不耐受癥，嚴(yán)重的乳糖消化不良或吸收不良多在攝入一定量乳糖后30分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。乳糖不耐受對嬰幼兒影響較大，半乳糖是大腦正常發(fā)育的重要物質(zhì)，由于缺乏乳糖酶不能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖被吸收，因此，兒童的生長遲緩，對大腦發(fā)育也有一定的影響，并會(huì)同時(shí)伴有嘔吐等現(xiàn)象，成人有時(shí)伴有惡心反應(yīng)。乳糖酶缺乏者中有20％左右的人存在乳糖不耐受癥狀，而且乳糖不耐癥狀個(gè)體差異很大。不耐受癥狀的多少和嚴(yán)重程度與小腸內(nèi)乳糖酶活性、攝入的乳糖量以及是否同時(shí)攝入其它類食品有關(guān)，因此生產(chǎn)低乳糖奶具有十分重要的意義。
但是，生產(chǎn)低乳糖奶所用的乳糖酶價(jià)格較貴，這就增加了液體奶和奶粉的生產(chǎn)成本，因此低乳糖奶的價(jià)格偏高，市場銷售受到一定的影響，如果采用固定化乳糖酶就可解決這個(gè)問題。因?yàn)楣潭ɑ樘敲覆粫?huì)隨奶液流失，可以回收反復(fù)使用，大大降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種可以連續(xù)進(jìn)行處理，固定化酶不會(huì)隨液體奶流失，可以回收重復(fù)使用，降低低乳糖奶的生產(chǎn)成本的固定化乳糖酶生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、脆壁克魯維酵母菌懸液的制備將培養(yǎng)成熟的脆壁克魯維酵母細(xì)胞經(jīng)10000r/min高速離心，獲得新鮮活性菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞用無菌水洗滌1-2次，然后用無菌水配制成細(xì)胞菌懸液，細(xì)胞濃度為5.0％-40.0％；2、酶預(yù)破壁處理取上述菌懸液500mL，加入蛋白酶和β-葡聚糖酶，蛋白酶用量1.0-150.0u/g濕菌體，β-葡聚糖酶用量1.0-100u/g濕菌體，pH 6.0-7.0，30℃-65℃保溫1-6小時(shí)；3、凍融破壁將經(jīng)酶處理后的細(xì)胞懸液取出，置于-20℃—-50℃溫度下快速冷凍，使其徹底凍結(jié)，再將冷凍的細(xì)胞置于40℃-75℃迅速融化，得到凍融細(xì)胞懸液；4、高壓勻漿機(jī)終極破壁將凍融的細(xì)胞懸液置于液體剪切破碎裝置高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行二次破壁，進(jìn)口處的溫度維持在20℃-45℃，出口處的溫度不要高于50℃，壓力維持在30MPa-120MPa，得到無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的活性乳糖酶溶液，稱為Ls溶液；5、制備固定化載體溶液稱取3.5g-20.0g聚乙烯醇(PVA)，0.5g-10.0g海藻酸鈉，加入100mL蒸餾水，攪拌10分鐘，靜止浸泡2-24小時(shí)，置于121℃溫度下滅菌20分鐘，冷卻至10℃-35℃，此溶液為Ps溶液；6、制備乳糖酶固定化載體溶液量取上述Ls溶液和Ps溶液，Ps∶Ls按1∶1-1∶4，在無菌條件下徹底攪拌均勻，此溶液稱為Ps-Ls溶液；7、制備固定液稱取硼酸1.0-4.0g，氯化鈣0.5-6.0g，加入100mL水，加熱攪拌使其溶化，然后，121℃溫度滅菌20分鐘，冷卻至10℃-35℃，此溶液為硼酸-氯化鈣混合液；8、固定化將Ps-Ls溶液置于制粒機(jī)中，緩緩地滴入硼酸-氯化鈣溶液中，ps-Ls溶液與硼酸-氯化鈣溶液的比例按1∶1-1∶8，經(jīng)2-8小時(shí)的硬化，撈出用無菌水洗滌兩次，即制得固體小球狀的固定化乳糖酶。
9、其他固定化方法用其他固定化方法可以將固定化乳糖酶做成球狀、絲狀、柱狀、條狀、塊狀、薄膜狀等等。
10、用固定化乳糖酶生產(chǎn)低乳糖奶用固定化乳糖酶處理鮮牛乳、消毒乳，固定化乳糖酶和牛乳的比例為10.0％-100％，pH自然，溫度4-50℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5-5小時(shí)，即可生產(chǎn)低乳糖液體奶和低乳糖奶粉。
本發(fā)明采用固定化技術(shù)，利用化學(xué)或物理手段將游離的微生物細(xì)胞或酶分子，定位于限定的空間區(qū)域不使細(xì)胞或酶分子泄露出來，底物分子可以自由進(jìn)出，使細(xì)胞和酶保持活性并可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。固定化技術(shù)包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)，固定化方法大致可以分成吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法等，其中以包埋法使用較為普遍。包埋法可分為凝膠包埋法和微膠囊法，就是將細(xì)胞包裹于凝膠的微小格子內(nèi)或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)，該方法操作簡單，對酶和細(xì)胞活性影響較小，制作的固定化細(xì)胞載體強(qiáng)度較高。固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)①易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；②可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；③可以提高酶的穩(wěn)定性；④酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；⑤產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提取工藝；⑥較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；⑦可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；⑧酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之處，只能用于水溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜；與完整細(xì)胞相比，不宜多酶反應(yīng)；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過細(xì)胞破壁和酶的分離等。
用固定化乳糖酶生產(chǎn)低乳糖奶，其特點(diǎn)是可以進(jìn)行連續(xù)處理，固定化酶不會(huì)隨液體奶流失，可以回收重復(fù)使用，降低低乳糖奶的生產(chǎn)成本。本發(fā)明也涉及用固定化乳糖酶處理鮮牛乳、消毒乳，生產(chǎn)低乳糖液體奶和低乳糖奶粉。
具體實(shí)施方式
取5000mL培養(yǎng)成熟的脆壁克魯維酵母細(xì)胞發(fā)酵液，經(jīng)10000r/min高速離心，獲得新鮮活性菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞用無菌水洗滌1-2次，然后用無菌水配制成細(xì)胞菌懸液，細(xì)胞濃度為5.0％-40.0％。
取菌懸液500mL，加入蛋白酶和β-葡聚糖酶，蛋白酶用量50.0u/g濕菌體，β-葡聚糖酶用量20u/g濕菌體，pH 6.5，42℃保溫1.5小時(shí)。
將經(jīng)酶處理后的細(xì)胞懸液取出，置于-25℃溫度下快速冷凍，使其徹底凍結(jié)，再將冷凍的細(xì)胞置于50℃溫度下迅速融化，得到凍融細(xì)胞懸液。
再將凍融的細(xì)胞懸液置于液體剪切破碎裝置高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行二次破壁，進(jìn)口處的溫度維持在20℃左右，出口處的溫度不要高于50℃，壓力維持在70MPa，得到無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的活性乳糖酶溶液，稱為Ls溶液。
固定化乳糖酶的制備稱取13.0g聚乙烯醇(PVA)，5.0g海藻酸鈉，加入100mL蒸餾水，攪拌10分鐘，靜止浸泡5小時(shí)，置于121℃溫度下滅菌20分鐘，冷卻至35℃，此溶液為Ps溶液。
稱取硼酸1.0-4.0g，氯化鈣0.5-6.0g，加入100mL水，加熱攪拌使其溶化，然后，121℃溫度滅菌20分鐘，冷卻至10℃-35℃，此溶液為硼酸-氯化鈣混合液。
量取上述Ls溶液和Ps溶液，Ps∶Ls按1∶2比例混合，在無菌條件下徹底攪拌均勻，此溶液稱為Ps-Ls溶液。
將Ps-Ls溶液500mL置于制粒機(jī)中，緩緩地滴入硼酸-氯化鈣溶液中，并不斷攪拌，防止粘連。Ps-Ls溶液與硼酸-氯化鈣溶液的比例按1∶4，經(jīng)3小時(shí)的硬化，撈出用無菌水洗滌兩次，即制得固體小球狀的固定化乳糖酶。若連續(xù)快速將Ps∶Ls溶液注入硼酸-氯化鈣溶液中可得到絲狀的固定化乳糖酶。
將固定化乳糖酶裝入容器中，然后再加入鮮牛乳，固定化乳糖酶和牛乳的比例為50.0％，pH自然，溫度42℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，即可制得低乳糖液體奶。
權(quán)利要求
1.固定化乳糖酶生產(chǎn)方法，其特征是(1)脆壁克魯維酵母菌懸液的制備將培養(yǎng)成熟的脆壁克魯維酵母細(xì)胞經(jīng)10000r/min高速離心，獲得新鮮活性菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞用無菌水洗滌1-2次，然后用無菌水配制成細(xì)胞菌懸液，細(xì)胞濃度為5.0％-40.0％；(2)酶預(yù)破壁處理取上述菌懸液500mL，加入蛋白酶和β-葡聚糖酶，蛋白酶用量1.0-150.0u/g濕菌體，β-葡聚糖酶用量1.0-100u/g濕菌體，pH6.0-7.0，30℃-65℃保溫1-6小時(shí)；(3)凍融破壁將經(jīng)酶處理后的細(xì)胞懸液取出，置于-20℃--50℃溫度下快速冷凍，使其徹底凍結(jié)，再將冷凍的細(xì)胞置于40℃-75℃迅速融化，得到凍融細(xì)胞懸液；(4)高壓勻漿機(jī)終極破壁將凍融的細(xì)胞懸液置于液體剪切破碎裝置高壓勻漿機(jī)中進(jìn)行二次破壁，進(jìn)口處的溫度維持在20℃-45℃，出口處的溫度不要高于50℃，壓力維持在30MPa-120MPa，得到無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的活性乳糖酶溶液，稱為Ls溶液；(5)制備固定化載體溶液稱取3.5g-20.0g聚乙烯醇(PVA)，0.5g-10.0g海藻酸鈉，加入100mL蒸餾水，攪拌10分鐘，靜止浸泡2-24小時(shí)，置于121℃溫度下滅菌20分鐘，冷卻至10℃-35℃，此溶液為Ps溶液；(6)制備乳糖酶固定化載體溶液量取上述Ls溶液和Ps溶液，Ps∶Ls按1∶1-1∶4，在無菌條件下徹底攪拌均勻，此溶液稱為Ps-Ls溶液；(7)制備固定液稱取硼酸1.0-4.0g，氯化鈣0.5-6.0g，加入100mL水，加熱攪拌使其溶化，然后，121℃溫度滅菌20分鐘，冷卻至10℃-35℃，此溶液為硼酸-氯化鈣混合液；(8)固定化將Ps-Ls溶液置于成型機(jī)中，緩緩地滴入硼酸-氯化鈣溶液中，Ps-Ls溶液與硼酸-氯化鈣溶液的比例按1∶1-1∶8，經(jīng)2-8小時(shí)的硬化，撈出用無菌水洗滌兩次，即制得固體固定化乳糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化乳糖酶生產(chǎn)方法，其特征是按固定化乳糖酶∶鮮牛乳＝1∶10-1∶100比例加入到鮮牛乳、消毒乳中，pH自然，溫度4-50℃，反應(yīng)0.5-5小時(shí)，生產(chǎn)低乳糖液體奶和低乳糖奶粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種固定化乳糖酶生產(chǎn)方法。它包括了(1)脆壁克魯維酵母菌懸液的制備，(2)酶預(yù)破壁處理，(3)凍融破壁，(4)高壓勻漿機(jī)終極破壁，(5)制備固定化載體溶液，(6)制備乳糖酶固定化載體溶液，(7)制備固定液和(8)固定化處理等過程。用固定化乳糖酶生產(chǎn)低乳糖奶，其特點(diǎn)是可以進(jìn)行連續(xù)處理，固定化酶不會(huì)隨液體奶流失，可以回收重復(fù)使用，降低乳糖奶的生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N11/08GK1818061SQ20061000975
公開日2006年8月16日 申請日期2006年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者梁金鐘 申請人:哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司