專利名稱：：一種福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬林業(yè)中的通過組織培養(yǎng)的植物再生
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植抹再生技術(shù)。二、
背景技術(shù)：
S畐建才白(Foh'em'fl/K%z>M77(Dunn)HenryetThomas)，另'J名^M^、；ji杉于、建柏、溪柏等，在分類上屬于棵子植物門(Gyn朋spermae)柏科(Cwp^Macaea)牙畐建4白屬(Fohe"/aHenryetThomus)。它是福建牙白屬p舉一才直物，主產(chǎn)于我國中南、華南至西南，越南和老撾也有分布，是我國第一批二級重點保護的珍稀樹種之一。福建柏為常綠喬木，樹高可達20m,胸徑可達80cm，樹冠闊圓錐形，樹皮紅褐色，近平滑，為薄片狀脫落，枝展開，生針葉的小枝扁平，排成一平面，鱗葉交叉對生，有二型；側(cè)葉對折呈長圓形，長39mm,頂端鈍或銳尖，稍內(nèi)彎或直；中葉三角形或菱狀卵形，常較側(cè)葉稍短，但近等長，頂端稍凸，上面中葉深綠色，下面中葉的+脈隆起，兩側(cè)具凹陷的白色氣孔帶。球花單性，雌雄同林，單生于枝頂，雄球花近球形，直徑L7-2.5cm,成熟時褐色，種麟6-8對，木質(zhì)盾形，頂部多角形，中央有小尖頭，發(fā)育的種麟有2個種子，種子卵形，長約4mm，頂端尖，具3-4棱，上部有大小不等的薄翅。福建柏自然分布于我國南亞熱帶的北部和中亞熱帶中南部中山丘陵地帶，主產(chǎn)地有福建、江西、浙江、廣東、廣西、云南、貴州、四川、和湖南等省，越南和老撾也有分布。整體分布區(qū)域呈東西走向長方形窄條狀；垂直分布一般在海拔1501200m之間，多數(shù)分布于海拔6001000m的山地丘陵中。截至目前，福建柏雖然分布比較廣，但其天然林多已被毀嚴(yán)重，現(xiàn)存天然種群個體數(shù)量少，普遍零星散生于毛竹、杉木和常綠闊葉林中，少有純林，稀有零星大樹分布，僅邊遠地帶存有星散狀的群體，且群體林?jǐn)?shù)多在20林以下，少則2-5林。。在其天然分布區(qū)域，福建柏多與其他樹種形成混交林，混交樹種隨海拔和地域而有規(guī)律地變化，越往西北，混交樹種中闊葉樹種越少，針葉樹種越多，闊葉樹中落葉成分越多，林分結(jié)構(gòu)越簡單，最后趨向散生、單林。研究同時表明，現(xiàn)存福建柏天然林為明顯的異齡林群體，生長參差不齊。研究表明，福建柏對林地條件要求沒有杉木高，生長速度一^:也不比同等立地條件下杉木慢，造林和管理成本也比杉木低，而抗病蟲害性能卻比杉木強，因此在南方各省提出多樹種造林應(yīng)用中，福建柏成為了替代杉木等樹種的新興的、較有發(fā)展前途的優(yōu)良樹種之一。截至目前，福建柏人工林的栽培史已有50年之久，但其總體面積仍不大，其中絕大部分(70%)分布在福建省，而福建省的福建柏人工林約有80%分布在閩東南一帶，如福州、永泰、南平、閩清、閩侯、龍巖、漳平和永安等市縣。對福建柏人工林組成研究表明，目前發(fā)展的福建柏人工林多以混交林為主，而且福建柏與其他樹種混交后都起到比較好的作用。研究表明，福建柏木材屬于輕木材，吸水性能良好，木材力學(xué)性能較好，物理力學(xué)性質(zhì)和工藝性質(zhì)優(yōu)于同齡杉木木材；福建柏木材化學(xué)成分測定實驗表明，福建柏作為造紙纖維原料使用時比杉木好，比馬尾松差；同時，其木材可溶物含量高。除了用材以外，福建柏的提取物也可充分利用，尤其是福建柏香精油具有特異香味，它含有42個組分，其中33種化合物目前已經(jīng)得到鑒定，主要成分為a-蒗烯、杵檬烯和石竹烯氧化物。在開展分布研究、人工林栽培及營林技術(shù)研究、木材性質(zhì)及利用研究同時，研究者還對其抗寒性方面進行了研究，初步解釋了福建柏適應(yīng)不利氣溫的生理機制調(diào)節(jié)反應(yīng)，并試圖尋求評估耐寒種源的途徑，為福建柏北移引種提供了理論依據(jù)。從以上有關(guān)針對福建柏的研究資料可以看出，作為我國第一批二級重點保護樹種之一，福建柏用途非常廣泛。其樹形優(yōu)美，樹干通直，生長快，適應(yīng)性強，良好的庭園觀賞樹種和行道綠化樹；木材心材黃褐色，材質(zhì)輕軟，紋理直，結(jié)構(gòu)細(xì)，加工易，切面光滑，膠粘性良好，耐腐性好，是建筑、裝飾、雕刻的優(yōu)良用材；栽培管理較容易，病蟲害較少，適合南方用材林的大面積推廣栽培；同時它還是提取香精油的重要原材料。然而，由于人為破壞嚴(yán)重，目前天然資源已被毀殆盡，人工林面積也不大。近年來，福建柏作為珍貴建筑材樹種和抗逆性強的造林樹種已越來越引起人們的重視，尤其在南方各省(區(qū))，福建柏已成為杉木二代更新不可多得的好樹種，其推廣前景廣闊?；诖?，研究者們從20世紀(jì)70年代起就陸續(xù)開展了優(yōu)樹選擇等良種繁育研究。然而，受當(dāng)時條件選擇，優(yōu)樹選擇和種子園建設(shè)等方面的工作都未能達到預(yù)期效果。直至90年代，"福建柏珍貴建材樹種良種選育及培育技術(shù)研究"和"福建柏良種選育及栽培技術(shù)"先后被列為國家"九五，，和"十五"林業(yè)科技攻關(guān)子專題，福建柏良種繁育技術(shù)才得以重新開展。截至目前，有關(guān)福建柏良種繁育方面的研究報道較少，而且少數(shù)幾篇論文都是由關(guān)于福建柏攻關(guān)課題組成員所寫的關(guān)于種源苗期實驗的階段成果。此外，由于福建柏種子大小年十分明顯，四年中才能有一個結(jié)實大年；同時，福建柏種子的發(fā)芽率本來就不高，發(fā)芽能力的保存期又短，種子貯藏后很快喪失生命力，良種繁育和種苗生產(chǎn)成為福建柏造林良種供應(yīng)的制約瓶頸。植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌環(huán)境下，把植物體的各種結(jié)構(gòu)(根尖、莖段、莖尖、幼葉、幼胚、花藥等)作為外植體接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件(溫度、濕度、光照等)下進行離體培養(yǎng)的技術(shù)與方法。自1902年德國植物學(xué)家Haberlandt在細(xì)胞學(xué)說的基礎(chǔ)上大膽提出植物細(xì)胞全能性以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了巨大的成功。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅是植物生物技術(shù)中應(yīng)用最廣、最具現(xiàn)實意義的領(lǐng)域，而且是農(nóng)業(yè)高新技術(shù)中最重要、最活躍的領(lǐng)域之一。與傳統(tǒng)的林木繁殖手段相比，林木組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖周期短、繁殖數(shù)量大、受天然環(huán)境影響小、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。我國植物組織培養(yǎng)研究起步較早，到上世紀(jì)70年代以后已在一些領(lǐng)域中處于國際先進水平。近20年來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)有了極大的進展，其中木本植物的組織培養(yǎng)也取得了巨大的成就，如花藥培養(yǎng)、莖尖與嫩葉培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交、突變體篩選、脫毒培養(yǎng)、人工種子等方面進展十分迅速。在木本植物中，針葉樹以樹形高大、通直、材質(zhì)優(yōu)良等特征著稱，它們不僅是主要的實木用材造林樹種，而且也是優(yōu)良的造紙用材樹種。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，針葉樹中有很多樹種還具有凈化空氣、保護環(huán)境的作用，因此針葉樹良種選育和繁育越來越引起人們的重視。然而由于針葉樹生長周期長，再生難度大，研究進展緩慢。通過組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖針葉樹，不僅是植樹造林所需大量苗木的一個重要生產(chǎn)途徑，也是生產(chǎn)優(yōu)良針葉樹種和優(yōu)良無性系的捷徑，同時還為植物基因工程技術(shù)在針葉樹遺傳改良的應(yīng)用提供了前提。因此，針葉樹的組織培養(yǎng)研究受到科研者的高度重視，現(xiàn)已成為許多發(fā)達國家和發(fā)展中國家林木生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的研究熱點之一。針葉樹體細(xì)胞無性系的成功建立是加速其品種改良和良種繁育的基礎(chǔ)，對無性系林業(yè)的發(fā)展、園林綠化和環(huán)境保護等方面也有著十分重要的作用。自從1975年Sommer從長葉松成熟合子胚的離體培養(yǎng)中經(jīng)器官發(fā)生成功獲得再生植抹以來，針葉樹的離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)取得了巨大進展。但從目前的情況來看，通過組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)針葉樹植抹的再生仍然是植物組織培養(yǎng)中難度較大的一個領(lǐng)域。人們通常將針葉樹的組織培養(yǎng)方式分為體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生兩種方式。這兩種方式都是以細(xì)胞全能性和細(xì)胞分化為基礎(chǔ)，誘導(dǎo)細(xì)胞進一步增殖、分化形成組織和器官，最終形成完整植林。盡管針葉樹通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生實現(xiàn)植抹再生的過程比較復(fù)雜，不同樹種間體細(xì)胞胚植抹再生頻率差異很大，且同一樹種內(nèi)不同基因型間的胚胎發(fā)生能力也存在很大差異，但培養(yǎng)程序和發(fā)育過程基本相似，都要經(jīng)過4個共同的步驟，即胚性胚柄細(xì)胞團的誘導(dǎo)(inductionofESM);胚性胚柄細(xì)胞團的維持和增殖(maintenanceandproliferationofESM);體纟田月包胚6々成IA(maturationofsomaticembryo);體細(xì)胞胚的萌發(fā)和植林再生(germinationandconversionofsomaticembryo)。胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)的機制主要來源于植物細(xì)胞的全能性。但在實驗過程中，不同外植體在不同培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的愈傷在外觀狀態(tài)、生長狀況、細(xì)胞形態(tài)和再生能力等各方面存在較大差別。從大量研究報道來看，在木本植物范圍中，闊葉樹種的幼嫩和成熟材料均能誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，而在針葉樹種中，從成熟外植體成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的報道較少，大多以不同發(fā)育階段合子胚為外植體進行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。研究者認(rèn)為，在以合子胚為起始材料進行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的過程中，通過提供人工培養(yǎng)條件來阻止合子胚的既定發(fā)育程序，使其停留在胚性胚柄細(xì)胞的分裂和增殖階段，在成功實現(xiàn)人工增殖的前提下促進胚性胚柄細(xì)胞向成熟胚胎的方向發(fā)育。研究胚性胚柄細(xì)胞的形成及其隨后的形態(tài)發(fā)生過程的首要前提是誘導(dǎo)出穩(wěn)定的、具有形態(tài)發(fā)生能力的胚性胚柄細(xì)胞團。在針葉樹中，影響胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)的重要因素包括外植體年齡、生理狀態(tài)及基因型；添加植物生長物質(zhì)的種類和濃度、基本培養(yǎng)基的種類及具體成分、碳源種類及濃度、有機附加物的種類和含量以及培養(yǎng)條件等?；九囵B(yǎng)基是影響胚性胚柄細(xì)胞團的誘導(dǎo)及其隨后形態(tài)發(fā)生能力的主要因素之一。在針葉樹的組織培養(yǎng)中，目前還沒有建立起一種像在被子植物組織培養(yǎng)中廣泛采用的MS—樣的通用基本培養(yǎng)基。在許多研究中，MS培養(yǎng)基被證明不適合于松柏類植物的組織培養(yǎng)。因此，研究者紛紛對MS進行改良，同時還設(shè)計了一些新的基本培養(yǎng)基，其中使用頻率較高的有DCR、LP、GD、BMS、LM、MNCI及SH等。不同基本培養(yǎng)基的區(qū)別主要存在在于各大量元素濃度及使用時所采用的倍數(shù)上。與MS基本培養(yǎng)基相比，它們最大的特點在于大量元素濃度較MS培養(yǎng)基中的更低；其次，幾種基本培養(yǎng)基中NH4N03的含量均較MS中要低，這其中起著重要作用的主要是NCV的含量。大量研究證明，LP培養(yǎng)基是誘導(dǎo)云杉屬樹種體細(xì)胞胚胎發(fā)生的最佳培養(yǎng)基。在薩哈林云杉和魚鱗松中，將LP培養(yǎng)基的濃度降至1/2效果更佳。而北美云杉和紅云杉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是1/2LM。在基本培養(yǎng)基成分中，氮源是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的重要因素，特別是還原態(tài)氮，如NH4N03的含量直接影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生。Tremblay的研究發(fā)現(xiàn)，黑云杉和紅云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生所需的最適NH4N03濃度分別是272~800mg/L和272~1200mg/L。LP培養(yǎng)基中NH4N03的濃度為1200mg/L,而在MS培養(yǎng)基中卻高達1650mg/L。因此，云杉屬樹種的體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)常用LP或1/2LP培養(yǎng)基,而很少用MS培養(yǎng)基，其中NH4N03濃度過高可能是主要原因。截止目前，世界各地已經(jīng)成功地從50多種針葉樹上謙導(dǎo)出了體細(xì)胞胚或體細(xì)胞胚的再生植抹，從近80種針葉樹上通過器官發(fā)生獲得了幼芽或再生植林。Laine和David以含有合子胚的胚乳或從胚乳剝離的合子胚為外植體，成功實現(xiàn)加勒比松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，并獲得完整的植抹，但誘導(dǎo)率極低，胚性培養(yǎng)物在LPG、LPB和LPA培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率分別僅為5%、3%和2%,完全不能實現(xiàn)優(yōu)良品種苗木的批量生產(chǎn)。Berlyn從次生葉誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，誘導(dǎo)出兩種愈傷組織，即白色致密型和白色半透明粘型。只有白色半透明粘型的愈傷組織能分化并產(chǎn)生子葉前期胚，但未能誘導(dǎo)出子葉胚和成熟胚。Berlyn同時還獲得了兩種源自成熟胚的愈傷組織，分別為致密綠色型和半透明白色型，只有半透明白色型的愈傷組織產(chǎn)生了體細(xì)胞胚；他們發(fā)現(xiàn)胚性胚柄細(xì)胞團產(chǎn)生于成熟胚外植體的基端，且在四種不同基本培養(yǎng)基上分別獲得了1.5%~7%不等的胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)率。由于以上胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)率都比較低，他們沒能獲得土壤條件下的完整再生植林。對于優(yōu)良無性系的開發(fā)和其在無性系造林中進一步應(yīng)用，體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率、成熟率及萌發(fā)率都顯得尤為重要。在中國，李映紅和郭仲琛等先后從青扦和落葉松的未成熟合子胚培養(yǎng)中獲得了體細(xì)胞胚的再生植林；黃健秋和衛(wèi)志明以馬尾松和云南松的成熟合子胚為起始材料成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚；此外,何子燦等以金錢松成熟合子胚為材料也成功實現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生；唐巍等以火炬松的成熟合子胚為外植體，建立了火炬松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生植林再生體系；齊力旺等以華北落葉松幼嫩合子胚為材料成功實現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，并探討了不同類型胚性和非胚性細(xì)胞的生理生化差異，為針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生理生化研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)；席夢利等以杉木合子胚的下胚軸和子葉為起始材料成功誘導(dǎo)出了子葉期體細(xì)胞胚；張宇等開展了馬尾松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的相關(guān)研究；楊金玲等利用青青桿和白桿的成熟合子胚為起始材料成功實現(xiàn)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植林再生。但目前尚無關(guān)于福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆植林再生技術(shù)的研究成果報道。三、
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在傳統(tǒng)的福建柏第一代遺傳改良的基礎(chǔ)上選擇優(yōu)良的基因型材料，研究尋找福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆植^^的再生技術(shù)，快速生產(chǎn)出高質(zhì)量的苗木，投放市場以供給社會各界對福建柏的需要，填補在這一領(lǐng)域的研究空白。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆植林再生技術(shù)，其特征是采用未成熟合子胚誘導(dǎo)出胚性胚柄細(xì)胞團，經(jīng)過維持、增殖、預(yù)成熟和成熟階段誘導(dǎo)獲得體細(xì)胞胚，再經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)實現(xiàn)植抹再生，其各階段使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如下a.釆用福建柏未成熟合子胚進行胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)，胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)采用DCR基本培養(yǎng)基，附加植物生長物質(zhì)是2，4-Dl-4mg/L、6-BA0.5mg/L及KT0.5mg/L;b.采用DCR固體培養(yǎng)基進行胚性胚柄細(xì)胞團的維持，采用DCR液體培養(yǎng)基進行胚性胚柄細(xì)胞團的增殖，維持和增殖所采用的基本培養(yǎng)基均為DCR基本培養(yǎng)基，其中固體維持培養(yǎng)基附加2,4-D0.2mg/L,6-BA0.05mg/L及KT0.05mg/L;液體懸浮增殖培養(yǎng)基附加2,4-D0.5mg/L,6-BA0.1mg/L及KTO.lmg/L;其中培養(yǎng)物細(xì)胞初始密度為0.10%-1.20%,搖床轉(zhuǎn)速為75-90r.p.m，繼代周期為7天；c.采用DCR液體培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的預(yù)成熟，附加的植物生長物質(zhì)是ABA5~10mg/L,其中培養(yǎng)物細(xì)胞初始密度為0.80%,搖床轉(zhuǎn)速為卯r.p.m,繼代周期為7天；d.采用DCR固體培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的成熟，附加植物生長物質(zhì)ABA5~10mg/L、滲透壓調(diào)節(jié)劑聚乙二醇(PEG8000)130-170g/L;e.采用DCR基本培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的萌發(fā)，附加活性炭lg/L;f.采用固體改良DCR基本培養(yǎng)基進行再生植林的壯苗，蔗糖濃度降至20g/L。以上培養(yǎng)過程中使用的兩種基本培養(yǎng)基的配方分別如下DCR(GuptaandDurzanmedium)基本培養(yǎng)基大量元素KN03Ca(N03)2-4H2ONH4N03KH2P04CaCl,2H20MgSO4-7H20NarEDTA,H20FeS04.7H20H3B03鐵鹽340mg/1556mg/1400mg/1170mg/185mg/1370mg/137,3mg/127.8mg/16.2mg/lMnS04'112022.3mg/lZnSO4-7H208.6mg/lNa2Mo04,2H200.25mg/lCuS04.5H200.25mg/lKI0.83mg/lCoCl20.025mg/lNiCl20.025mg/l有機物質(zhì)MyO-Inositol200mg/lGlycine2.0mg/1Thiamine'HCl1.0mg/1Nictinic'acid0.5mg/1Pyridoxine-HCl0.5mg/1改良DCR基本培養(yǎng)基大量元素KN03170mg/1Ca(N03)2.4H2O278mg/1NH4N03200mg/1KH2P0485mg/1CaCl2.2H2042.5mg/1MgSO4'7H20185mg/1Na2-EDTA'H2037.3mg/1FeS04.7H20278mg/1微量元素H3B036.2mg/lMnS04-H2022.3mg/lZnSO4-7H208.6mg/lNa2Mo04-2H200,25mg/lCuS04-5H200.25mg/lKI0.83mg/lCoCl20.025mg/lNiCl20.025mg/l有機物質(zhì)MyO-Inositol200mg/lGlycine2.0mg/1Thiamine'HCl1.0mg/1Nictinic.acid0.5mg/1Pyridoxine-HCl0.5mg/1四圖1為誘導(dǎo)完成后的胚性胚柄細(xì)胞團的顯微照片；圖2為誘導(dǎo)完成后的胚性胚柄細(xì)胞的顯微照片；圖3為維持和增殖培養(yǎng)后的早期體細(xì)胞胚顯微照片;圖4為預(yù)成熟培養(yǎng)后的早期體細(xì)胞胚顯微照片；圖5為處于成熟過程中的體細(xì)胞胚；圖6為子葉期體細(xì)胞胚；圖7為體細(xì)胞胚的萌發(fā)狀態(tài)；圖8為移栽后的再生植j朱。五具體實施方式供試材料為福建柏優(yōu)良個體不同發(fā)育程度的合子胚。球果采集時間為6月底至10月初，相應(yīng)合子胚發(fā)育階段為幼胚至成熟胚階段。球果采集后用新鮮菜瓜葉、濕潤紗布和牛皮紙信封及時包裹保鮮，隨后置于4。C冰箱冷藏保存?zhèn)溆?。將備用球果取出，用含洗滌劑的洗液浸?0分鐘，然后流水沖洗2小時。在超凈工作臺上用解剖刀將球果切開，用鑷子取出帶翅種子，去除種翅。用解剖刀和4聶子將種皮和胚乳剝?nèi)ィ?5%酒精中浸泡45秒，無菌水沖洗3遍，0.1%升汞+稀釋10倍的84消毒液(1:1)消毒5分鐘，無菌水沖洗5遍，將合子胚置于無菌濾紙上吸干，隨后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。a.胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)階段釆用DCR培養(yǎng)基，附加的植物生長物質(zhì)種類及濃度分別為2,4-D0、1、2、4、7、10mg/L，6-BA0、0.5、1、2mg/L,KT0、0.5、1、2mg/L,ZT0.1、0.2、0.4mg/L。同時附加活性炭濃度為0、0.5、1、2g/L。其中培養(yǎng)基的麥芽糖濃度為30g/L，瓊脂5.4g/L,滅菌前將其pH調(diào)至5.7,于121。C高溫、高壓滅菌16分鐘。培養(yǎng)溫度為23°C,培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)。產(chǎn)生的胚性胚柄細(xì)胞團每2周繼代一次。材料接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后約2周開始啟動，合子胚基部長出白色、半透明、有粘性的絲狀愈傷，即胚性胚柄細(xì)胞團(參見附圖1)。在顯微鏡下觀察，胚性胚柄細(xì)胞團由大量胚性胚柄細(xì)胞組成。其中細(xì)胞質(zhì)濃厚的小細(xì)胞構(gòu)成胚頭部分，具有大液泡的長細(xì)胞形成胚柄部分，兩者相互連接構(gòu)成胚性胚柄細(xì)胞(參見附圖2)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨著培養(yǎng)時間的延長，部分胚性培養(yǎng)物開始變褐，0.5lg/L活性炭、5mg/L的抗壞血酸或?qū)⑴囵B(yǎng)物及時轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基均能抑制褐化的產(chǎn)生。實驗表明，添加不同濃度的2,4-D均能誘導(dǎo)胚性胚柄細(xì)胞，但在誘導(dǎo)率、誘導(dǎo)物的外觀狀態(tài)和生長狀態(tài)等方面均存在差異，具體表現(xiàn)參見表1。表1不同2，4-D濃度對福建柏胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)的影響2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2,4-D濃度過高，細(xì)胞團排列不緊密，含水量較重；2，4-D濃度過低，細(xì)胞團粘性較差，含水少，生長緩慢。綜合誘導(dǎo)率和所獲得細(xì)胞團的外觀狀態(tài)考慮，1-4mg/L較適合福建柏未成熟合子胚胚性胚柄細(xì)胞團的誘導(dǎo)。比較了細(xì)胞分裂素種類及其濃度、不同碳源種類及其濃度、活性炭濃度以及合子胚成熟程度對胚性胚柄細(xì)胞團的影響。結(jié)果表明，0.5mg/L6-BA和0.5mg/LKT的組合使用、30g/L麥芽糖及l(fā)g/L活性炭較適合福建柏胚性胚柄細(xì)胞團的誘導(dǎo)。處于裂生多胚期至子葉胚前期的合子胚較適合胚性胚柄細(xì)胞團的誘導(dǎo)。此外，源自不同優(yōu)樹的合子胚在誘導(dǎo)率上也存在一定的差異。b.胚性胚柄細(xì)胞團的維持和增殖大量研究表明，在木本植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，在誘導(dǎo)初始階段需要高濃度的植物生長物質(zhì)，隨后誘導(dǎo)物的維持和增殖則需要降低其濃度。胚性培養(yǎng)物長期處于高濃度植物生長物質(zhì)環(huán)境將導(dǎo)致畸形胚比例的增加甚至是體細(xì)胞胚發(fā)生能力的下降。此外，相較于固體培養(yǎng)，胚性培養(yǎng)物的液體懸浮培養(yǎng)過程涉及的影響因素更多，如培養(yǎng)物初始密度、搖床轉(zhuǎn)速、繼代周期等，在評價液體懸浮培養(yǎng)的效率時需要將各因素綜合考慮。本實施例中，福建柏胚性胚柄細(xì)胞團的維持和增殖繼續(xù)使用DCR作為基本培養(yǎng)基，同時附加低濃度的生長素和細(xì)胞分裂素。在固體培養(yǎng)基上，用于胚性培養(yǎng)物維持和增殖的培養(yǎng)基中植物生長物質(zhì)供試濃度分別為2,4-D0.2、0.5、1.0、2.0mg/L，6-BA0.05、0.1、0.2mg/L，ZTO.l、0.2mg/L。綜合胚性胚柄細(xì)胞團增殖系數(shù)和和形態(tài)發(fā)育等方面綜合考慮，在固體培養(yǎng)基上，適合于福建柏胚性胚柄細(xì)胞團維持的植物生長物質(zhì)濃度組合為2,4-D0.2mg/L、6-BA0.05mg/L、KT0.05mg/L;適合于增殖的植物生長物質(zhì)濃度為2,4-D0.5mg/L、6-BA0.1mg/L、KT0.1mg/L。研究證明，在針葉樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，液體懸浮培養(yǎng)有利于胚性胚柄細(xì)胞團的增殖和單個體細(xì)胞胚向成熟方向發(fā)育。在本實施例中，將一定量維持于固體維持培養(yǎng)基的胚性胚柄細(xì)胞團接種于液體懸浮培養(yǎng)基中，置于搖床上進行振蕩培養(yǎng)。在胚性胚柄細(xì)胞團的液體懸浮培養(yǎng)基中，除不含凝固劑外，其余培養(yǎng)基成分與固體增殖培養(yǎng)基相同，其中培養(yǎng)物供試初始密度為0.10%、0.40%、0.80%和1.20%(w/v),搖床轉(zhuǎn)速為60、75、90和105r.p.m,繼代周期均為7天。綜合培養(yǎng)物增殖系數(shù)和單個體細(xì)胞胚形態(tài)發(fā)育程度考慮，75-90r.p.m的轉(zhuǎn)速條件更適合于福建柏體細(xì)胞胚的發(fā)育，而在初始密度方面，四個處理間無明顯差異。經(jīng)過適宜液體懸浮培養(yǎng)后，單個早期體細(xì)胞胚的胚頭細(xì)胞和胚柄細(xì)胞數(shù)目均明顯增加，其中胚頭細(xì)胞排列緊密，胚柄細(xì)胞呈縱向緊密排列(參見附圖3)。c.體細(xì)胞胚的預(yù)成熟大量研究表明，液體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基成分分布均勻，溶氧充足，有利于胚性細(xì)胞的分裂和胚性胚柄細(xì)胞的增殖；但是，維持和增殖培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的存在不利于胚性胚柄細(xì)胞向單個體細(xì)胞胚方向發(fā)育。ABA的使用能阻止胚性細(xì)胞的無序分裂和增殖，抑制裂生多胚的產(chǎn)生并促進體細(xì)胞胚的成熟。經(jīng)過ABA預(yù)成熟培養(yǎng)處理后，能獲得胚頭發(fā)育明顯、胚柄細(xì)胞呈有序排列的早期體細(xì)胞胚結(jié)構(gòu)。在過程b中，經(jīng)過液體增殖懸浮培養(yǎng)的胚性培養(yǎng)物由大量大小均一、發(fā)育整齊早期體下?lián)芘呓M成。此時經(jīng)液體懸浮液靜置后，去除上清，將一定量沉淀轉(zhuǎn)入分別含ABA5、10、15和20mg/L的液體DCR預(yù)成熟培養(yǎng)基，置于90r.p.m搖床上進行振蕩培養(yǎng)。經(jīng)驗證，在同等條件下，5-10mg/L的ABA有利于單個體細(xì)胞胚發(fā)育，同時單位體積獲得的早期體細(xì)胞胚數(shù)也較多。本實施例中其它培養(yǎng)條件為初始密度0.80%、繼代周期7天。經(jīng)過本實施例的預(yù)成熟培養(yǎng)后，早期體細(xì)胞胚的胚頭和胚柄部分細(xì)胞數(shù)目增殖明顯，胚頭細(xì)胞排列緊密，且縱向和橫向方向均發(fā)育明顯；胚柄細(xì)胞在縱向上呈平行排列(參見附圖4)。d.體細(xì)胞胚的成熟針葉樹體細(xì)胞胚的成熟即是在合適的人工培養(yǎng)條件下，早期體細(xì)胞胚經(jīng)過形態(tài)成熟和生理成熟，最終達到與成熟合子胚一樣具有形態(tài)發(fā)生能力并產(chǎn)生再生植抹的過程。在整個成熟過程中，影響早期體細(xì)胞胚成熟的因素主要來自兩個方面，即早期體細(xì)胞胚自身和培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境。其中早期體細(xì)胞胚自身主要涉及胚性胚柄細(xì)胞團的前期發(fā)育，它主要與誘導(dǎo)、維持和增殖階^:的相關(guān)因素有關(guān)；而與體細(xì)胞胚成熟有關(guān)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境因素主要包括ABA水平的優(yōu)化、培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)、乙烯水平的控制以及干化處理，此外還有培養(yǎng)基pH值和光周期等都可能對體細(xì)胞胚的成熟有影響。在本實施例中，將經(jīng)過預(yù)成熟培養(yǎng)獲得早期體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入不同體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基，其中成熟培養(yǎng)基均以DCR為基本培養(yǎng)基，采用固體形式。大量針對針葉樹合子胚發(fā)育和體細(xì)胞胚成熟的研究表明，針葉樹體細(xì)胞胚的成熟過程需要經(jīng)歷與合子胚發(fā)育類似的環(huán)境，即需要高滲透壓環(huán)境和一定濃度ABA的存在。在本實施例中，用于福建柏體細(xì)胞胚成熟的PEG濃度為50、90、130、170和210g/L,供試ABA濃度范圍為2.5、5、10和20mg/L,同時附加l.Og/L的活性炭。在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周后，單個體細(xì)胞胚胚頭部分發(fā)育明顯，胚柄部分縱向排列緊密，最終發(fā)育為胚和胚柄相連接的結(jié)構(gòu)(參見附圖5、6)。不同濃度的PEG和ABA對體細(xì)胞胚發(fā)育狀況、單位體積體細(xì)胞胚數(shù)等的影響參見表2和表3:表2不同PEG濃度對福建柏體細(xì)胞胚成熟的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表3ABA濃度對福建柏體細(xì)胞胚成熟的影響ABA濃度(mg/L)單位體積體細(xì)胞胚數(shù)(個/ml)體細(xì)胞胚生長狀態(tài)2.536生長快，40天能達到子葉前期胚，存在早熟萌發(fā)567生長較快，50天左右能達到子葉前期胚，存在早熟萌發(fā)10132生長慢，65天能長出子葉前期胚，有少量子葉胚產(chǎn)生2097生長緩慢，部分達子葉胚，其余在80天左右開始壞死綜合體細(xì)胞胚發(fā)育狀況、單位體積體細(xì)胞胚數(shù)等因素考慮，130-170g/LPEG和5-10mg/LABA有利于福建柏體細(xì)胞胚的成熟。在篩選合適PEG濃度和ABA濃度的同時還比較了不同凝固劑或液體吸附體(凝固劑替代物)對福建柏體細(xì)胞胚成熟的影響。結(jié)果表明，水晶洋菜較瓊脂、巖棉和脫脂棉(作為培養(yǎng)基吸附體)更適合體細(xì)胞胚的成熟。此外，在培養(yǎng)物于成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，將其轉(zhuǎn)接至不含ABA的相同成熟培養(yǎng)基上有利于體細(xì)胞胚的正常發(fā)育；lg/L的活性炭有利于降低畸形體細(xì)胞胚的頻率。e.體細(xì)胞胚的萌發(fā)及植^朱再生與合子胚發(fā)育過程類似，體細(xì)胞胚在經(jīng)過形態(tài)成熟和生理成熟過程后，形成具備胚根、胚軸和子葉的完整胚結(jié)構(gòu)。在合適的培養(yǎng)條件下，此階段的胚具有萌發(fā)并最終產(chǎn)生完整植;昧的形態(tài)發(fā)生能力。在本實施例中，培養(yǎng)于成熟培養(yǎng)基上的福建柏體細(xì)胞胚經(jīng)過形態(tài)成熟和生理成熟后形成長約lmm、具2片子葉的完整胚結(jié)構(gòu)。將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至以DCR為基本培養(yǎng)基的萌發(fā)培養(yǎng)基，以水晶洋菜為凝固劑，附加lg/L活性炭和30g/L蔗糖。培養(yǎng)環(huán)境為25°C、20001x及16/8小時的光/暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5天左右，體細(xì)胞胚的子葉端開始逐漸變綠，同時胚根端逐漸延長(參見附圖7)。培養(yǎng)2周左右，體細(xì)胞胚萌發(fā)、生長最終形成具備莖端和根端的完整植抹。培養(yǎng)4周后統(tǒng)計，福建柏正常萌發(fā)并產(chǎn)生再生植抹的比例達76%。此外，以改良DCR為基本培養(yǎng)基和降低蔗糖濃度能在一定程度上提高福建柏體細(xì)胞胚正常萌發(fā)產(chǎn)生再生植林的頻率。值得注意的是，由于體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有兩極性的特點，能同時形成芽和根，形成完整的幼苗，很好地解決了組織培養(yǎng)中生根難的問題。f.再生植林的壯苗、馴化及移栽待萌發(fā)培養(yǎng)基上的體細(xì)胞胚再生植林生長至長約1.5cm、胚根明顯延長、兩片子葉變綠并明顯張開后，將其轉(zhuǎn)移至僅含20g/L蔗糖的改良DCR基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同萌發(fā)階段，使再生植林達到壯苗目的。體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的難題之一便是較難形成發(fā)達的根系，解決的辦法是提供低滲培養(yǎng)環(huán)境，如降低蔗糖濃度和無機鹽濃度，抑制主根過度延長，必要時可加入0.1mg/L的IBA，這樣可以誘導(dǎo)根系發(fā)達的須根系統(tǒng)。在本實施例中，改良DCR培養(yǎng)基較正常DCR培養(yǎng)基的大量元素減半，其余培養(yǎng)基成分不變，在添加20g/L蔗糖的情況下，培養(yǎng)45天后能形成莖葉生長正常、具2-3條根的健壯植抹。本發(fā)明采取體胚出苗后苗木發(fā)育階段控制和生理脅迫相結(jié)合的方法，使移苗成活率達到90以上。待經(jīng)過壯苗培養(yǎng)的體細(xì)胞胚再生植林長至2-3cm高、且根葉發(fā)達時，將瓶苗轉(zhuǎn)移至馴化環(huán)境，在3天的馴化時間內(nèi)將封口膜逐漸揭開，使幼苗逐漸適應(yīng)空氣濕度。將經(jīng)過馴化后的幼苗洗去根部培養(yǎng)基，移至由珍珠巖和泥炭土構(gòu)成(2:1)的基質(zhì)中(參見附圖8)。在移苗后2周內(nèi)注意保持溫度、空氣濕度以及土壤濕度的穩(wěn)定。移苗后1周開始開始葉面施肥，成活后便可以根部施肥。移栽4周后統(tǒng)計，移栽成活率達82%。采用本發(fā)明所提供的福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生成套技術(shù)方法進行福建柏大量繁殖的開發(fā)，是一種很高效的途徑，一旦得到胚性胚柄細(xì)胞團后，可以在對特定細(xì)胞系進行維持和增殖的同時，利用該技術(shù)體系獲得大量遺傳基礎(chǔ)一致的無性系再生植林，形成一個良好的生產(chǎn)循環(huán)體系。福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)的建立為福建柏珍稀遺傳資源的保存和福建柏苗木的大量生產(chǎn)提供一個周期短、繁殖效率高、成本低廉的技術(shù)體系。權(quán)利要求1.一種福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆植株再生技術(shù)，其特征是采用未成熟合子胚誘導(dǎo)出胚性胚柄細(xì)胞團，經(jīng)過維持、增殖、預(yù)成熟和成熟階段誘導(dǎo)獲得體細(xì)胞胚，再經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)實現(xiàn)植株再生，其各階段使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如下a.采用福建柏未成熟合子胚進行胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)，胚性胚柄細(xì)胞團誘導(dǎo)采用DCR基本培養(yǎng)基，附加植物生長物質(zhì)是2，4-D1-4mg/L、6-BA0.5mg/L及KT0.5mg/L；b.采用DCR固體培養(yǎng)基進行胚性胚柄細(xì)胞團的維持，采用DCR液體培養(yǎng)基進行胚性胚柄細(xì)胞團的增殖，維持和增殖所采用的基本培養(yǎng)基均為DCR基本培養(yǎng)基，其中固體維持培養(yǎng)基附加2，4-D0.2mg/L，6-BA0.05mg/L及KT0.05mg/L；液體懸浮增殖培養(yǎng)基附加2，4-D0.5mg/L，6-BA0.1mg/L及KT0.1mg/L；其中培養(yǎng)物細(xì)胞初始密度為0.10％-1.20％，搖床轉(zhuǎn)速為75-90r.p.m，繼代周期為7天；c.采用DCR液體培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的預(yù)成熟，附加的植物生長物質(zhì)是ABA5～10mg/L，其中培養(yǎng)物細(xì)胞初始密度為0.80％，搖床轉(zhuǎn)速為90r.p.m，繼代周期為7天；d.采用DCR固體培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的成熟，附加植物生長物質(zhì)ABA5～10mg/L、滲透壓調(diào)節(jié)劑聚乙二醇(PEG8000)130-170g/L；e.采用DCR基本培養(yǎng)基進行體細(xì)胞胚的萌發(fā)，附加活性炭1g/L；f.采用固體改良DCR基本培養(yǎng)基進行再生植株的壯苗，蔗糖濃度降至20g/L。全文摘要一種福建柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生和克隆植株再生技術(shù)，其特征是采用未成熟合子胚誘導(dǎo)出胚性胚柄細(xì)胞團，經(jīng)過維持、增殖、預(yù)成熟和成熟階段誘導(dǎo)獲得體細(xì)胞胚，再經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)實現(xiàn)植株再生，其各階段使用的基本培養(yǎng)基分別為DCR基本培養(yǎng)基和大量元素減半的改良DCR培養(yǎng)基。采用本發(fā)明所提供的方法，可以獲得大量遺傳基礎(chǔ)一致的無性系再生植株，為珍稀遺傳資源的保存和福建柏苗木的大量生產(chǎn)提供了一種周期短、繁殖效率高、成本低廉的新技術(shù)。文檔編號C12N5/04GK101165174SQ20071013270公開日2008年4月23日申請日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者施季森,陳加飛申請人:南京林業(yè)大學(xué)