專利名稱：哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)及使用所述哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)的 方法。
背景技術(shù)：
近來，隨著基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)步，大量地克隆及表達(dá)重組蛋白質(zhì)的能力 變得越來越重要。純化高水平蛋白質(zhì)的能力在用于產(chǎn)生諸如胰島素等蛋白質(zhì)醫(yī)藥的人 類制藥學(xué)及生物技術(shù)配置方面以及在用以(例如)結(jié)晶蛋白質(zhì)以確定其三維結(jié)構(gòu)的基 礎(chǔ)研究配置.方面十分重要。另外難以大量獲得的蛋白質(zhì)可能會(huì)在宿主細(xì)胞中超表達(dá)且 隨后分離并純化之。細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)已成為一種重組蛋白表達(dá)及純化的方法。然而，許多真核多肽及(尤 其是)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生令人失望及不滿意的結(jié)果，這 是因?yàn)樗鏊拗骷?xì)胞的條件及環(huán)境不利于矯正所述真核蛋白的折疊及修飾。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)可為某些真核蛋白的產(chǎn)生提供某些優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)樗鼋湍妇?達(dá)系統(tǒng)具有分泌途徑并能夠?qū)嵤┠承┦芟薜霓D(zhuǎn)譯后修飾。然而，酵母菌系統(tǒng)通常會(huì)導(dǎo)致二硫鍵鏈接的蛋白質(zhì)不適當(dāng)?shù)卣郫B并可產(chǎn)生低糖基化。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在蛋白質(zhì)的產(chǎn)生中的使用具有如下重要的優(yōu)點(diǎn)提供適度的蛋白質(zhì) 折疊以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)譯后修飾，例如，糖基化。然而，許多哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)不可產(chǎn)生 大量的期望蛋白質(zhì)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及肝素、肝素樣分子或纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)促效劑在增加哺 乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的用途。本發(fā)明還涉及組成型活性FGFR或其下游效 應(yīng)子在刺激哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的用途。一方面，本發(fā)明提供具有改良蛋白質(zhì)產(chǎn)率的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。這些表達(dá)系統(tǒng)包 括在含有有效量肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基因工程哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。所述基因工程宿主細(xì)胞各自包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒。肝素或硫酸肝素 葡糖胺聚糖在培養(yǎng)基中的存在可大大地增加所述相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。本發(fā)明所用肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的數(shù)量可為任一有效地促進(jìn)培養(yǎng)宿主細(xì) 胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所用培養(yǎng)基包括自約1至約1,000微 克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明所用培養(yǎng)基包括自約 10至約200微克/亳升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖(例如，約IO、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、或100微克/毫升)。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明所用培養(yǎng)基是用于增加培養(yǎng)宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的不含 血清培養(yǎng)基，其包含有效量的纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF-2)或其它FGF與肝素或硫 酸肝素葡糖胺聚糖的組合。在許多實(shí)例中，所述培養(yǎng)基包括但不限于自約10至約500 納克/毫升的FGF-2 (例如，約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400或500納克/毫升)。在另一方面中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)包括在含有有效量FGFR-1活化劑的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些基因工程細(xì)胞各自包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì) 的重組表達(dá)盒。FGFR-1活化劑在所述培養(yǎng)基中的存在可顯著地增加相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn) 率。適用于本發(fā)明的FGFR-1活化劑的實(shí)例包括但不限于FGF、肝素、硫酸肝素葡糖 胺聚糖、或其它肝素樣分子。也可以使用能夠活化其它FGFR的藥劑。在一個(gè)實(shí)施例 中，本發(fā)明所用FGFR-1活化劑包括肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖及FGF-2 二者。在再一方面中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)包括基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其各自 包含一個(gè)或多個(gè)編碼FGFR-1-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型活性組份及相關(guān)蛋白質(zhì)的 重組表達(dá)盒。在一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)GFR-1-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型活性組份是組成 型活性FGFR-1蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及P-木糖苷或其它葡糖胺聚糖生物合成誘導(dǎo)劑在改良哺乳動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的使用。適用于此目的的(3-木糖苷的非限制性實(shí)例包括4-甲基傘形酮 基-卩-D-木糖苷、p-硝基苯基-(3-D-木糖苷及芐基-p-D-木糖苷。在一個(gè)實(shí)例中，哺乳動(dòng)物 宿主細(xì)胞是在包含自約50或約100微克/毫升的4-甲基傘形酮基-(3-D-木糖苷的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)。p-木糖苷的使用可大大地增加哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)率。使用本發(fā)明的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生任何相關(guān)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的非限制性 實(shí)例包括胰島素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素蛋白、促濾泡激素、干擾素、 白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、集落刺激因子、凝血因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、甲 狀旁腺激素、骨形成蛋白、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落剌激因子、粒細(xì)胞-巨噬 細(xì)胞集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白質(zhì)C、分泌型巻曲基因 相關(guān)蛋白、選擇蛋白、抗體、或病毒蛋白。這些蛋白質(zhì)可為分泌、胞質(zhì)、或膜結(jié)合蛋 白質(zhì)。其可用于治療、預(yù)防、診斷或其它醫(yī)療目的。在許多實(shí)例中，本發(fā)明所產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)不能夠與細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以引發(fā)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)在 化。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含由本發(fā)明哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物。 另外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)的方法。 一方面，本發(fā)明的方法包括在培 養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中每個(gè)宿主細(xì)胞包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒， 且所述培養(yǎng)基含有有效量的肝素、硫酸肝素葡糖胺聚糖、或FGFR-1活化劑以增加所
述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)；并自所述宿主細(xì)胞或所述培養(yǎng)基分離所述相關(guān)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)盒是由瞬時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體攜帶。在 將所述表達(dá)載體瞬時(shí)導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中后至少24小時(shí)，向培養(yǎng)基中添加肝素或硫酸 肝素葡糖胺聚糖。在另一實(shí)施例中，在將所述表達(dá)載體瞬時(shí)導(dǎo)入所述宿主細(xì)胞中后至 少48小時(shí)，向培養(yǎng)基中添加肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。在另一方面中，本發(fā)明的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中每個(gè) 宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)盒，其編碼相關(guān)蛋白質(zhì)及FGFR-l-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑的組成型活性組份；表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)及宿主細(xì)胞的組份；并自所述宿主細(xì)胞或所 述培養(yǎng)基分離所述相關(guān)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述組成型活性組份是組成型活性FGFR-1蛋白質(zhì)。在許多情 況下，使用本發(fā)明方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不能夠與細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以 引發(fā)這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)在化。本發(fā)明的其它特征、目標(biāo)及優(yōu)點(diǎn)在下列具體實(shí)施方式
中明示。然而，應(yīng)了解，所 述具體實(shí)施方式
盡管指出本發(fā)明的較佳實(shí)施例，但僅出于說明目的而非限制本發(fā)明。 屬于本發(fā)明范圍的各種變化形式及修飾形式為那些熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者根據(jù)具體實(shí)施方式
所知。


附圖僅出于說明目的而非限制本發(fā)明提供。 圖1繪示本發(fā)明所用表達(dá)載體的限制酶切譜圖。 圖2闡明肝素對(duì)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的增進(jìn)作用。 圖3表明用于增加培養(yǎng)HEK293-EBNA細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的最佳肝素濃度是約25 微克/毫升。圖4顯示肝素可增加分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白質(zhì)1 (sFRP-l)在穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系中的生產(chǎn)。圖5是一闡明肝素不會(huì)增加sFRP-l mRNA水平的北方印跡圖。 圖6是一表明肝素對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的刺激作用的西方印跡圖。 圖7表明在沒有肝素時(shí)純化sFRP-l具有活性并穩(wěn)定。圖片A是來自傳染293細(xì) 胞條件培養(yǎng)基的一對(duì)蛋白質(zhì)在經(jīng)過Nickel NTA管柱之后的洗脫特征曲線。使用尺寸排 除型管柱Superdex 200進(jìn)一步純化經(jīng)鎳純化的材料。圖片B是純化sFRP-l-his6的考馬 斯藍(lán)(Coomassieblue)沾染凝膠。借助SDS-PAGE在還原(泳道1和3)或非還原(泳道 2和4)條件下分析經(jīng)過Nickel NTA或S叩erdex 200后的蛋白質(zhì)試樣。圖片C代表使用 經(jīng)TCF-熒光素酶轉(zhuǎn)染的U20S細(xì)胞的純化sFRP-l的Wnt- 3拮抗活性熒光素酶分析。 圖8是一表明肝素可刺激缺乏糖基化的CHO細(xì)胞系Lec.3.2.8.1中產(chǎn)生sFRP-l的 西方印跡圖。在DNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)用50微克/毫升肝素對(duì)經(jīng)sFRP-l轉(zhuǎn)染的Lec.3.2.8.1
細(xì)胞進(jìn)行模擬處理或處理。在不同的時(shí)間點(diǎn)收集條件培養(yǎng)基并借助抗-his4抗體的免疫 印跡進(jìn)行分析。圖9是一闡明經(jīng)修飾肝素的作用的西方印跡圖。經(jīng)sFRP-l-轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞未受 到處理(-)或用肝素、N-脫硫酸化肝素、N-乙?；嗡?dN-肝素)、或2-0-脫硫酸化肝素 (dO-肝素)(所有均以50微克/毫升)培育72小時(shí)。還可用指定濃度的4-甲基傘形酮 基7-(3-D-木糖苷(Xyloside)處理所述細(xì)胞。收集培養(yǎng)基試樣并借助抗-his4抗體的免疫印 跡進(jìn)行分析。圖10表明纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 (FGF-2)可大大地改善肝素在不含血清培養(yǎng)基中 的作用。圖11顯示阻斷纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1 (FGFR-1)可顯著地削弱肝素增進(jìn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的作用。圖12是一闡明肝素在HEK293瞬時(shí)表達(dá)中可增進(jìn)人類基質(zhì)金屬蛋白酶23 (MMP-23)生產(chǎn)的西方印跡圖。圖13是一闡明肝素在HEK293瞬時(shí)表達(dá)中可增進(jìn)人類Dickk叩f-l (DKK-1)生產(chǎn)的 西方印跡圖。 '具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及具有改良產(chǎn)率的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其用于產(chǎn)生分泌、胞質(zhì)、或膜結(jié) 合蛋白質(zhì)。 一方面，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)包括在含有有效量肝素或肝素樣分子的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)的基因工程哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。每個(gè)基因工程哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包含編碼相關(guān) 蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒。肝素或肝素樣分子在培養(yǎng)基中的存在可大大地增加相關(guān)蛋白質(zhì) 的產(chǎn)率。另一方面，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)采用包含一個(gè)或多個(gè)編碼相關(guān)蛋白質(zhì)及組成型 活性FGFR-1或FGFR-1效應(yīng)子的重組表達(dá)盒的基因工程哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。.與 FGFR-1或其效應(yīng)子的共表達(dá)可大大地改善所述相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。本發(fā)明的各個(gè)方面更具體地闡述于下列分段中。分段的使用并非欲限制本發(fā)明。 每個(gè)分段均可應(yīng)用于本發(fā)明的任何方面。A. 見鼓微基像工賺離動(dòng)辦主潘應(yīng)產(chǎn)f激肅娜鄉(xiāng)肝素可用于增進(jìn)基因工程哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。肝素是一種硫酸化葡糖 胺聚糖的非均相混合物。存于肝素中的主要糖單元包括a-L-艾杜糖醛酸2-硫酸、2-脫 氧-2-磺胺基-a-D-葡萄糖6-硫酸、a-D-葡糖醛酸、2-乙酰胺基-2-脫氧-(x-D-葡萄糖、及oc-L-艾杜糖醛酸。這些糖是由糖苷鍵連接在一起，形成各種尺寸的聚合物。許多肝素分子 包含大量的二糖單元IdoA(2-OS03)-GlcNS03(6-OS03)，產(chǎn)生經(jīng)深度O-硫酸化的多糖， 其中艾杜糖醛酸(IdoA)與葡糖醛酸(GlcA)的比例較高。由于其高酸性硫酸基團(tuán)，肝素通 常在生理pH下會(huì)以陰離子形式存在。本發(fā)明涵蓋任一類別肝素的使用，所述肝素包括但不限于未經(jīng)精制的肝素、經(jīng)精
制的肝素、或低分子量的肝素(LMWH)。未經(jīng)精制肝素的分子量可介于(但不限于) 自約3,000至約40,000 Da，其中平均分子量是約15,000 Da (大約40-50個(gè)單糖單元)。 許多市售肝素制劑的平均分子量是介于約12,000至約15,000 Da之間。未經(jīng)精制的肝 素可自各種脊椎動(dòng)物組織(例如，豬腸粘膜、牛腸組織、或牛肺組織)制備。制備過 程通常會(huì)涉及對(duì)所述組織進(jìn)行蛋白水解處理，隨后實(shí)施萃取并與離子配對(duì)試劑復(fù)合。 可對(duì)未經(jīng)精制的粗制肝素進(jìn)一步實(shí)施分級(jí)沉淀、純化或化學(xué)處理以產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別 或醫(yī)藥上可接受的肝素。
通常借助化學(xué)水解或酶水解自未經(jīng)精制的肝素制備LMWH。許多市售LMWH制 劑的分子量可介于(例如)約2,000至9,000 Da之間，其中平均分子量為約4,000至 5,000 Da。
并非將本發(fā)明限制于任一個(gè)理論或作用模式，肝素可調(diào)節(jié)FGF(例如，F(xiàn)GF-2)與 FGFR (例如，F(xiàn)GFR-1)之間的相互作用，進(jìn)而活化或有助于活化FGFR并且刺激一系 列下游信號(hào)而使得蛋白質(zhì)合成及/或分泌增加。肝素單獨(dú)也可以活化FGFR。
另外，肝素可與其它生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、或趨化因子結(jié)合。這些生長(zhǎng)因子、細(xì) 胞因子、或趨化因子的非限制性實(shí)例包括血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子(VEGF)、多效生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子(P1GF)、血小板因子-4 (PF-4)、肝素結(jié)合EGF-樣生長(zhǎng)因子白細(xì)胞介素-8 (IL-8)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1 (MIP-1)、 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p(TGF-p)、干擾素-g-誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)、干擾素-Y(IFN-力、及HIV-Tat 反式活化因子。肝素與這些因子或其受體間的相互作用還可促進(jìn)培養(yǎng)宿主細(xì)胞合成蛋 白質(zhì)。
已經(jīng)使用不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯繉?duì)負(fù)責(zé)其與FGF和FGFR之間相互作用的肝素的結(jié)構(gòu) 要求。所述結(jié)果表明尺寸及硫酸化程度對(duì)于肝素引發(fā)FGF-2-FGFR相互作用的能力而 言十分重要。參見，例如，Ishihara等人(1993) J. Biol. Chem. 268:4675-4683; Tyrrell 等人(1993) J. Biol. Chem. 268:4684-4689; Guimond等人(1993) J. Biol. Chem. 268:23906-23914; Avezier等人(1994) J. Biol. Chem. 269:114-121;及Walker等人(1994) J. Biol. Chem. 269:931-935。人們已經(jīng)確定存于肝素或硫酸肝素中的最小FGF-2-結(jié)合序 列是一種五糖，其含有二糖單元 IdoA(2-OS03)-GlcNS03 或 IdoA(2-OS03)-GlcNS03(6-OS03)。參見，例如，Maccarana等人(1993) J. Biol. Chem. 268:23898-23905。源自肝素的經(jīng)深度硫酸化八糖或十糖片段還顯示可介導(dǎo)FGF與其受 體之間的相互作用。參見，例如，Klagsbrun等人(1991) Cell 67:229-231及Ishihara等 人(見上文)。另外，肝素源四糖至八糖已經(jīng)顯示可與FGF-2結(jié)合但在刺激細(xì)胞增生 方面不如肝素源十糖及更長(zhǎng)寡糖有效。參見Delehedde等人(2002) Biochem. J. 365:235-244。涉及經(jīng)化學(xué)修飾肝素或硫酸肝素制劑的結(jié)合研究表明2-0-及N-硫酸基團(tuán) 對(duì)于肝素/硫酸肝素與FGF-2之間的相互作用而言十分重要。另外，人們認(rèn)為肝素需要 2-0-及N-硫酸基團(tuán)以及6-0-硫酸基團(tuán)以促進(jìn)FGF-2與FGFR-1結(jié)合。參見，例如， Guimond等人，見上文。 已經(jīng)試驗(yàn)性地確定了 FGF上的肝素結(jié)合區(qū)存于所述蛋白質(zhì)的NH2末端和COOH 末端中，其中堿性胺基酸殘基可與肝素的硫酸基團(tuán)相互作用。除了可促進(jìn)肝素 -FGF-FGFR復(fù)合物形成之外，與肝素的締合還可穩(wěn)定FGF并保護(hù)其免受蛋白酶降解。 另夕卜，F(xiàn)GFs (例如，F(xiàn)GF-2)可在與不參與任一FGFR相互作用的細(xì)胞表面硫酸肝素直 接結(jié)合后受到內(nèi)在化。由此可推斷存于HS-FGF復(fù)合物中的HS可用作將FGF轉(zhuǎn)運(yùn) 到細(xì)胞核的穿梭體。
本發(fā)明所用培養(yǎng)基可包含有效地促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的任一量肝素。由于酸 性硫酸基團(tuán)，肝素鹽通?？捎糜诩?xì)胞培養(yǎng)物。適宜肝素鹽的非限制性實(shí)例包括肝素鈉 鹽、肝素鈣鹽、或肝素鋰鹽。培養(yǎng)基中肝素的濃度可介于(例如)1微克/毫升至1，000 微克/毫升、5微克/毫升至500微克/毫升、10微克/毫升至200微克/毫升、15微克/毫 升至100微克/毫升、或20微克/毫升至30微克/毫升之間。在一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)基 中肝素的濃度是約IO、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50微克/毫升。本發(fā)明所用肝 素可為任一類別，例如，未經(jīng)精制的肝素、經(jīng)精制的肝素、或LMWH。
許多類別的培養(yǎng)基可用于本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所用培養(yǎng)基包括補(bǔ)充 有胎牛血清及有效量肝素或肝素樣分子(例如，硫酸肝素葡糖胺聚糖)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 在許多實(shí)例中，所述培養(yǎng)基包含至少0.5%、 1%、 5%、或10%的胎牛血清。也可使用 其它動(dòng)物血清或組織提取物。適宜基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于MEM、 MEM-a、 DMEM、 RPMI、 ISCOVE、 HamF12、 HAMFIO、 M199、 L15、 6M、 IMEM、 RPMI-1640、 NCTC109、 Fischer培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基、Williams培養(yǎng)基、Madin-Darby牛腎培 養(yǎng)基、Madin-Darby犬腎培養(yǎng)基、或其混合物。按照宿主細(xì)胞的需要，這些基礎(chǔ)培養(yǎng) 基可富含諸如下列等額外營(yíng)養(yǎng)因子例如，糖(例如，葡萄糖)、胺基酸(例如，谷胺酰 胺)、非必需氨基酸的混合劑、必需氨基酸的混合劑、肽、酸性鹽(例如，丙酮酸鈉)、 EDTA鹽、擰檬酸衍生物、醇(例如，乙醇)、氨基醇(例如，乙醇胺)、維他命(例如，維 他命C或維他命E)、抗氧化劑(例如，谷胱甘肽或硒)、具有飽和鏈或不飽和鏈的脂肪 酸(例如，亞油酸、花生四烯酸、油酸、硬脂酸、或棕櫚酸)、脂質(zhì)、脂肽、或磷脂(例 如，卵磷脂)。諸如那些基于HEPES或碳酸氫鹽者等緩沖溶液可用于某些脆性細(xì)胞培 養(yǎng)物或用于產(chǎn)生大量CC)2的培養(yǎng)物。在許多情形中，需注意確保培養(yǎng)基的pH對(duì)于細(xì) 胞生長(zhǎng)或蛋白質(zhì)生產(chǎn)而言保持最佳(例如，介于6與8之間，介于7與8之間，或介于 7.2與7.5之間)且所述培養(yǎng)基保持等滲。
本發(fā)明還涉及不含血清或化學(xué)成份明確的培養(yǎng)基的使用。.在一個(gè)實(shí)施例中，本 發(fā)明所用不含血清的培養(yǎng)基包括有效量的肝素或肝素樣分子及有效量的FGF。所用 FGF的濃度可介于(例如)1納克至1,000納克、10納克至100納克、或25納克至 75納克之間。FGF家族包含至少23個(gè)不同的成員。這些蛋白質(zhì)具有寬廣的促有絲分 裂活性及細(xì)胞存活活性并參與多個(gè)生物過程，包括胚發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、組 織修復(fù)、腫瘤生長(zhǎng)及侵染。相同種族的不同F(xiàn)GF成員的序列同源性相對(duì)較低。然而， FGF具有相當(dāng)大的種族交叉反應(yīng)性。
在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)GF-2與肝素或肝素樣分子組合使用以刺激哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，所用肝素或肝素樣分子的濃度是介于5微克/毫升至200 微克/毫升之間(例如，約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、或200 微克/毫升)且所用FGF-2的濃度是介于10納克/毫升至500納克/毫升之間(例如，約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400、或500納克/毫升)。據(jù)報(bào) 道，F(xiàn)GF-2可結(jié)合各種FGF受體，包括但不限于FGFR-1、 FGFR-2、 FGFR-3、 FGFR-4 及FGFR-5。還報(bào)道肝素或肝素樣分子并非為FGF-2信號(hào)傳導(dǎo)絕對(duì)必需但這些分子 與在其不存在時(shí)相比可在更低FGF-2濃度下促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)。參見Padem等人，F(xiàn)ASEB J., 13:1677-1687 (1999)。
本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋FGF-2的生物活性片段或變體在促進(jìn)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生 蛋白質(zhì)方面的使用。這些生物活性片段或變體保留至少實(shí)質(zhì)部分的初始FGF-2蛋白質(zhì) 的蛋白質(zhì)生產(chǎn)增進(jìn)活性。這些片段或變體可為自然存在的或經(jīng)故意改造的。可通過氨 基酸取代、刪除、插入或其它修飾來容易地制備期望FGF-2片段或變體。使用下文所 述實(shí)例中所述方法可容易地評(píng)定此片段或變體與肝素或肝素樣分子組合使用時(shí)的蛋白 質(zhì)生產(chǎn)增進(jìn)活性。
適用于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于缺乏硫酸肝素葡糖胺聚糖 (HSGAG)合成的細(xì)胞或具有低水平的細(xì)胞表面HSGAG的細(xì)胞。適宜哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞的非限制性實(shí)例HEK293-FT (Invitrogen R700-07) 、 HEK293-EBNA (Invitrogen R62007)、 CHO pgsA-745 (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心或ATCC)、 CHO pgsB-650 (ATCC)、 CHO pgsD-677 (ATCC)、 CHO pgsB-618 (ATCC)、及其它缺少硫酸肝素的CHO突變細(xì) 胞，例如那些闡述于Lidholt等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 89:2267-2271 (1992) 中者，所述文獻(xiàn)的全文以引用方式并入本文中。也可使用其它哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，例 如，幼小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、C0S-1細(xì)胞、骨髓瘤NSO細(xì)胞、HKB細(xì)胞、 CV-1細(xì)胞、C127細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero cell)、 Sp-2細(xì)胞、Madin-Darby腎細(xì) 胞、Madin-Darby犬腎細(xì)胞、及其它可自ATCC或其它商業(yè)來源獲得的細(xì)胞系。另外， 本發(fā)明涵蓋原代細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物、或轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在產(chǎn)生相 關(guān)蛋白質(zhì)方面的使用?？赏ㄟ^靜脈注射、皮下注射或其它適宜途徑將肝素或肝素樣分 子遞送給轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)例中，可使用植入體或?qū)Ч軐⒏嗡鼗蚋嗡貥臃肿?遞送給特定組織位點(diǎn)。
另外，本發(fā)明涉及雜合體或融合細(xì)胞在產(chǎn)生相關(guān)蛋白質(zhì)方面的用途?？山柚诤?一哺乳動(dòng)物細(xì)胞與一癌細(xì)胞/永生細(xì)胞(例如，骨髓瘤細(xì)胞或胚細(xì)胞瘤)來形成雜合體細(xì) 胞。適用于此目的的方法包括但不限于電融合及化學(xué)融合(例如，聚乙二醇融合)。所 述哺乳動(dòng)物細(xì)胞及所述癌細(xì)胞/永生細(xì)胞可源自相同或不同的種族。在許多實(shí)施例中， 所述癌細(xì)胞/永生細(xì)胞對(duì)一種或多種選擇藥劑敏感。例如，所述癌細(xì)胞/永生細(xì)胞可能會(huì) 對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基(其稱作"HAT培養(yǎng)基")
敏感。所述HAT敏感性癌細(xì)胞/永生細(xì)胞可與對(duì)HAT培養(yǎng)基不敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融 合。針對(duì)可殺死未經(jīng)融合細(xì)胞的HAT選擇雜合體細(xì)胞。隨后篩選具有期望特征的融合 細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所用雜合體細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞，其產(chǎn)生相關(guān)單克隆抗體。 在含有有效量肝素或肝素樣分子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞可大大地增加所述單 克隆抗體的產(chǎn)率。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明所用雜合體細(xì)胞包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重 組表達(dá)盒。可在融合事件之前或之后將重組表達(dá)盒導(dǎo)入雜合體細(xì)胞中。在許多情形中， 用于制備雜合體細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或癌細(xì)胞/永生細(xì)胞缺乏HSGAG合成或具有低水 平的細(xì)胞表面HSGAG。
本發(fā)明所用每個(gè)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(包括雜合體細(xì)胞)包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組 表達(dá)盒。所述重組表達(dá)盒通常包含以可操作方式鏈接到表達(dá)控制序列的蛋白質(zhì)編碼序 列。編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼序列可為任一類別，例如，基因組序列、cDNA、 或其組合。用于指導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的適宜表達(dá)控制序列的選擇是屬于普通技術(shù)人員 所知領(lǐng)域的例行設(shè)計(jì)問題。適宜表達(dá)控制序列的非限制性實(shí)例包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、 Kozak序列、聚腺苷酸化序列、或其它轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯調(diào)控序列。這些序列中的許多闡述于 文獻(xiàn)中并可通過供應(yīng)商獲得。重組表達(dá)盒中所用啟動(dòng)子可為組成型或誘導(dǎo)型。
可通過各種方法將重組表達(dá)盒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，通過 轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)將包含所述重組表達(dá)盒的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。示例性轉(zhuǎn)染技 術(shù)包括但不限于磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的、 及電穿孔。轉(zhuǎn)導(dǎo)通常是受重組病毒載體介導(dǎo)。適用于此目的的病毒載體的非限制性實(shí) 例包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、阿爾法病毒、星狀病 毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、小核糖核酸病毒、痘 病毒、或披膜病毒載體。經(jīng)脂質(zhì)體包裹的表達(dá)載體也可用于將重組表達(dá)盒導(dǎo)入哺乳動(dòng) 物宿主細(xì)胞中?？梢运矔r(shí)或穩(wěn)定的方式將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。在許多情形中， 所用表達(dá)載體包含可選擇經(jīng)所述載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞的可選標(biāo)記。適宜可選標(biāo) 記的非限制性實(shí)例包括新霉素(G418)、潮霉素、嘌呤霉素、zeocin、秋水仙堿(colchine)、 氨甲蝶呤、及甲硫氨酸磺酰亞胺。
也可通過修飾所述細(xì)胞的內(nèi)源基因來將重組表達(dá)盒并入宿主細(xì)胞中。所述內(nèi)源基 因編碼相關(guān)蛋白質(zhì)?？蓪?duì)所述內(nèi)源基因的任一部分進(jìn)行修飾以實(shí)現(xiàn)期望表達(dá)或調(diào)控作 用。例如，可用病毒啟動(dòng)子代替內(nèi)源基因的啟動(dòng)子以增加所述基因在所述宿主細(xì)胞中 的表達(dá)水平。
按照本發(fā)明可產(chǎn)生任一相關(guān)蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括治療用、預(yù) 防用、或診斷用蛋白質(zhì)，例如，激素、生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、干擾素、 集落刺激因子、血液因子、抗體、疫苗、膠原、纖維蛋白原、人體血清白蛋白、組織 纖維蛋白溶酶原活化劑、抗凝劑、或用于先天性疾病的替代酶。這些蛋白質(zhì)的具體實(shí) 例包括但不限于胰島素、人體生長(zhǎng)激素、紅細(xì)胞生成素、人體促濾泡激素、絨毛膜促
性腺素、黃體生成激素、骨形成蛋白2、甲狀旁腺激素、(X干擾素、P干擾素、Y干擾 素、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-l拮抗劑、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介 素-11、白細(xì)胞介素-12、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、人體粒細(xì)胞集 落刺激因子、人體粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、奈西立肽(nesiritide)、抗-凝血酶 III、凝血因子IX、凝血因子VIII、凝血因子VIIa、鏈激酶、尿激酶、葡糖腦苷脂酶、 a-D-半乳糖苷酶、(xL-艾杜糖醛酸苷酶、a-l,4-葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶、腺苷脫氨酶、脫氧核糖核酸酶、阿替普酶(alteplase)、髓鞘堿性蛋白、 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸羥化酶、多巴脫羧酶、高血糖素、單克隆抗 體靶向白細(xì)胞受體(例如，a4整合素拮抗劑、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、CD2拮抗劑、CD3 拮抗劑、CD4拮抗劑、CD20拮抗劑、CD22拮抗劑、CD33拮抗劑、及CD52拮抗劑)、 單克隆抗體靶向細(xì)胞因子(例如，趨化因子拮抗劑、IL-2拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-5拮 抗劑、IL-6拮抗劑、IL-12拮抗劑、選擇蛋白拮抗劑、及TNF-a拮抗劑)、單克隆抗體 靶向癌細(xì)胞標(biāo)記或受體(例如，表皮生長(zhǎng)因子拮抗劑、人體表皮生長(zhǎng)因子受體2拮抗劑、 MUC-1拮抗劑、及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子拮抗劑)、及其它單克隆抗體(例如，補(bǔ)體拮抗劑、 C5抑制劑、糖蛋白IIb/IIIa拮抗劑、IgE拮抗劑、及呼吸道合胞病毒F-蛋白拮抗劑)。
按照本發(fā)明還可產(chǎn)生其它類別的抗體或抗體片段。這些抗體或抗體片段的實(shí)例包 括但不限于人源化抗體、人體抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜 合體抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、非特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、 Fv、 scFv、 Fd、或dAb。借助體外顯示技術(shù)或進(jìn)化策略所選高親和性粘結(jié)體也可按照 本發(fā)明來產(chǎn)生。這些高親和性粘結(jié)體包括但不限于肽、抗體、或抗體模擬物，例如， 那些闡述于Binz等人(2004) Nat. Biotechnol. 22:575-582或Lipovsek等人(2004) L Immunol. Methods 290:51-67中者。
按照本發(fā)明可產(chǎn)生的其它相關(guān)蛋白質(zhì)包括但不限于激酶、磷酸酶、G蛋白偶合受 體、生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、細(xì)胞表面抗體(膜結(jié)合免疫球蛋白)、 BMP/GDF-受體、'神經(jīng)元受體、離子通道、蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子、聚合酶、凝血酶原、 凝血酶、a-l抗胰蛋白酶、阿糖腦苷酶、伊米苷酶(imiglucerase)、血小板生成素、a-l 蛋白酶抑制劑、降鈣素、依降鈣素(elcatonin)、戈舍瑞林(goserdin)、那法瑞林 (nafarelin)、布舍瑞林(buserelin)、前胰島素、胰島素類似物、糊精、C-肽、生長(zhǎng)抑 素、奧曲肽(octreotide)、血管升壓素、促胰島素、人體蛋白質(zhì)C、囊性纖維化跨膜傳 導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白(例如， sFRP-l至5)、或選擇蛋白(例如，選擇蛋白P、選擇蛋白E、或選擇蛋白L)。
本發(fā)明還涉及病毒蛋白或其免疫原性片段的生產(chǎn)。這些病毒蛋白或片段可用于制 備用于消除針對(duì)相應(yīng)病毒的免疫保護(hù)性反應(yīng)的疫苗。這些病毒蛋白的非限制性實(shí)例包 括如下蛋白質(zhì)人體免疫缺陷病毒(例如，HIV-1及HIV-2)、流感病毒(例如，A、 B 及C型流感病毒)、冠狀病毒(例如，人體呼吸道冠狀病毒)、肝炎病毒(例如，A型至 G型肝炎病毒)、或皰疹病毒(例如，HSVl-9)。還可產(chǎn)生其它病毒蛋白質(zhì)。rabies viru
這些病毒包括但不限于肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、沙粒病毒、淋巴 細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、靜脈病毒(phlebovirus)、漢坦病毒(hantavirus)、環(huán)曲病 毒(torovirus)、類埃博拉病毒(Ebola-like virus)、丙型肝炎病毒、黃病毒、單純病毒、 水痘病毒、巨細(xì)胞病毒、玫瑰疹病毒、淋巴隱病毒、索戈托病毒(thogotovims)、正痘 病毒(orthopoxvirus)、賈恩禾斗痘病毒(avipoxviras)、粘液瘤亞群病毒(leporipoxvirus)、 慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)、狂犬病病毒屬(lyssavirus )、諾拉彈狀病毒 (novirhabdovirus)、 zK泡性病毒(vesiculovirus)、阿爾 去病毒、bubivirus、鼻病毒、 口蹄疫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、假狂犬病病毒、牛皰疹病毒、副粘病毒、新城疫病毒、 呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、輪狀病毒、胃腸 炎病毒、蜱傳腦炎病毒、黃熱病病毒、風(fēng)疹病毒、豬瘟病毒、或狂犬病病毒。由本發(fā)明產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)可為(但不限于)分泌蛋白、胞質(zhì)蛋白、或膜結(jié)合蛋 白。相關(guān)蛋白質(zhì)的序列可為天然存在序列或基因工程序列。在一個(gè)實(shí)施例中，相關(guān)蛋 白質(zhì)是包含多肽標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)，所述多肽標(biāo)簽有利于所述相關(guān)蛋白質(zhì)的分離、純 化、檢測(cè)、固定化、穩(wěn)定化、折疊、或靶向。適宜多肽標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括鏈霉 抗生素標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、多組氨酸標(biāo)簽'、流感HA標(biāo)簽、VSV糖蛋白 標(biāo)簽、V5標(biāo)簽、單純皰疹病毒標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、或Fc片段。在某些情形中， 可借助所選蛋白酶自所述相關(guān)蛋白質(zhì)解離所述多肽標(biāo)簽。在另一實(shí)施例中，相關(guān)蛋白質(zhì)包含有利于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞分泌所述蛋白質(zhì)的信 號(hào)肽。所述信號(hào)肽可為所述相關(guān)蛋白質(zhì)的內(nèi)源肽或異源肽。信號(hào)肽可與信號(hào)識(shí)別粒子 相互作用并指導(dǎo)核糖體進(jìn)入ER，其中發(fā)生共轉(zhuǎn)譯插入。許多信號(hào)肽因具有帶正電荷的 殘基而具有高疏水性?？山柚盘?hào)肽酶(一種位于ER池表面的蛋白酶)自生長(zhǎng)肽鏈 移除信號(hào)序列。因此，在許多情形中，自培養(yǎng)基分離的分泌蛋白并不具有初始信號(hào)肽。在許多實(shí)施例中，由本發(fā)明產(chǎn)生的分泌蛋白或膜結(jié)合蛋白不會(huì)與細(xì)胞表面 HSGAG結(jié)合或相互作用。此可防止或減少所述蛋白質(zhì)被哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞吸收或內(nèi) 在化。在一個(gè)實(shí)例中，由本發(fā)明產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)不為類肝素酶或其基質(zhì)為硫酸肝素 (HS)的酶?？山柚喾N方法分離或純化由本發(fā)明產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)。適用于蛋白質(zhì)分離/純化 的初始材料的非限制性實(shí)例包括培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物。示例性分離方法包括但不限于 親和層析(包括免疫親和層析)、離子交換型層析、疏水作用層析、尺寸排除層析、HPLC、 蛋白質(zhì)沉淀(包括免疫沉淀)、差示溶解、電泳、離心、結(jié)晶、或其組合。在許多實(shí)施例中，所分離相關(guān)蛋白質(zhì)實(shí)際上不含其它蛋白質(zhì)或雜質(zhì)。舉例而言， 與其它蛋白質(zhì)相比，所分離相關(guān)蛋白質(zhì)的純度可為至少50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%或100%。在一個(gè)實(shí)例中，分離蛋白質(zhì)僅含有微量的會(huì)干擾其預(yù)期用途的雜 質(zhì)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，SDS-PAGE或免疫分析)來檢驗(yàn)或評(píng)定本發(fā)明的分離相 關(guān)蛋白質(zhì)。適用于此目的的免疫分析包括但不限于西方印跡分析、ELISA、 RIA、三明 治型或免疫測(cè)定分析、乳膠或其它粒子凝集、或蛋白質(zhì)體芯片。蛋白質(zhì)測(cè)序及質(zhì)譜分1 析還可用于檢驗(yàn)或分析分離相關(guān)蛋白質(zhì)。而且，本發(fā)明涵蓋肝素或肝素樣分子在增加哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生減毒病毒方面 的作用。這些減毒病毒可用于制備疫苗調(diào)配物。用于此目的的適宜哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 包括但不限于CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、Madin-Darby腎細(xì)胞、或Madin-Darby 犬腎細(xì)胞。應(yīng)用于此目的的肝素或肝素樣分子的數(shù)量可為任一可有效地改善減毒病毒 產(chǎn)率的數(shù)量(例如，自約10微克/毫升至1，000微克/毫升，例如，約10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、或100微克/毫升)。 當(dāng)培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基時(shí)，F(xiàn)GF-2或其它FGFR促效劑還可與肝素或肝素樣分 子組合使用。FGF-2或其它FGF的有效量可介于(但不限于)10納克/毫升至500納 克/毫升之間(例如，約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 200、 300、 400、 或500納克/毫升)。另外，可將FGF添加到含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中以進(jìn)一步改善減 毒病毒或其它相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。S.見,好或?qū)固微縱倫基虹薦喊離動(dòng)激鼓潘應(yīng)產(chǎn)主歪本發(fā)明還涉及肝素樣分子或其它FGFR促效劑在刺激哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白 質(zhì)方面的使用。肝素樣分子的非限制性實(shí)例包括硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)，例如硫酸 肝素葡糖胺聚糖(HSGAG);硫酸化蛋白多糖，例如硫酸肝素蛋白多糖(HSPG);或其片 段。適用于本發(fā)明的其它肝素樣分子包括但不限于肝素寡糖、合成硫酸化聚合物、各 種經(jīng)硫酸化分子、各種經(jīng)磺化分子、合成聚芳香族化合物、通過聚合芳香環(huán)合成的聚 芳香族化合物、或其組合或片段。也可使用如在Casu (1985) Advances in Carbohvdrate Chemistry and Biochemistry 43:51-134中所述的肝素樣分子，所述文獻(xiàn)以引用方式并入 本文中。所有這些肝素樣分子均可刺激哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，缺乏硫酸肝素的哺乳 動(dòng)物宿主細(xì)胞)產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在許多情形中，本發(fā)明所用肝素樣分子經(jīng)高度硫酸化且可 有利于活化培養(yǎng)細(xì)胞中FGFR信號(hào)傳導(dǎo)。已經(jīng)確定有至少四個(gè)不同的FGFR家族成員一即，F(xiàn)GFR-l、 FGFR-2、 FGFR-3及 FGFR-4。各FGFR彼此之間的不同在于其配體親和性及組織分布。代表性全長(zhǎng)FGFR 包含由多個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外區(qū)、單一疏水性跨膜區(qū)段、及細(xì)胞質(zhì)酪氨 酸激酶結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明所用肝素樣分子可活化或有利于活化培養(yǎng)細(xì) 胞中的FGFR-l 。人們認(rèn)為細(xì)胞表面FGFR的活化參與FGF、 FGFR及細(xì)胞表面HSGAG間的相互 作用。人們已經(jīng)建議使用至少3個(gè)不同的模型來解釋FGF及細(xì)胞表面HSGAG是如何 協(xié)作以引導(dǎo)FGFR活化的。在"生長(zhǎng)激素"模型中，單一 FGF可二聚化兩個(gè)FGFR, 其中HSGAG與FGF及FGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在"HS依賴性二聚化"模型中， 所述HS鏈與兩個(gè)FGF結(jié)合且二聚合配體馬上二聚化FGFR。在"二聚體的二聚體" 模型中，F(xiàn)GF及HSGAG的兩個(gè)獨(dú)立復(fù)合體可達(dá)成FGFR 二聚合，進(jìn)而活化其細(xì)胞內(nèi) 激酶結(jié)構(gòu)域。
若干細(xì)胞表面GAG鏈經(jīng)常會(huì)與小蛋白核心連結(jié)以形成HSPG。 HSPG可通過核心 蛋白的疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域或通過共價(jià)鍵結(jié)到所述核心蛋白(跨膜HSPG)的糖基-磷脂酰 肌醇(GPI)錨形體錨定于細(xì)胞表面上?？缒SPG的非限制性實(shí)例包括但不限于磷脂酰 肌醇蛋白聚糖、腦蛋白聚糖(cerebroglycan)、 (3聚糖、基底膜蛋白聚糖、CD44、及共 結(jié)合蛋白聚糖家族的各成員(例如，共結(jié)合蛋白聚糖l、共結(jié)合蛋白聚糖2(纖維蛋白 聚糖)、共結(jié)合蛋白聚糖3(N-共結(jié)合蛋白聚糖)及共結(jié)合蛋白聚糖4(ryudocan)。磷脂酰 肌醇蛋白聚糖及腦蛋白聚糖還可通過共價(jià)GPI錨形體與細(xì)胞膜偶合。另外，HSPG可 通過與細(xì)胞表面大分子(外周膜HSPG)相互作用以非共價(jià)方式與細(xì)胞表面連結(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及可溶性HSGAG或HSPG、或其片段在增進(jìn)培養(yǎng)哺 乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的使用?？赏ㄟ^化學(xué)消化或酶消化固定或較大HSGAG或 HSPG分子來制備可溶性HSGAG或HSPG或其片段。舉例而言，跨膜或GPI錨定HSPG 可通過其核心蛋白的蛋白酶解消化或內(nèi)源磷脂酶作用自細(xì)胞膜釋放。同樣，HSGAG 鏈或片段可通過化學(xué)消化或酶消化多糖骨架來制備?？蓪⒂行Я康目扇苄訦SGAG或 HSPG(或其片段)加入培養(yǎng)基中以刺激培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在許多情形中，所用可溶 性HSGAG或HSPG (或其片段)的數(shù)量等于約10-200微克/毫升的肝素(例如，約10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90或100微克/毫升的肝素)以產(chǎn)生蛋白質(zhì)生產(chǎn)增進(jìn)作 用。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所用可溶性HSGAG或HSPG (或其片段)包含至少一個(gè)二 糖單元IdoA(2-OS03)-GlcNS03或IdoA(2-OS03)-GlcNS03(6-OS03)。在另一實(shí)例中，本 發(fā)明所用所述可溶性HSGAG或HSPG (其片段)包含五糖、八糖或十糖，其含有二糖 單元IdoA(2-OS03)-GlcNS03或IdoA(2-OS03)-GIcNS03(6-OS03)。在又一實(shí)例中，本發(fā) 明所用可溶性HSGAG或HSPG (或其片段)包含復(fù)數(shù)個(gè)二糖單元 IdoA(2-OS03)-GlcNS03或IdoA(2-OS03)-GlcNS03(6-OS03)。除可呈可溶性形式之外，肝素或肝素樣分子還可固定于基質(zhì)上以刺激哺乳動(dòng)物宿 主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，所述基質(zhì)為培養(yǎng)宿主細(xì)胞提供實(shí)體支撐(例如，經(jīng) 肝素-或肝素樣分子涂布的培養(yǎng)板)。另外，可通過增進(jìn)細(xì)胞中HSGAG或HSPG的內(nèi)源性合成來增加哺乳動(dòng)物宿主細(xì) 胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。硫酸肝素鏈的骨架似乎可借助具有葡萄糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶及N-乙?；?萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性的硫酸肝素合酶來合成。所述主鏈可進(jìn)一步經(jīng)一系列磺基轉(zhuǎn)移酶 及碳水化合物修飾酶(包括N-脫乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶、C-5差向異構(gòu)酶、2-0磺基 轉(zhuǎn)移酶、6-0磺基轉(zhuǎn)移酶及3-0磺基轉(zhuǎn)移酶)修飾。因此，通過增加這些酶的表達(dá)或 活性，可增加細(xì)胞表面HSGAG或HSPG進(jìn)而改善細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。為了達(dá)成此目的， 可將編碼以上酶的表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中并使其與相關(guān)蛋白質(zhì)共表達(dá)。C邀成麥活絲FG/^或FGFi 褒應(yīng)f在澇*基茵工程礞晃動(dòng)激薪主潘應(yīng)產(chǎn)主歪組成型活性FGFR或FGFR下游效應(yīng)子可用于促進(jìn)培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋
白質(zhì)。在許多人體癌癥中己經(jīng)觀測(cè)到通過突變、基因融合或其它基因變換產(chǎn)生的組成 型活性FGFR。組成型活性FGFR突變體的實(shí)例包括但不限于具有I型致死性畸胎突 變的FGFR (例如，F(xiàn)GFR1或SEQ ID NO:l的Arg250—Cys突變及FGFR3或SEQ ID NO:2的Arg248—Cys突變)及在激酶結(jié)構(gòu)域的活化環(huán)中具有錯(cuò)義突變的FGFR(例如， FGFR1或SEQ ID NO:l的Lys656—Glu突變及FGFR3或SEQ ID NO:2的Lys650—Glu 突變)。還可使用其它組成型活性FGFR突變體，例如，那些闡述于De Moerlooze等 人(1997) Curr, Opin. Genet. Dev. 7:378-385， Wang等人(2002) Cancer尺es. 62:1898-1903，或Wang等人(2004) Prostate 58:1-12中者，所有這些文獻(xiàn)均以引用的 方式并入本文中。另外，本發(fā)明涵蓋組成型活性嵌合FGFR的使用，例如，那些闡述 于Kudla等人(1998) J. Cell Biol. 142:241-250中者,所述文獻(xiàn)以引用方式并入本文中。 編碼這些組成型活性FGFR的重組表達(dá)盒可容易地構(gòu)建并將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞 中。與此組成型活性FGFR的共表達(dá)可大大地增加相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。本發(fā)明還涉及FGFR下游效應(yīng)子在改善哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的用 途。FGFR效應(yīng)子的非限制性實(shí)例包括Crk (v-crk肉瘤病毒CT10致癌基因同系物)、磷 脂酶C y、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體基質(zhì)2及SHC (含有Src同源性2結(jié)構(gòu)域)轉(zhuǎn)化蛋白。' 所有這些蛋白質(zhì)是SH2-結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，這是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)能夠在其活化期間與 FGFR的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合?？捎糜诒景l(fā)明的其它FGFR效應(yīng)子包括MAPK信號(hào)傳 導(dǎo)途徑中的各種組份，例如GRB2(生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2)、 SOS1 (無七子代同系物 1)、 RRAS2 (相關(guān)RAS病毒(r-ras)致癌基因同系物2)、 RAF1 (v-raf-1鼠科白血病病毒 致癌基因同系物l)、 MAP2K1 (促細(xì)胞分裂原活化的蛋白激酶激酶l)、 MAP2K2(促細(xì) 胞分裂原活化的蛋白激酶激酶2)、 MAPK1 (促細(xì)胞分裂原活化的蛋白激酶1)、 SRF (血 清響應(yīng)因子或c-fos血清響應(yīng)要素-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子)、FOS (v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病毒致 癌基因同系物)、ELK1 (ELK1， ETS致癌基因家族的成員)、ELK4 (ELK4、 ETS-結(jié)構(gòu) 域蛋白或SRF附屬蛋白1)、及c-MYC (v-myc髓細(xì)胞瘤病病毒致癌基因同系物)。類似 于組成型活性FGFR，可容易地構(gòu)建編碼FGFR下游效應(yīng)子的重組表達(dá)盒并將其導(dǎo)入 哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中且使其與相關(guān)蛋白質(zhì)共表達(dá)。。，薪縱覆齢激會(huì)成誘湖本發(fā)明進(jìn)一步涉及(3-木糖苷或其它葡糖胺聚糖(GAG)生物合成誘導(dǎo)劑在改良哺乳 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的用途。硫酸肝素可作為硫酸肝素蛋白多糖的葡糖胺聚糖組 份于體內(nèi)合成。人們已經(jīng)證實(shí)可通過下列開始GAG生物合成將木糖殘基自UDP-Xyl 轉(zhuǎn)移到核心蛋白上絲氨酸殘基的羥基基團(tuán)，然后添加兩個(gè)Gal殘基及一個(gè)GlcA殘基 以形成鏈接四糖GlcApl-3Glapl-3Gaipi-4Xyipi。隨后使用此鏈接四糖合成硫酸肝素。 己有報(bào)道向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加P-木糖苷可延長(zhǎng)GAG鏈。本發(fā)明表明向培養(yǎng)基中添加P-木糖苷可大大地增加培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞產(chǎn)生 的蛋白質(zhì)。適宜P-木糖苷的非限制性實(shí)例包括但不限于4-甲基傘形酮基-(3-D-木糖苷、 p-硝基苯基—(3-D-木糖苷及芐基-卩-D-木糖苷。培養(yǎng)基中(3-木糖苷的濃度可介于(例如)10微克/毫升至500微克/毫升、20微克/毫升至200微克/毫升、或50微克/毫升至100 微克/毫升之間。培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有動(dòng)物血清(例如，1%、 5%、或10%的胎牛血清)， 或不含血清。當(dāng)使用不含血清的培養(yǎng)基時(shí)，可補(bǔ)充FGF-2或其它FGF因子以進(jìn)一步改 善培養(yǎng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的產(chǎn)率。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明所用培養(yǎng)基包含自約20至約 200微克/毫升的4-甲基傘形酮基-P-D-木糖苷。在另一實(shí)例中，所述培養(yǎng)基包含自約 50至約100微克/毫升的4-甲基傘形酮基-p-D-木糖苷。本文所述任一相關(guān)蛋白質(zhì)可由 經(jīng)(3-木糖苷或其它GAG生物合成誘導(dǎo)劑增強(qiáng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。由本發(fā)明產(chǎn)生的治療用或預(yù)防用蛋白質(zhì)可用于制備用于治療或預(yù)防人類疾病的 醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物通常包括治療或預(yù)防有效量的相關(guān)蛋白質(zhì)及藥理學(xué) 上可接受的載劑。本文所用"醫(yī)藥上可接受的載劑"可為任一溶劑、分散介質(zhì)、涂布 劑、抗細(xì)菌劑或抗真菌劑、等滲或吸收延遲劑、或諸如此類。用于醫(yī)藥活性物質(zhì)的此 等介質(zhì)及藥劑的使用為此項(xiàng)技術(shù)所熟知。還可將補(bǔ)充活性成份納入本發(fā)明的醫(yī)藥組合 物中。本發(fā)明醫(yī)藥組合物可通過任一常規(guī)途徑投與，只要目標(biāo)組織能夠通過所述途徑獲 得所述醫(yī)藥組合物。此途徑包括經(jīng)口、鼻、口腔、直腸、陰道、或局部。或者，可通 過正位、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、瘤內(nèi)、周邊、導(dǎo)管插入、或靜脈注射進(jìn)行投藥。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物還可通過以非經(jīng)腸方式或經(jīng)腹膜腔內(nèi)投與。可在適當(dāng)?shù)嘏c表 面活性劑(例如，羥丙基纖維素)混合的水中制備相關(guān)蛋白質(zhì)的溶液。分散液還可在 甘油、液體聚乙二醇、或其混合物中、或在油中制備。在一般儲(chǔ)存及使用條件下，這 些制劑可含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。適合于注射使用的醫(yī)藥形式包括無菌水性溶液或分散液、或用于即時(shí)制備無菌可 注射溶液或分散液的無菌粉劑。在許多情形中，所述醫(yī)藥形式為無菌的且可流動(dòng)達(dá)能 夠方便地注射的程度。所述醫(yī)藥形式在生產(chǎn)及儲(chǔ)存條件下也是穩(wěn)定的且必須防止其受 到諸如細(xì)菌及真菌等微生物的污染作用。適宜醫(yī)藥載劑包括但不限于溶劑或分散介質(zhì)， 其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇、及諸如此類)、 或植物油。通過使用(例如)諸如卵磷脂等涂布層、通過保持所需粒徑(對(duì)于分散劑 而言)或通過使用表面活性劑可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。借助各種抗細(xì)菌劑或抗真菌劑(例 如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞、或諸如此類)可防止微生 物的作用。在許多情形中，其較佳應(yīng)包括等滲劑，例如，糖類或氯化鈉?？勺⑸浣M合 物的延長(zhǎng)吸收可借助延長(zhǎng)吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來達(dá)成。無菌可注射溶液可通過下述來制備將所需量的治療用或預(yù)防用蛋白質(zhì)納入含有 上述各種其它成份(視需要而定)的適宜溶劑中，隨后進(jìn)行無菌過濾。 一般而言，分 散液是通過將各種經(jīng)滅菌活性成份納入含有基本分散介質(zhì)及所需其它成份的無菌媒劑 中來制備。在使用無菌粉末制備無菌可注射溶液的情形中，較佳制備方法為真空干燥
及冷凍干燥技術(shù)，其可產(chǎn)生由活性成份及任何所需附加成份(來自其先前經(jīng)無菌過濾 的溶液)構(gòu)成的粉末。對(duì)于經(jīng)口投藥而言，可將由本發(fā)明產(chǎn)生的治療用或預(yù)防用蛋白質(zhì)與賦形劑一起納 入并以非食入的漱口劑及潔牙劑形式使用。將所需量的治療用或預(yù)防用蛋白質(zhì)納入例 如硼酸鈉溶液(DobdI'S溶液)的適宜溶劑中來制備漱口劑?；蛘?，可將治療用或預(yù)防用 蛋白質(zhì)納入含有硼酸鈉、甘油及碳酸氫鉀的防腐洗劑中。還可將治療用或預(yù)防用蛋白 質(zhì)分散于潔牙劑、凝膠、糊劑、粉劑或漿液中。調(diào)配后，組合物或溶液可以與劑量調(diào)配物相容的方式并以治療或預(yù)防有效量投 與。劑量方案可由主治醫(yī)師根據(jù)諸如下列等各種因素確定蛋白質(zhì)的作用、病狀的位 點(diǎn)、疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡、性別及飲食、任何炎癥的嚴(yán)重程度、投與時(shí)間、 及其它臨床因素。在一個(gè)實(shí)例中，以最小有效劑量幵始全身或注射投藥，且所述劑量 在預(yù)選時(shí)間過程中會(huì)有所增加直至觀測(cè)到正面效應(yīng)。接下來，將遞增劑量限于在考慮 到可能出現(xiàn)的任何副作用時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)增強(qiáng)效應(yīng)的水平?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥程序在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型中確定治療用或預(yù)防用蛋白 質(zhì)的毒性和治療效果。舉例而言，可借助習(xí)知方法確定相關(guān)蛋白質(zhì)的LD50(對(duì)5O呢群 體致死的劑量)及ED50 (對(duì)50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比 即為治療指數(shù)且其可表示為比率LD50/ED50。在許多情形中，選擇可呈現(xiàn)大治療指數(shù) 的治療蛋白質(zhì)。應(yīng)理解上述實(shí)施例及下列實(shí)例是出于說明目的給出而非對(duì)本發(fā)明加以限制。那 些業(yè)內(nèi)人員根據(jù)本說明書可知屬于本發(fā)明范圍的各種變化形式及修改形式。 E ，實(shí)船.潘應(yīng)線娠房A辦,使哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(HEK293-FT、 HEK293-EBNA、 CHO-DUKX及Lec.3.2.8.1)在 具有5% C02的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中于37。C下生長(zhǎng)及維持。在補(bǔ)充有5呢胎牛血清(FBS)的樹 狀293培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。使CHO-DUKX穩(wěn)定細(xì)胞系在含有10% FBS及200 nM氨甲蝶呤(MTX)的a培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在含有10% FBS及100 nM MTX 的a介質(zhì)中培養(yǎng)HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系。在50毫升旋轉(zhuǎn)器或1升旋轉(zhuǎn)器中實(shí)施瞬時(shí)表達(dá)。對(duì)于50毫升培養(yǎng)體積，將25 微克質(zhì)粒DNA與400微克聚乙烯亞胺(PEI， 25kDa，直線型，用HC1中和達(dá)pH 7.0， 1毫克/毫升(Polysciences, Warrington, PA))在2.5毫升不含血清的293培養(yǎng)基中混合。 對(duì)于1升培養(yǎng)體積，將500微克DNA與4毫克PEI在50毫升不含血清的293培養(yǎng)基 中混合。然后將所述混合物與50毫升或1升HEK293細(xì)胞以0.5乂106個(gè)細(xì)胞/毫升的 細(xì)胞密度在旋轉(zhuǎn)器中于具有5% FBS的293培養(yǎng)基中混合。將所述旋轉(zhuǎn)器在37"下培 育同時(shí)使用P2005 Stirrer (Bellco)以170 rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)72-144小時(shí)，然后收獲。兩載體(pSMED2及pSMEDA)用于DNA構(gòu)建體。pSMEDA (—種pSMED2的衍 生物)闡述于圖1中。將OriP元件插入pSMEDA中以便所述載體能夠在含有EBNA-1病毒抗原的細(xì)胞中受到擴(kuò)增。此載體可使HEK293-EBNA細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)增加若干 倍。對(duì)于sFRP-l(分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白l)構(gòu)建體，在一終止密碼子之前，將C端 His6標(biāo)簽及突變VFK312-314LE納入PCR引物中。用Sail及EcoRI消化PCR產(chǎn)物。 將凝膠純化DNA片段亞克隆到pSMED2中(產(chǎn)生pWZ1028)，或亞克隆到pSMEDA中 (產(chǎn)生pWZI049)。為了建立CHO-DUKX sFRP-l穩(wěn)定細(xì)胞系，將構(gòu)建體pWZ1028轉(zhuǎn)染至 CHO-DUKX細(xì)胞中并持續(xù)三周針對(duì)50 nM、 100 nM或200 nM氨甲蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn) 染瘤。在篩選72個(gè)菌落后，分離對(duì)200 nM MTX具有抗性并具有最高表達(dá)水平sFRP-l 的三個(gè)克隆(即，200-10、 200-11及200-12)。還發(fā)現(xiàn)HEK293細(xì)胞對(duì)100 nM及以上濃 度的MTX敏感，但其具有兩個(gè)二氫葉酸還原酶(DHFR)基因拷貝。為了構(gòu)建sFRP-l 的HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系，將pWZ1028轉(zhuǎn)染至HEK293-EBNA中并持續(xù)三周針對(duì)100 nM 或250 nM MTX選擇轉(zhuǎn)染瘤。然后分離兩個(gè)最佳的克隆100-5及100-20。實(shí)#2. 見素潛遂絲鍾產(chǎn)主s麼-7使C端經(jīng)his6標(biāo)記的sFRP-l在如實(shí)例1所述HEK293-FT細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在 DNA轉(zhuǎn)染期間或'之后("轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)時(shí)間"，示于圖2中)向所述細(xì)胞培養(yǎng)基中加入50 微克/毫升肝素(Sigma Chemical公司)。在不同時(shí)間點(diǎn)("生長(zhǎng)時(shí)間"，示于圖2中)收 獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-his4抗體(Qiagen) 以0.2微克/毫升實(shí)施免疫印跡分析(圖2).免疫印跡法是按照Zhong等人(2004) FEBS Lett. 562:111-117中所述實(shí)施。如圖2中所示，肝素大大地增加了轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞產(chǎn) 生的sFRP-l。在DNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)將肝素添加到培養(yǎng)基中時(shí)觀測(cè)到最大增加。在其 它實(shí)驗(yàn)中，觀測(cè)到重組表達(dá)聚集蛋白聚糖酶-1或聚集蛋白聚糖酶-2蛋白質(zhì)沒有出現(xiàn)此 增加(資料未示出)。C端經(jīng)His6標(biāo)記的sFRP-l還在HEK293-EBNA細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在DNA轉(zhuǎn)染 后48小時(shí)時(shí)，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加不同濃度的肝素("微克/毫升肝素"，示于圖3中)。 在DNA轉(zhuǎn)染后120小時(shí)或144小時(shí)時(shí)收獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì) 試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-his4抗體實(shí)施免疫印跡分析(圖3)。圖3顯示用于增進(jìn)蛋白質(zhì) 生產(chǎn)的最佳肝素濃度是約25微克/毫升。除了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞之外，sFRP-l的穩(wěn)定HEK293細(xì)胞系(克隆100-5及100-20)也 可用于評(píng)定肝素對(duì)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的刺激作用。使克隆100-5及100-20細(xì)胞在不同濃度胎 牛血清("FBS"，示于圖4中)存在下生長(zhǎng)。添加50微克/毫升肝素及新鮮培養(yǎng)基。在 肝素處理后72小時(shí)收獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克 隆抗-his4抗體實(shí)施免疫印跡分析(圖4)。肝素大大地增加了克隆100-5及100-20細(xì)胞 產(chǎn)生的sFRP-l。 sFRP-l產(chǎn)生也隨胎牛血清(FBS)濃度增加而增加，此表明FBS包含能 夠剌激哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的因子。借助北方印跡分析研究肝素對(duì)mRNA水平的作用。使用RNAqueous (Ambion)自 293細(xì)胞制備總RNA。借助1.1%瓊脂糖/2%甲醛MOPS凝膠電泳解析10微克RNA,
用8XSSC印跡于Nytran Supercharge膜(Schleicher及Schuell)上并在S(TC下與地高辛 標(biāo)記的DNA探針于DIG easy Hyb溶液(Roche)中雜合過夜。在6(TC下用0.5 X SSC/0.1%SDS及0.2 X SSC/0.1%SDS洗滌(GAPDH)后，將所述膜在Blocking試劑(Roche) 中封阻30分鐘并用磷酸酶標(biāo)記的堿性抗-地高辛抗體(Roche) (30分鐘)及用Tris鹽水 緩沖液/ 0.3% Tween 20探測(cè)。用Supersignal (Pierce)顯示信號(hào)。借助PCR使用地高辛 標(biāo)記的核苷酸(Roche)產(chǎn)生探針。如圖5中所示，肝素沒有增加sFRP-1的mRNA水平， 這是因?yàn)樵诮?jīng)肝素處理細(xì)胞的mRNA數(shù)量與經(jīng)模擬處理細(xì)胞的mRNA數(shù)量之間沒有 明顯的區(qū)別(泳道1對(duì)2、 3對(duì)4、 5對(duì)6)。因此，肝素不影響sFRP-1的DNA轉(zhuǎn)錄或 mRNA穩(wěn)定性。其似乎可影響sFRP-1在其蛋白質(zhì)合成期間的mRNA后過程。為了評(píng)定肝素對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響，使sFRP-l在如上所述HEK293-FT細(xì) 胞中瞬時(shí)表達(dá)。在DNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)添加50微克/毫升肝素。在120小時(shí)或144小 時(shí)時(shí)收獲條件培養(yǎng)基及細(xì)胞沉淀。借助SDS-PAGE分離每一蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克 隆抗-his4抗體實(shí)施免疫印跡分析(圖6)。肝素增加了細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外sFRP-l，此表明 肝素可通過刺激細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成來增進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。另外，沒有觀測(cè) 到分泌sFRP-1的細(xì)胞吸收。'此表明sFRP-1在培養(yǎng)介質(zhì)中的聚集不是HSPG'介導(dǎo)的 胞吞作用受添加到所述介質(zhì)中肝素抑制的結(jié)果。為了查明肝素對(duì)sFRP-1的增進(jìn)作用是否由蛋白質(zhì)穩(wěn)定化引起，對(duì)由HEK293細(xì) 胞產(chǎn)生的sFRP-1實(shí)施純化。如實(shí)例1中所述，借助瞬時(shí)表達(dá)制備1升條件培養(yǎng)基。用 Nickel-NTA (Qiagen)將含有sFRP-l-his6的培養(yǎng)基在4。C下平衡約1小時(shí)。將所述樹脂 以3,000 rpm (SORVALL H-6000A/HBB-6)離心并在連接到HPLC之前填充到管柱 (Pharmacia Biotech)中。在用1M NaCl、 25 mM Tris-HCl pH 7.5及15 mM咪唑充分洗 滌后，用1M NaCl、 25 mM Tris-HCl pH 7.5及200 mM咪唑洗脫sFRP-l-his6蛋白。使 用10K MWCO濃縮器(Vivascience)將所述洗脫液濃縮達(dá)2毫升。使所述試樣再經(jīng)過 Superdex 200尺寸排除型管柱(SEC)管柱(Pharmacia Biotech),存于1M NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5中。所述蛋白質(zhì)在經(jīng)過Nickel-NTA后得到實(shí)質(zhì)純化(圖7A，左平板及 圖7B，泳道1和2)，且其在經(jīng)過Superdex 200后近乎為均質(zhì)(圖7A，右平板及圖7B， 泳道3和4)。通過在280納米下的吸光率測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。在經(jīng)過Nickel-NTA后的蛋白質(zhì)產(chǎn) 率為約2.5毫克/升且在經(jīng)過SEC后的蛋白質(zhì)產(chǎn)率為約1毫克/升。在SEC分析中， sFRP-l-his6作為單體運(yùn)行(圖7A，右平板)，其與作為38 kDa多肽的sFRP-l在非還原 條件下的遷移一致(圖7B，泳道4)。 N端測(cè)序及質(zhì)譜分析證實(shí)了 sFRP-l的身份并顯示 所述蛋白質(zhì)經(jīng)深度糖基化(資料未示出)。當(dāng)在室溫下培育時(shí)，經(jīng)純化sFRP-l蛋白質(zhì)于 不存在肝素時(shí)非常穩(wěn)定(資料未示出)。為了測(cè)定經(jīng)純化sFRP-l蛋白質(zhì)是否具有活性， 量測(cè)sFRP-l的Wnt3拮抗活性。如圖7C中所示，在轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞中，Wnt3可增加 TCF熒光素酶受體基因表達(dá)(Bhat等人(2004)Protein Expr. Purif. 37:327-335)。 Nickd-NTA純化sFRP- 1或SEC純化sFRP-1的添加以劑量依賴方式降低Wnt介導(dǎo)的
響應(yīng)，而緩沖液對(duì)Wnt-介導(dǎo)的TCF-熒光素酶受體活化無影響。這些資料清楚地表明 于不存在肝素時(shí)，純化sFRP-l是穩(wěn)定的且可起作用。還在中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中觀測(cè)到肝素對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的刺激作用。野生型 CHO細(xì)胞可合成內(nèi)源肝素樣分子，硫酸肝素葡糖胺聚糖(HSGAG)。然而，當(dāng)使用30 mM 氯酸鹽(一種硫酸肝素合成抑制劑)將野生型CHO細(xì)胞預(yù)處理48小時(shí)時(shí)，所述細(xì)胞或 變得對(duì)肝素敏感。實(shí)驗(yàn)表明肝素在瞬時(shí)表達(dá)及穩(wěn)定表達(dá)條件下均能夠增進(jìn)經(jīng)氯酸鹽 處理的CHO細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步表征對(duì)用于sFRP-l分泌的肝素的要求，使 用缺少糖基化的CHO細(xì)胞系Lec3.2.8.1，其攜帶4個(gè)糖基化突變(Stanley (1989) Mol. Cell. Biol. 9:377-383)。此細(xì)胞系表達(dá)大多數(shù)經(jīng)明顯修飾的碳水化合物結(jié)構(gòu)及嚴(yán)格截短 的N-鏈接及O-鏈接碳水化合物。如圖8中所示，肝素刺激突變體CHO細(xì)胞系分泌 sFRP-l(泳道1-6)。肝素結(jié)合蛋白質(zhì)與HS之間的相互作用可通過所述序列及HS糖部分的硫酸化水 平來測(cè)定(Esko等人(2002) A脆Rev. Biochem. 71:435-471)。為了測(cè)試O-硫酸化及N-硫酸化是否為sFRP-l分泌中肝素活性所需，將sFRP-l轉(zhuǎn)染293細(xì)胞與完全經(jīng)N-脫硫 酸化，隨后經(jīng)N-乙?；幕瘜W(xué)修飾肝素(Sigma Chemical公司)一起培育。還需檢查缺 少2-0-硫酸化的經(jīng)修飾肝素(Sigma)刺激sFRP-1分泌的能力。如圖9中所示，2-0-脫 硫酸化肝素完全喪失了其刺激sFRP-l分泌的能力(泳道4)。相反，N-脫硫酸化肝素(泳 道3)與未經(jīng)修飾肝素同樣有效，此表明sFRP-l刺激需要O-硫酸化而非N-硫酸化。而 且，以50及100納克/毫升添加4-甲基傘形酮基7-P-D-木糖苷(Sigma Chemical公司) (即一種可代替蛋白多糖核心蛋白的線性部分進(jìn)而可用作葡糖胺聚糖生物合成的可溶 性引物的木糖苷)刺激sFRP-l分泌(泳道5和6)，模擬肝素的作用。實(shí)組層-2潛辦染激應(yīng)產(chǎn)生歪頗使來自穩(wěn)定地超表達(dá)sFRP-l (克隆100-5)的HEK293細(xì)胞系的細(xì)胞在6-孔平板中 生長(zhǎng)至鋪滿狀態(tài)；然后用含有50微克/毫升肝素的新鮮無血清培養(yǎng)基代替所述培養(yǎng)基。 向?qū)?yīng)孔的所述介質(zhì)中加入50納克/毫升的纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1 (FGF-1， Sigma Chemical公司)或纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 (FGF-2， Sigma Chemical公司)。在培養(yǎng)基替 換后48小時(shí)收獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-his4 抗體實(shí)施免疫印跡分析(圖10)。如圖10中所表明，F(xiàn)GF-2與肝素的組合可顯著增加經(jīng) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞產(chǎn)生的sFRP-l。因此，F(xiàn)GF-2與肝素可以轉(zhuǎn)錄后方式調(diào)控蛋白質(zhì)合成，這是因?yàn)楸狈接≯E分析顯 示sFRP-l的mRNA水平并不受肝素存在的影響(圖5)。不希望受限于理論，肝素可影 響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯的過程，這是因?yàn)镕GF已經(jīng)顯示影響其靶蛋白的轉(zhuǎn)譯(Szebenyi等人 (1999) Int. Rev. Cvtol)。 FGF還可活化某些其產(chǎn)物可上調(diào)轉(zhuǎn)譯過程的耙基因。另一種可 能是所述FGF途徑可有利于沿分泌途徑運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)。越來越多的證據(jù)表明蛋白質(zhì)分 泌及表面局域化受一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如，未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng))的嚴(yán)密控制 (Schroder等人(2005) Annu. Rev. Biochem. 74:739-789)。許多ER伴侶蛋白已經(jīng)顯示可
促進(jìn)細(xì)胞表面局域化及不同客體蛋白的分泌。肝素及FGF-2可活化這些機(jī)制并促進(jìn)重組蛋白的分泌。詹4.繊FGFi -/ ^"潛辦染潘應(yīng)產(chǎn)f節(jié)處使來自穩(wěn)定地超表達(dá)sFRP-l (克隆100-5)的HEK293細(xì)胞系的細(xì)胞在6-孔平板中 生長(zhǎng)至鋪滿狀態(tài)且然后用兔多克隆抗-FGFR-l或抗-FGFR-2抗體(Sigma Chemical公司) 預(yù)處理或模擬處理6小時(shí)。接下來，用50微克/毫升肝素處理所述細(xì)胞。在肝素處理 后48小時(shí)收獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-his4 抗體實(shí)施免疫印跡分析(圖11)。所述資料表明用抗-FGFR-l而非用抗-FGFR-2進(jìn)行 預(yù)處理大大地降低了肝素引發(fā)的蛋白質(zhì)增量作用。，5.,素微機(jī)浙應(yīng)產(chǎn)f J 歪離使具有存于pSMEDA中的C端His6標(biāo)簽的金屬蛋白酶MMP-23在補(bǔ)充有5% FBS 的培養(yǎng)基中于HEK293-EBNA細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)變成 具有各種濃度FBS的新鮮介質(zhì)。向某些反應(yīng)物中加入50微克/毫升肝素。在96小時(shí)時(shí) 收獲條件培養(yǎng)基。借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-his4抗體實(shí)施免 疫印跡分析。如圖12中所示，肝素大大地增加了所觀測(cè)得MMP23-his6蛋白質(zhì)水平。使具有存于pcDNA3.1中的C端myc標(biāo)簽的人體Dickkopf-l (DKK-1)在補(bǔ)充有5% FBS的培養(yǎng)基中于HEK293-FT細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在DNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，向所述細(xì) 胞培養(yǎng)物中加入50微克/毫升的肝素。在96小時(shí)時(shí)收獲條件培養(yǎng)基(S)及細(xì)胞沉淀(P)。 借助SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)試樣并對(duì)小鼠單克隆抗-myc抗體實(shí)施免疫印跡分析。如圖 13中所示，肝素大大地增加了 DKKl-myc蛋白質(zhì)的水平。本發(fā)明的上述說明提供闡釋及說明，但并非意欲包羅無遺或?qū)⒈景l(fā)明限制于所揭 示具體內(nèi)容。符合以上教示內(nèi)容的修飾形式及變化形式可能存在或可自本發(fā)明實(shí)踐獲取。因此，值得注意的是，本發(fā)明的范圍是由權(quán)利要求書及其等效形式界定。
權(quán)利要求
1、一種包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞各自包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒，且所述相關(guān)蛋白質(zhì)不能夠與細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以引發(fā)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)在化，且其中所述培養(yǎng)基包含有效量的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖以增加所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)。
2、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是選自由下列組成的群組胰島素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素蛋白、促濾泡激素、干擾素、白細(xì) 胞介素、細(xì)胞因子、集落刺激因子、凝血因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、甲狀旁 腺激素、骨形成蛋白、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白質(zhì)C、分泌型巻曲基因相關(guān) 蛋白、選擇蛋白、金屬蛋白酶、dickkopf蛋白、及抗體。
3、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基包含自約1至約1,000微克/毫升的肝素。
4、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基包含自約10至約200微克/ 毫升的肝素。
5、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基，其包 含有效量的FGF-2以增加所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)。
6、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是參與骨發(fā)育的蛋白質(zhì)。
7、 如權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是選自由骨形成蛋白、 分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白、金屬蛋白酶及dickkopf蛋白組成的群組。
8、 一種包含由如權(quán)利要求1所述表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物。
9、 一種包含基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，所述基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞各 自包含一個(gè)或多個(gè)編碼相關(guān)蛋白質(zhì)及FGFR-1-介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型活性組份的 重組表達(dá)盒。
10、 如權(quán)利要求9所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述組份是組成型活性FGFR-1蛋白質(zhì)。
11、 如權(quán)利要求10所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是選自由下列組成的 群組胰島素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素蛋白、促濾泡激素、干擾素、白 細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、集落刺激因子、凝血因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、甲狀 旁腺激素、骨形成蛋白、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白質(zhì)C、分泌型巻曲基因相 關(guān)蛋白、選擇蛋白、金屬蛋白酶、dickkopf蛋白、及抗體。
12、 如權(quán)利要求10所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是參與骨發(fā)育的蛋白質(zhì)。
13、 如權(quán)利要求10所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述相關(guān)蛋白質(zhì)是選自由骨形成蛋白、 分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白、金屬蛋白酶及dickk叩f蛋白組成的群組。
14、 一種包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞各 自包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒，且所述相關(guān)蛋白質(zhì)不能夠與細(xì)胞表面硫酸肝素 蛋白多糖相互作用以引發(fā)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)在化，且其中所述培養(yǎng)基包含有效量的 FGFR-1活化劑以增加所述細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)。
15、 如權(quán)利要求14所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基且所 述FGFR-1活化劑包括肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖；及 纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2。
16、 一種包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞各 自包含編碼相關(guān)蛋白質(zhì)的重組表達(dá)盒，且所述培養(yǎng)基包含有效量的P-木糖苷以增加所 述細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)。
17、 如權(quán)利要求16所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述培養(yǎng)基包含約50微克/毫升至約 100微克/毫升的4-甲基傘形酮基-p-D-木糖苷。
18、 一種用于增進(jìn)重組表達(dá)蛋白表達(dá)的方法，所述方法包括如下步驟 培養(yǎng)包含編碼所述蛋白質(zhì)的信使RNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；及 活化FGFR-1，其中FGFR-1的活化可增進(jìn)所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯，且其中所述蛋白質(zhì)本身不為FGFR-1 的活化劑。
19、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)不為病毒蛋白。
20、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中活化FGFR-1包括在包含有效量肝素或硫酸 肝素葡糖胺聚糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞以增進(jìn)所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯。
21、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含10-200微克/毫升的肝素。
22、 如權(quán)利要求21所述的方法，其中每個(gè)細(xì)胞包含包括信使RNA的重組表達(dá)盒 的瞬時(shí)導(dǎo)入表達(dá)載體并在將所述表達(dá)載體瞬時(shí)導(dǎo)入所述細(xì)胞中后至少24小時(shí)向所述 培養(yǎng)基中添加肝素。
23、 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基，其進(jìn)一 步包含有效量的FGF-2以增進(jìn)所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯。
24、 如權(quán)利要求20所述的方法，
25、 如權(quán)利要求18所述的方法， 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
26、 如權(quán)利要求25所述的方法 步包含F(xiàn)GF-2。
27、 如權(quán)利要求25所述的方法，
28、 如權(quán)利要求18所述的方法，
29、 如權(quán)利要求18所述的方法其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含血清。其中活化FGFR-1包括在包含有效量卩-木糖苷，其中所述培養(yǎng)基是不含血清的培養(yǎng)基，其進(jìn)一其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含血清。 其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類細(xì)胞。 ，其中所述蛋白質(zhì)不能夠與細(xì)胞表面硫酸肝素蛋 白多糖相互作用以引發(fā)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)在化。
30、 如權(quán)利要求18所述的方法，所述方法進(jìn)一步包含如下步驟自所述細(xì)胞或 所述培養(yǎng)基分離所述蛋白質(zhì)。
31、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是選自由下列組成的群組胰 島素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生成素蛋白、促濾泡激素、干擾素、白細(xì)胞介素、 細(xì)胞因子、集落刺激因子、凝血因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、甲狀旁腺激素、 骨形成蛋白、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激 因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白質(zhì)C、分泌型巻曲基因相關(guān)蛋白、選 擇蛋白、金屬蛋白酶、dickk叩f蛋白、及抗體。
32、 一種包含按照如權(quán)利要求18所述方法產(chǎn)生的相關(guān)蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物。
33、 一種用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述細(xì)胞各自包含一個(gè)或多個(gè)編碼所述蛋白質(zhì)及FGFR-1-介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型活性組份的重組表達(dá)盒； 在所述細(xì)胞中表達(dá)所述蛋白質(zhì)及所述組份；及 '自所述細(xì)胞或培養(yǎng)基分離所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改良產(chǎn)率的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)及使用這些系統(tǒng)產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)包括在含有有效量肝素或肝素樣分子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的基因工程哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。肝素或肝素樣分子的存在可大大地增加所述培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及FGFR-I-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組成型活性組份在改善經(jīng)培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)方面的用途。此組份與相關(guān)蛋白質(zhì)的共表達(dá)可明顯地提高所述相關(guān)蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101160392SQ200680012921
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者羅納德·克里茨, 鐘曉天, 馬克·施塔爾 申請(qǐng)人:惠氏公司