專利名稱：一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)體細(xì)胞胚快繁三七再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用小型生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)體細(xì)胞胚，簡單快速無性繁殖三七再生植株的方法。本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)又名田七、金不換、三七參等，為五加科人參屬植物，三七為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，主要以塊根入藥。三七性溫，味甘、苦，具有止血鎮(zhèn)痛、活血化瘀、滋補強壯和消除疲勞增強體力之功效，傳統(tǒng)上常用于治療咳血、吐血、月·經(jīng)過多、皮下出血及跌打和刀槍損傷等癥，具有多方面的藥理作用和保健功能，開發(fā)前景廣闊。由于三七同為人參屬植物，而它的有效活性物質(zhì)又高于或多于人參，因此又被現(xiàn)代中藥藥物學(xué)家稱為“參中之王”。三七從播種至收獲，要經(jīng)三年以上時間(王淑琴等，《中國三七》，1993)，種子又有休眠，需要經(jīng)過3-6個月的層積處理期才能發(fā)芽。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)一誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑對其進(jìn)行快速繁殖和種質(zhì)保存一直是人們研究的問題。劉瑞駒等于1991年首次報道了三七組培苗的再生，他們以幼苗為材料，將莖、葉柄和葉分別進(jìn)行離體培養(yǎng)，最后均從胚性愈傷組織中分化出胚狀體，進(jìn)而發(fā)育成完整植株(劉瑞駒，植物生理學(xué)通訊，1991，27(3) :210)。次年，陳偉榮等利用三七花序誘導(dǎo)了胚性愈傷組織，通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得再生植株(陳偉榮，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，13 (3) :69)。許鴻源等用葉片和葉柄作為外植體誘導(dǎo)獲得了體細(xì)胞胚再生植株(中國中藥雜志，2007，32 :481)。盡管對三七體細(xì)胞胚發(fā)生及其植株再生的研究較多，但是利用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)三七體細(xì)胞胚還未有報道。本發(fā)明介紹的是利用一種生物反應(yīng)器培養(yǎng)體細(xì)胞胚，快速生產(chǎn)體細(xì)胞胚及其小苗的方法。該發(fā)明為試管苗在生產(chǎn)中的利用打下了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種更快、更高效無性繁殖三七再生植物的方法一利用小型生物反應(yīng)器培養(yǎng)三七體細(xì)胞胚快繁再生植株的方法。該發(fā)明也為三七的分子育種、規(guī)?；a(chǎn)苗木提供技術(shù)支持。本發(fā)明主要是涉及誘導(dǎo)三七體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育、苗木移栽等過程中組織培養(yǎng)方法以及利用小型生物反應(yīng)器(3L)培養(yǎng)大量培養(yǎng)體細(xì)胞胚的技術(shù)方法等。具體的發(fā)明內(nèi)容的技術(shù)路線包括以下幾個部分的內(nèi)容(I)三七胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖首先三七種子進(jìn)行發(fā)芽處理，用發(fā)芽的無菌小苗誘導(dǎo)出不定根后，再將不定根切成約Icm的根段,接種到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)。5周后誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并進(jìn)行繼代增殖。(2)體細(xì)胞胚發(fā)生的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚發(fā)育
誘導(dǎo)增殖的胚性愈傷組織接種到含有不同濃度2，4-D的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D處理的條件下，有100%的愈傷組織都產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，且產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)量最多。(3)小型生物反應(yīng)器高效培養(yǎng)體細(xì)胞胚將誘導(dǎo)和增殖的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)到添加有0-1. Omg/L 2，4_D，30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生。當(dāng)球形胚形成后，將其接種到裝有不加2，4-D的1/2MS液體培養(yǎng)基的三角瓶(IOOml)中培養(yǎng)3周，以確定初始接種量與培養(yǎng)基量比例。然后將10. Og (大約I. 65 X IO4個)球形胚轉(zhuǎn)入3L生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該反應(yīng)器內(nèi)裝有I. 5L不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑1/2MS液體培養(yǎng)基，空氣通入量為O. 15vvm。4周后球形胚都發(fā)育為子葉體細(xì)胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍。(4)體細(xì)胞胚的萌發(fā)和馴化 上述液體或固體培養(yǎng)獲得的子葉體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入含有一系列濃度的GA3的1/2MS培養(yǎng)基中促進(jìn)體細(xì)胞胚正常萌發(fā)成體細(xì)胞胚苗。然后三七體細(xì)胞胚幼苗轉(zhuǎn)入不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。之后，將生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質(zhì)巖(3 : l，v : v))的營養(yǎng)杯中，溫室(18 25°C)訓(xùn)化3個月后，成活率為66.7%。本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基都是按常規(guī)處理(調(diào)整pH值為5. 8，經(jīng)過高溫高壓滅菌(121°C、I. 5個大氣壓、15分鐘))后使用的，培養(yǎng)環(huán)境為常規(guī)組織培養(yǎng)室(溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70% )。本發(fā)明的特征能更快更高效的繁殖三七再生植株1)生物反應(yīng)器的工作量非常大，3L的小型生物反應(yīng)器一個培養(yǎng)周期就可以生產(chǎn)約I. 65X IO4個體細(xì)胞胚；2)由于本發(fā)明中三七植株再生方式是體細(xì)胞胚途徑，再生植株能直接萌發(fā)成小苗，相對像器官發(fā)生途徑樣，節(jié)省了生根過程。


圖13L小型生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)三七體細(xì)胞胚。A，培養(yǎng)的不定根段(比例尺
2.0cm) ；B,不定根在I. Omg/L 2，4_D的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5周后誘導(dǎo)的胚性愈傷組織(比例尺2. 0cm) ;C，繼代擴增的愈傷組織(比例尺2. 0cm) ;D，E，分別是胚性愈傷組織在不加2，4-D(D)和加有O. 5mg/L 2，4_D(E)的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，分化的體細(xì)胞胚(比例尺I. 0cm) ；F, E中分化的球形體細(xì)胞胚發(fā)育到魚雷和子葉體胚(比例尺1. 0cm) ;G，懸浮培養(yǎng)E中分化的球形體細(xì)胞胚(比例尺1. 0cm) ;H，在不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中發(fā)育成熟的子葉體細(xì)胞胚(比例尺1. 7cm) ;1，通過懸浮培養(yǎng)獲得的體細(xì)胞胚培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基(比例尺3.0mm) ;J，3L生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)4周E中的球形體細(xì)胞胚(比例尺1.0cm)；K，J中生物反應(yīng)器培養(yǎng)的體細(xì)胞胚(比例尺5. 0mm) ;L，J中生物反應(yīng)器培養(yǎng)的子葉體細(xì)胞胚(比例尺1· 5cm)。圖2體細(xì)胞胚萌發(fā)、植株轉(zhuǎn)化和土壤移栽。A，在不含激素的1/2MS培養(yǎng)中培養(yǎng)的子葉體細(xì)胞胚根形成但頂芽生長不好(比例尺5mm) ;B，體細(xì)胞胚在含有2. Omg/L GA31/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后根端和頂芽生長(比例尺1. 2cm) ;C，在1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月后頂芽和根端發(fā)育良好的體細(xì)胞胚幼苗(比例尺1. 2cm) ;D，幼苗移栽入人工土壤中生長3個月后幸存的幼苗(比例尺7mm)；
具體實施例方式實例I誘導(dǎo)三七體細(xì)胞胚發(fā)生、發(fā)育I)誘導(dǎo)三七胚性愈傷組織并進(jìn)行增殖首先三七種子進(jìn)行發(fā)芽處理，用發(fā)芽的無菌小苗誘導(dǎo)出不定根后，再將不定根切成約Icm的根段,接種到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)。5周后有大約50%的不定根誘導(dǎo)出了愈傷組織。愈傷組織都是從不定根的兩端切口地方產(chǎn)生，且松散、乳白色。這些愈傷組織每隔3周在同樣的培養(yǎng)基中繼代一次，很快增殖。2)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生的和發(fā)育
誘導(dǎo)增殖的胚性愈傷組織接種到含有不同濃度2，4_D的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D處理的條件下，有100%的愈傷組織都產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，有100%的愈傷組織都產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，且產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)量最多，為32. 7個。黃色的球形體細(xì)胞胚形成于愈傷組織的表層細(xì)胞。其他處理體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率較低，平均每團(tuán)愈傷組織產(chǎn)生的體細(xì)胞胚的數(shù)量較少(表I)。表I不同濃度的2，4-D對體細(xì)胞胚分化的影響
權(quán)利要求
1. 一種利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)體細(xì)胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟 1)利用無菌生生小苗的子葉、胚根、下胚軸等為外植體，通過常規(guī)培養(yǎng)方法獲得不定根后，將其切成Icm的根段，接種到添加有I. Omg/L 2，4_D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，并在同樣的條件下繼代增殖； 2)將胚性愈傷組織接種 到含有O.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，100%的愈傷組織都產(chǎn)生了球形體細(xì)胞胚，且產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)量最多；將10. Og(大約I. 65X IO4個)球形胚轉(zhuǎn)入3L生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，該反應(yīng)器內(nèi)裝有I.5L不加有任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS液體培養(yǎng)基，通入空氣流量為O. 15vvm。4周后球形胚都發(fā)育為子葉體細(xì)胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍； 3)上述獲得的子葉體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)2周萌發(fā)成體細(xì)胞胚苗，之后轉(zhuǎn)入不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 4)將生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質(zhì)巖(3 Lv V))的營養(yǎng)杯中，18 25°C溫室訓(xùn)化3個月后，成活率為66. 7% ; 5)步驟I)、2)、3)中所用的培養(yǎng)基都是按常規(guī)處理調(diào)整pH值為5.8，經(jīng)過高溫高壓滅菌(121°C、1. 5個大氣壓、15分鐘后使用的，培養(yǎng)環(huán)境為常規(guī)組織培養(yǎng)室溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70%。
全文摘要
本發(fā)明主要提供一種高效無性快繁三七再生植物的方法利--用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)三七體細(xì)胞胚。從不定根誘導(dǎo)獲得的三七胚性愈傷組織增殖后，在含有0.5mg/L 2，4-D的MS條件下，100％的愈傷組織都產(chǎn)生了球形體細(xì)胞胚，且產(chǎn)生的體細(xì)胞胚數(shù)量最多。10.0g(約1.65×104個)球形胚培養(yǎng)在3L生物反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)器內(nèi)裝有1.5L不加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS液體培養(yǎng)基，空氣通入量為0.15vvm。4周后球形胚都發(fā)育為子葉體細(xì)胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍。液體或固體培養(yǎng)獲得的子葉體細(xì)胞胚在含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培養(yǎng)基中萌發(fā)成正常體細(xì)胞胚苗，繼而在不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基中繼代。生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質(zhì)巖(3∶1，v∶v))的營養(yǎng)杯中，溫室訓(xùn)化成活率較高。
文檔編號A01H4/00GK102907318SQ20111021712
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月1日
發(fā)明者由香玲, 詹亞光, 李玉花, 譚嘯, 代金玲, 陶雷, 尹靜 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 由香玲