專利名稱：：免疫刺激寡核苷酸的制作方法免疫刺激寡核苷酸發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及短的免疫刺激寡核苷酸，以及具有降低的腎臟炎性作用的免疫刺激寡核苷酸、其組合物和使用這種免疫刺激寡核苷酸的方法。發(fā)明背景細(xì)菌DNA具有免疫刺激作用，能激活B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，但是脊推動(dòng)物DNA則不能(Tokunaga，T.，等人，1988.Jpn.JCancerRes.79:682-686;Tokunaga，T.，等人，1984，JNCI72:955-962;Messina,J.P.，等人，1991，J.Immunol.147:1759-1764;并且綜述于Krieg，1998，AppliedOligonucleotideTechnology,C.A.Stein和A.M.Krieg,(編輯.)，JohnWiley和Sons,Inc.,紐約，N.Y.，431-448頁)?，F(xiàn)在知道細(xì)菌DNA的這些免疫刺激作用是由在特定的堿基環(huán)境中存在未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)引起的，這種CpG基序在細(xì)菌DNA中是普遍存在的，但是在脊推動(dòng)物DNA中是發(fā)生甲基化并且代表不足的(Krieg等人，1995Nature374:546-549;Krieg，1999Biochim.Biophys.Acta93321:1-10)。細(xì)菌DNA的免疫刺激作用可以用合成的包含這些CpG基序的寡脫氧核苷酸(ODN)來模仿。這種CpGODN對人和鼠白細(xì)胞具有高度刺激作用，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子和免疫球蛋白分泌、自然殺傷(NK)細(xì)胞溶解活性和IFN-y分泌，以及激活樹突細(xì)胞(DCs)和其它抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)共刺激分子和分泌細(xì)胞因子，尤其是在促進(jìn)Thl樣T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)育中起重要作用的Thl樣細(xì)胞因子。天然磷酸二酯骨架CpGODN的這些免疫刺激作用是高度CpG特異性的，因?yàn)槿绻鸆pG基序被曱基化，變?yōu)镚pC，或者被消除或改變，這種作用會(huì)急劇降低(Krieg等人，1995Nature374:546-549;Hartmann等人，1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10)。在早期研究中，人們認(rèn)為具有免疫刺激性CpG基序遵循公式嘌呤-嘌呤國CpG-嘧咬-嘧啶(Krieg等人，1995Nature374:546-549;Pisetsky，1996J.Immunol.156:421-423;Hacker等人，1998EMBOJ.17:6230-6240;Upford等人，1998TrendsinMicrobiol.6:496-500)。但是，現(xiàn)在清楚小鼠淋巴細(xì)胞對不遵循這種"公式"的磷酸二酯CpG基序也有很好的應(yīng)答(Yi等人，1998J.Immunol.160:5898-5卯6)，并且這同樣適用于人B細(xì)胞和樹突細(xì)胞(Hartmann等人，1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10;Liang,1996J.Clin.Invest.98:1119-1129)。已經(jīng)描述過幾種不同類的CpG核酸。其中一類可以有效激活B細(xì)胞，但是在誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞激活方面相對來說較弱，這一類被稱為B類。B類CpG核酸一般是完全穩(wěn)定的，并且在某些首選的堿基環(huán)境中包含未甲基化的CpG二核苷酸。例如，參見美國專利號6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。另一類CpG核酸激活B細(xì)胞和NK細(xì)胞，并誘導(dǎo)IFN-a，這一類被稱為C類。如最初所表征的，C類CpG核酸一般是完全穩(wěn)定的，包括B類型的序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。這一類在共同待決的提交于2001年8月17日的美國臨時(shí)專利申請60/313,273和提交于2002年8月19日的US10/224,523和相關(guān)的PCT專利申請PCT/US02/26468(以國際公布號WO03/015711公布)中描述。發(fā)明概述令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過在某些核苷酸之間選擇性的包括一個(gè)或多個(gè)不穩(wěn)定的鍵，可以維持甚至提高B類和C類CpG寡核苷酸以及其它穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸的免疫刺激性質(zhì)。所述不穩(wěn)定鍵優(yōu)選天然的鍵，即磷酸二酯鍵或磷酸二酯樣鍵。不穩(wěn)定鍵一般(但是不必)對于核酸酶消化是相對敏感的。本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸包括位于包含嘧啶(Y)堿基(優(yōu)選C)的5，核苷酸與鄰近的包含嘌呤(Z)堿基(優(yōu)選鳥噤呤(G))的3，核普酸之間的至少一個(gè)不穩(wěn)定鍵，其中5，Y和3'Z都是內(nèi)部核苷酸。另外還發(fā)現(xiàn)較短長度的寡核苷酸可有效地促進(jìn)免疫應(yīng)答。在某些方面，本發(fā)明是長度為3到24個(gè)核苷酸的寡核苷酸，它包含至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸，以及至少4個(gè)胸腺嘧啶(T)核苷酸。Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾嘧咬堿基的核苷酸。Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾鳥噤呤的核苷酸。此寡核苷酸還包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，此寡核苷酸包括TTTT基序。在其它實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸僅有一個(gè)YZ二核苷酸。任選地，此寡核苷酸是G*T*C—G*T*T*T*T*G*A*C(SEQIDNO.:16)或G*T*T*T*T*G*A*C—G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:11)。*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。—是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。在其它實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸僅有兩個(gè)YZ二核苷酸。任選地，此寡核苷酸是T*C_G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T(SEQIDNO.:3),t*c—g*t*c_g*t*t*t*t*g*a*c(SEQIDno.:10)，G*t*T*T*T*G*A*Cg*t*t*t*t*G*t*CG*t*t(SEQIDno.:12)，G*T*C_G*TTT*T*G*A*C_G*T*T(SEQIDNO.:13)，T*C—G*T*T*T*T*G*A*C—G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:14)，或G*T*C—G*T*T*TTG*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:15)。*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵?！侵复嬖诹姿岫ズ塑账衢g鍵。在另一些實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸僅有三個(gè)YZ二核苷酸。此寡核脊酸可以是T*CGH*T*T*G*A*CG*T*TH*G*T*CG*T*T(SEQIDNO.:2)，G*t*GGATAT頭T^TAG頭A頭Gg頭T免TATAT^g頭TWC！g*T*T(IS￡()IDno8)，T*C_G*T*C—GTT*T*T*G*A*C_G*T*TTT*G*T*C(SEQIDNO.:9)，或T*C—G*T*C—G*T*T*T*T*G*A*C(SEQIDNO，10)。*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。根據(jù)其它實(shí)施方案，所述的寡核苷酸僅有四個(gè)YZ二核苷酸。此寡核苷酸可以是T*CGAT*CGAT^TATTAGAA*CGAT^T*T*T*G*T*CG*T*T(ISEQIDNO.:4)，T*CGATACGH*TT*G^A*CGATHT^G+T^CG*TAT(SEQIDNO.:5)，T*C_GTC—G*TT*T_T*G_A*C_G*T_T*TT*G_T*C—GTT(SEQIDNO.:6),GG*TAGG六T分T頭T士T六G頭A頭GG頭TAT論T頭T頭G分T論GG頭T六T(S￡(JIDNO1*7)，T頭GI六T頭Gi論T六T女T頭T頭G頭A頭Gl頭T頭TATAT頭G頭T頭Gl頭T女T(SEQIDNO.:18)，T*MeCG*T*MeCG*T*T*T*T*G*A*MeCG*T*T*T*T*G*T*MeCG*T*T(SEQIDNO.:19)，T^HG^T*HGATATATATAGAA^Hg^TaT^TaTaGaT^HG+TaT(SEQIDNO.:20)，t*C7*t*C7*t*t*t*t*G*A*C7*t*t*T*T*G*T*C7*t*t(SEQIDNO.:21)，或U*C—G*U*C_G*U*U*U*U*G*A*C—G*U*U*U*U*G*U*C—G*U*U(SEQIDNO.:22)。*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。I是包含次黃嘌呤堿基的次黃苷；MeC是5，-甲基-胞嘧啶，H是5-羥基-胞嘧啶，7是7-脫氮-鳥嘌呤，U是尿嘧咬。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)YZ二核苷酸都具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。在一些實(shí)施方案中，磷酸二酯樣鍵是硼代膦酸酯(boranophosphonate)或者非對映純的Rp石jM戈磷酸酯。穩(wěn)定化的核苷酸間鍵可以是硫代砩酸酯、二硫代磷酸酯、曱基膦酸酯、甲基疏代磷酸酯、磷酸乙酯或者它們的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Y是包含未甲基化胞嘧啶的核苷酸并且/或者Z是包含鳥噤呤的核苷酸。Y任選可以為包含胞嘧啶或經(jīng)修飾胞嘧咬堿基如5畫甲基胞嘧啶、5-甲基異胞嗜啶(5-methyl-isocytosine)、5-羥基胞嘧咬、5-卣代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶或者氫的核苷酸。Z可以任選為包含鳥噤呤或經(jīng)修飾鳥噤呤堿基如7-脫氮-鳥噤呤，7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤(如7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤)，7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤，次黃嘌呤，2，6-二氨基噪呤，2-^J^嘌呤，嘌呤，8-取代的鳥噤呤(如8-羥基鳥噪呤)，以及6-硫鳥噤呤，2-氨基嘌呤或者氫的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該寡核苷酸具有3，-3，鍵，具有一個(gè)或兩個(gè)可接近的5，末端。在其它實(shí)施方案中，該寡核苷酸具有兩個(gè)可接近的5，末端，每一個(gè)都是5'TCG。按照本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明提供了長度為2到7個(gè)核苷酸的寡核苷酸。此寡核苷酸具有至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸，并且此寡核苷酸還包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾嗜吱堿基的核香酸。Z是包含鳥噪呤或經(jīng)修飾鳥噪呤的核普酸。在一些實(shí)施方案中，所述的寡核苷酸僅有一個(gè)YZ二核苷酸。此寡核苷酸可以是t*G*t*C*G*t*t(SEQIDno,:23)，t*G*T*C_G*T*T(SEQIDNO,:24)，G*T*C*G*T*T(SEQIDNO.:25)，G*T*C—G*T*T(SEQIDNO.:26)，G*T*C*G*T(SEQIDNO.:27)，G*T*C—G*T(SEQIDNO.:28)，T*C*G*T*T(SEQIDNO.:29)，T*C_G*T*T(SEQIDNO.:30)，或C一G(SEQIDNO.:31)。*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵?！侵复嬖诹姿岫ズ塑账衢g鍵。穩(wěn)定化的核苷酸間鍵可以是硫代磷酸酯。在一些實(shí)施方案中，Y是包含選自5-甲基胞嘧啶，5-甲基異胞嘧啶，5-羥基胞嘧啶，5-卣代胞嘧啶，尿嘧啶，N4-乙基胞嗜啶，5-氟尿嘧咬的未甲基化胞嘧咬或經(jīng)修飾胞嗜咬堿基的核苦酸或者氪。在其它實(shí)施方案中，Z是選自7-脫氮-鳥嘌呤，7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤(如7-脫氮-7-(CVC6)炔基鳥嘌呤)，7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤，次黃嘌呤，2，6-二氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，嘌呤，8-取代的鳥嘌呤(如8-羥基鳥噤呤)，以及6-硫鳥噤呤，2-氨基嘌呤的或者氫鳥噤呤或經(jīng)修飾鳥噤呤堿基。在一些實(shí)施方案中，該寡核苷酸具有3，-3，鍵，具有一個(gè)或兩個(gè)可接近的5，末端。在其它實(shí)施方案中，該寡核苷酸具有兩個(gè)可接近的5，末端，每一個(gè)都是5，TCG。在其它實(shí)施方案中，此寡核苷酸具有3，-氨基己基。在其它實(shí)施方案中，此寡核苷酸具有5，-氨基己基。在其它實(shí)施方案中，此寡核苷酸具有3，-氨基己基和5，-氨基己基。在一些實(shí)施方案中，此寡核苷酸具有通過間隔勤目連接的兩個(gè)YZ二核苷酸。在一些實(shí)施方案中，此間隔基由通過二鍵體(doubler)相連接的兩個(gè)六乙二醇基團(tuán)組成。在一些實(shí)施方案中，此二鍵體是亞磷酰胺。在一些實(shí)施方案中，此亞酰胺是對稱二鍵體亞磷酰胺(GlenResearchCat針0-1920-卯)。在一些實(shí)施方案中，此亞酰胺具有連接的丁酸基。此寡核苷酸可以是(C-G-L)-2doub-but(SEQIDNO.:43)。在其它方面，本發(fā)明是長度為7個(gè)核苷酸的寡核苷酸。該寡核苷酸具有至少一個(gè)CG二核苷酸并且包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。在一些實(shí)施方案中，所有的核苷酸間鍵是硫代磷酸酯鍵。按照本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明提供了長度為5到7個(gè)核苷酸的寡核苷酸。此寡核苷酸具有GTCGT或TCGTT，并且包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。任選地，所有的核苷酸間鍵是硫代磷酸酯鍵。像完全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸一樣，本發(fā)明的免疫刺激寡核普酸可用于誘導(dǎo)Thl樣免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸可用作接種的的佐劑，并且可用于治療疾病(包括癌癥，傳染病，變態(tài)反應(yīng)和哮喘)。人們認(rèn)為它們尤其為任何目的在任何需要延長或重復(fù)施用免疫刺激寡核苷酸的條件下是有用的。在另一方面，本發(fā)明是治療變態(tài)反應(yīng)的方法。通過對具有變態(tài)反應(yīng)或有變態(tài)反應(yīng)危險(xiǎn)的受試者以治療變態(tài)反應(yīng)有效量施用此處所描述的免疫刺激CpG寡核苦酸來進(jìn)行此方法。在另一方面，本發(fā)明是治療哮喘的方法。通過對具有哮喘或有哞喘危險(xiǎn)的受試者以治療哮喘有效量施用此處所描述的免疫刺激CpG寡核苷酸來進(jìn)4于jtb方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，將寡核苷酸施用到粘膜表面。在其它實(shí)施方案中，以氣霧劑制劑施用寡核苷酸。任選地，鼻內(nèi)施用寡核苷酸。在另一方面，本發(fā)明是此處所描述的CpG免疫刺激寡核苷酸與抗原或其它治療化合物(例如抗微生物劑)相組合的組合物。例如，這種抗微生物劑可以是抗病毒劑，抗寄生蟲劑，抗細(xì)菌劑或者抗真菌劑。按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了包括此處所描述的CpG免疫刺激寡核苷酸的緩釋裝置的組合物。此組合物可以任選包括藥物載體和/或配制到遞送裝置中。在一些實(shí)施方案中，此遞送裝置選自陽離子脂質(zhì)，細(xì)胞通透蛋白和緩釋裝置。在一個(gè)實(shí)施方案中，該緩釋裝置是生物可降解的聚合物或者微粒。按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了刺激免疫應(yīng)答的方法。此方法包括對受試者按照可以有效誘導(dǎo)受試者免疫應(yīng)答的量施用CpG免疫刺激寡核苷酸。該CpG免疫刺激寡核苷酸優(yōu)選口服施用，局部施用，以緩釋裝置施用，經(jīng)粘膜施用，全身施用，腸胃外施用，或者肌內(nèi)施用。當(dāng)CpG免疫刺激寡核苷酸施用到粘膜表面時(shí)，它可以以有效誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答或者系統(tǒng)免疫應(yīng)答的量遞送。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，粘膜表面選自口、鼻、直腸、陰道和眼表面。在一些實(shí)施方案中，此方法包括使受試者接觸抗原，其中免疫應(yīng)答是抗原特異性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，抗原選自腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原和肽抗原。CpG免疫刺激寡核苷酸能夠刺激廣譜免疫應(yīng)答。例如，這些CpG免疫刺激寡核苷酸可以用于將TH2重定向到Thl免疫應(yīng)答。CpG免疫刺激寡核苷酸還可以用于激活免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞(如B和T細(xì)胞)，樹突細(xì)胞和NK細(xì)胞。此激活可以在體內(nèi)(invivo)、體外(invitro)或離體(exvivo)進(jìn)行，即通過從受試者分離免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞與激活它們的有效量CpG免疫剌激寡核苷酸相接觸，并對受試者重新施用此激活的免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，樹突細(xì)胞呈遞癌抗原。這些樹突細(xì)胞可以與癌抗原離體接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種CpG免疫刺激寡核苷酸可用于治療癌癥。按照本發(fā)明的其它方面，這種CpG免疫刺激寡核苷酸也可用于預(yù)防具有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者的癌癥(例如，降低發(fā)展為癌癥的風(fēng)險(xiǎn))。癌癥選自膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、上皮內(nèi)腫瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(如小細(xì)胞和非小細(xì)胞)、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、甲狀腺癌和腎癌，以及其它的癌和肉瘤。在一些重要的實(shí)施方案中，癌癥選自骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、結(jié)締組織癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、口腔癌、皮膚癌和睪丸癌。任選地，當(dāng)CpG免疫刺激寡核苷酸與抗癌治療聯(lián)合施用時(shí)，CpG免疫刺激寡核苷酸還可以用于增加癌細(xì)胞對癌癥治療(如抗癌治療)的響應(yīng)。抗癌治療可以是化學(xué)療法、疫苗(如體外已接觸抗原的樹突細(xì)胞疫苗或癌抗原疫苗)或者基于抗體的治療。后一種治療還可以包括施用細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)表面抗原特異性的抗體，其中免疫應(yīng)答導(dǎo)致依賴于抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可以選自Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、Oncolym、SMARTM195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、iort6、MDX醒210、MDX-ll、MDX-22、OV103、3622W94、anti國VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX誦447、MELIMMUNE陽2、MELIMMUNE匪1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab曙H、GNI誦250、EMD曙72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、4B5、ioregf.r3、iorc5、BABS、anti-FLK-2、MDX-260、ANAAb、SMART1D10Ab、SMARTABL364Ab和ImmuRAIT-CEA。因此，按照本發(fā)明的一些方面，對患有癌癥或者有癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用CpG免疫刺激寡核普酸和抗癌治療。在一些實(shí)施方案中，抗癌治療選自化學(xué)治療劑、免疫治療劑和癌癥疫苗。在其它方面，本發(fā)明是誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答的方法，通過對受試者施用有效量的CpG免疫刺激寡核苷酸，從而激活先天性免疫應(yīng)答。按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了治療病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。此方法包括對患有病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或者有其風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用治療病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染有效量的任一種本發(fā)明的組合物。在一些實(shí)施方案中，這種病毒是肝炎病毒，如乙型肝炎，丙型肝炎，fflV，皰滲病毒或乳頭瘤病毒。按照本發(fā)明的另一方面，提供了治療細(xì)菌感染的方法。此方法包括對患有細(xì)菌感染或者有其危險(xiǎn)的受試者施用治療細(xì)菌感染有效量的任一種本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌感染是由細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起的。在另一方面，本發(fā)明是通過對患有寄生蟲感染或者有其危險(xiǎn)的受試者施用治療寄生蟲感染有效量的任一種本發(fā)明的組合物，治療寄生蟲感染的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，寄生蟲感染是由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲引起的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寄生蟲感染是由非蠕蟲寄生蟲引起的。在一些實(shí)施方案中，受試者是人，在其它實(shí)施方案中，受試者是非人脊推動(dòng)物，如狗，貓，馬，奶牛，豬，火雞，山羊，魚，猴，雞，大鼠，小鼠或綿羊。在另一方面，本發(fā)明涉及通過對患有自身免疫病或者有其危險(xiǎn)的受試者施用治療或預(yù)防自身免疫病有效量的任一種本發(fā)明的組合物，治療自身免疫病的方法。在其它實(shí)施方案中，遞送有效量的寡核苷酸到受試者，從而誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)。任選地，細(xì)胞因子選自IL-6，TNFa，IFNa，IFNy和IP-IO。在其它實(shí)施方案中，遞送有效量的寡核苷酸到受試者，從而將免疫應(yīng)答由TH2偏倚的應(yīng)答轉(zhuǎn)向到Thl偏倚的應(yīng)答，或者抑制TH2偏倚的應(yīng)答的發(fā)展。在一些方面，本發(fā)明是治療氣道重塑的方法，包括對受試者以治療受試者中氣道重塑有效量施用此處所描述的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有孝喘、慢性阻塞性肺疾病或者是吸煙者。在其它實(shí)施方案中，受試者無哮喘癥狀。本發(fā)明的另一方面還提供了本發(fā)明的寡核苷酸刺激免疫應(yīng)答的用途。本發(fā)明還提供了本發(fā)明寡核苷酸制造用于刺激免疫應(yīng)答的藥物的方法。按照本發(fā)明的其它方面，本發(fā)明還提供了包含上述寡核苷酸和可藥用載體的藥物。在本發(fā)明的其它方面，提供了前述寡核苷酸在制造用于治療或預(yù)防受試者的病毒、真菌、細(xì)菌或寄生蟲感染、癌癥或哞喘或變態(tài)反應(yīng)的方法中的藥物的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒感染是由乙型肝炎病毒引起的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒感染是由丙型肝炎病毒引起的。還提供了此處所描述的寡核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物在免疫治療/化學(xué)治療之前、與之一起或之后施用。本發(fā)明的每一個(gè)限制可以包括本發(fā)明的多種實(shí)施方案。因此，可以預(yù)期包括任何一個(gè)要素或者其組合的本發(fā)明的每一個(gè)限制可以包括在本發(fā)明的每一個(gè)方面中。附圖簡述圖1是一組圖，描繪了當(dāng)人PBMC與沿圖上方X軸以編號列出的寡核苷酸相接觸后，從這些細(xì)胞中分泌出來的oc干擾素的水平(pg/ml)。圖1所示的測試寡核苷酸包括1A二SEQIDNO:1，1B=SEQIDNO:2，1C=SEQIDNO:3，1D=SEQIDNO:4,1E=SEQIDNO:5,1F=SEQIDNO:6，1G=SEQIDNO:7，1H=SEQIDNO:8，11=SEQIDNO:9，1J=SEQIDNO:10，1K=SEQIDNO:11，1L=SEQIDNO:12，1M=SEQIDNO:13，1N=SEQIDNO:14，IO-SEQIDNO:15，1P=SEQIDNO:16，1Q=SEQIDNO:17，1R=SEQIDNO.18,1S=SEQIDNO:19,1T=SEQIDNO:20，1U=SEQIDNO:21，和1V=SEQIDNO.:22。沿X軸描繪用于產(chǎn)生特定數(shù)據(jù)點(diǎn)的寡核苷酸濃度OtM)。所顯示的數(shù)據(jù)代表4到6個(gè)供體的平均值。因?yàn)槭褂脕碜圆煌w的PBMC，它們彼此間具有差異性，所以不能直接以pg/ml比較絕對水平。圖2是一組圖，描繪了不同濃度的半軟和全硬化的短CpGODN對于IFN-a誘導(dǎo)的比較。SEQIDNO.:23和24顯示于圖2A。SEQIDNO.:25、26、27、28、29、30和31顯示于圖2B。圖3是一組圖，顯示了不同濃度的5種不同ODNs:SEQIDNO:25(圓形)，SEQIDNO:26(倒三角形)，SEQIDNO:36(正方形)，SEQIDNO:37(菱形)，SEQIDNO:38(三角形)和DOTAP(六邊形))對TLR9的誘導(dǎo)。將穩(wěn)定表達(dá)人TLR9的HEK293細(xì)胞和NFKB-荄光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體與指示的ODN濃度孵育16小時(shí)。裂解細(xì)胞并且通過測定螢光素酶活性來確定TLR9的激活。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)一式三份進(jìn)行。圖3B描繪了用DOTAP(N-[l-(2，3-二油?；趸?丙基-N，N，N-甲基硫酸三乙基銨)預(yù)絡(luò)合的ODNs的實(shí)驗(yàn)，而圖3A顯示沒有DOTAP的實(shí)驗(yàn)。圖4是一組圖，描繪了當(dāng)人PBMC與具有不同的穩(wěn)定核苷酸間鍵的ODNs:SEQIDNO:38(圓形)，SEQIDNO:25(倒三角形)，SEQIDNO:26(正方形)，SEQIDNO:36(菱形)和SEQIDNO:37(三角形)相接觸后，從這些細(xì)胞中分泌出的細(xì)胞因子水平。圖4A顯示IFN-Y分泌的誘導(dǎo)，而圖4B-4D分別描繪IL-10，IL-6和IFN-y的分泌。沿X軸描繪用于產(chǎn)生特定數(shù)據(jù)點(diǎn)的寡核苷酸的濃度OiM)。所顯示的數(shù)據(jù)代表3個(gè)供體的平均值。圖5是一組圖，描繪了當(dāng)人PBMC與具有不同的穩(wěn)定核苷酸間鍵的ODN二核苷酸SEQIDNO:38(圓形)，SEQIDNO:40(倒三角形)，SEQIDNO:41(正方形)，SEQIDNO:42(菱形)，SEQIDNO:39(三角形)和SEQIDNO:31(六邊形)相接觸后，從這些細(xì)胞中分泌的細(xì)胞因子水平。圖5A顯示IFN-a分泌的謙導(dǎo)，而圖5B和5C分別顯示IL-10和IL-6的分泌。沿X軸描繪用于產(chǎn)生特定數(shù)據(jù)點(diǎn)的寡核苷酸的濃度OiM)。所顯示的數(shù)據(jù)代表3個(gè)供體的平均值。圖6是一組圖，描繪了當(dāng)人PBMC與ODN(C-G-L)-2doub-but(SEQIDNO:43;亮圓形)，陽性對照ODN(SEQIDNO:38;倒三角形)或者僅DOTAP(暗圓形)相接觸后，從這些細(xì)胞中分泌的細(xì)胞因子水平。圖6A顯示IFN-ot分泌的i秀導(dǎo)，而圖6B和6C分別顯示IL-10和IL-6的分泌。沿X軸描繪用于產(chǎn)生特定數(shù)據(jù)點(diǎn)的寡核苷酸的濃度0iM)。所顯示的數(shù)據(jù)代表3個(gè)供體的平均值。詳述按照本發(fā)明提供了軟和半軟的免疫刺激寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，此處所描述發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸具有改進(jìn)的性質(zhì)，包括類似或增強(qiáng)的效力，與腎臟、肝臟和脾臟的減少的系統(tǒng)接觸，以及可以在注射位點(diǎn)具有減少的反應(yīng)原性。盡管申請人不受機(jī)理限制，可以相信這些改進(jìn)的性質(zhì)與磷酸二酯或磷酸二酯樣"核普酸間鍵"在免疫刺激寡核苷酸內(nèi)的策略放置有關(guān)。此處所用的術(shù)語"核苷酸間鍵"是指在寡核苷酸分子內(nèi)連接兩個(gè)鄰近核苷酸的共價(jià)骨架鍵。共價(jià)骨架鍵一般是經(jīng)修飾的或未修飾的磷酸酯鍵，但是其它修飾也是可能的。因此長度為n個(gè)核苷酸的線性寡核苷酸共具有個(gè)核苷酸間鍵。按照本發(fā)明的教導(dǎo)，這些共價(jià)骨架鍵在免疫刺激寡核苷酸中可以是經(jīng)修飾的或未修飾的。盡管先前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到長度少于20個(gè)核苷酸的完全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸與更長的(例如，長度為24個(gè)核苷酸)完全穩(wěn)定寡核苷酸相比可以具有較低的免疫刺激活性，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長度短至16個(gè)核苷酸的半軟寡核苷酸具有至少等同于長度超過20個(gè)核苷酸的完全穩(wěn)定的寡核苷酸的免疫刺激活性。例如SEQIDNO:32和33(都是與SEQIDNO:34具有部分序列相似性的16-mers)展示出比得上SEQIDNO:34(24-mer)的免疫刺激活性。這些ODN具有如下序列T*C_GTC_GTT*T*CG*T*C—G*T*T(SEQIDNO:32)，T*cg*T*C_G*T*T*T*TG*T*C—g*T*T(seqIDNO:33)和T頭C!AG頭T論C^頭GAT頭TAT頭T論(;頭TAG先G頭T免T頭TATAGAT頭GAGAT免T(SEQIDNO:34)。在某些情況中，5-mer硫代磷酸酯寡核苷酸似乎缺乏免疫刺激活性，即使用一個(gè)磷酸二酯內(nèi)部YZ核苷酸間鍵替代硫代磷酸酯鍵，也可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生相應(yīng)的具有免疫刺激活性的5-mer(表3和圖2中比較SEQIDNO:27對28)。在更高濃度的情況下，在某些實(shí)例中甚至2-3-mer(i.eSEQIDNO:31)也會(huì)顯示出活性。在其它實(shí)例中，已經(jīng)鑒定出具有軟、半軟或者全硬化的骨架，并且長度在5到7個(gè)核苷酸之間的最優(yōu)寡核苷酸。例如參見SEQIDNO.:27和29。在這種尺寸范圍內(nèi)的具有全硬化骨架的寡核苷酸在更高濃度時(shí)尤其具有活性。特別地，磷酸二酯或者磷酸二酯樣核苷酸間鍵包括"內(nèi)部二核苷酸"。內(nèi)部二核苷酸一般是指通過核苷酸間鍵所連接的任何一對的鄰近核苷酸，其中這對核苷酸中的任何一個(gè)核苷酸都不是終止核苷酸，即這對核苷酸中的任何一個(gè)核苷酸都不是定義寡核苷酸5，或3，末端的核苷酸。因此，長度為n個(gè)核苷酸的線性寡核苷酸共有n-l個(gè)二核苷酸和只有n-3個(gè)內(nèi)部二核苷酸。內(nèi)部二核苷酸中的每個(gè)核苦酸間鍵是內(nèi)部核苷酸間鍵。因此，長度為n個(gè)核苷酸的線性寡核苷酸共有n-l個(gè)核苷酸間鍵和只有n-3個(gè)內(nèi)部二核苷酸間鍵。因此，策略放置的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵是指位于核酸序列中任何一對核苷酸之間的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。在一些實(shí)施方案中，磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵不位于最靠近5，或3，末端的任何一對核苷酸之間。本發(fā)明至少在一些方面是基于如下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即此處所描述的軟和半軟寡核苷酸與相應(yīng)的具有相同核苷酸序列的完全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸相比，具有至少相同或者在很多情況下更高的免疫刺激活性。進(jìn)一間放置"軟化"鍵，也可保持免疫刺激性質(zhì)。這是意料之外的，因?yàn)槿藗兺ǔＵJ(rèn)為硫代磷酸酯寡核苷酸通常比不穩(wěn)定寡核苷酸更具有免疫刺激性。結(jié)果是令人驚奇的，因?yàn)樵陬A(yù)料中，如果"軟化"^^置到關(guān)鍵免疫刺激基序(即CG)之間，那么寡核苷酸可能活性降低，因?yàn)樵摴押塑账嵩隗w內(nèi)很容易被分解形成不含CG的片段。軟寡核苷酸是具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一個(gè)包含嘧啶-嘌呤堿基(YZ)的內(nèi)部二核苷酸內(nèi)部和緊鄰至少一個(gè)包含嘧咬-噪呤堿基(YZ)的內(nèi)部二核苷酸出現(xiàn)磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。YZ優(yōu)選為YG，即包含嘧咬-鳥嘌呤堿基(YG)的二核苷酸。至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苷酸自身具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。緊鄰至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苷酸出現(xiàn)的砩酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵可以是至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核普酸的5，、3，、或者5，和3，。優(yōu)選地，緊鄰至少一個(gè)內(nèi)部YZ二核苷酸出現(xiàn)的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵自身是內(nèi)部核苷酸間鍵。因此，對于序列NiYZN2(其中Ni和N2是相互獨(dú)立的任何單核苷酸)，該YZ二核苦酸具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵，另外，(a)當(dāng)Ni是內(nèi)部核苷酸時(shí)，Ni和Y通過磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵相連，(b)當(dāng)N2是內(nèi)部核苷酸時(shí)，Z和N2通過磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵相連，或者(c)當(dāng)IN^是內(nèi)部核苷酸時(shí)，&和Y通過磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵相連，并且當(dāng)N2是內(nèi)部核苷酸時(shí)，Z和N2通過磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間名t相連。半軟寡核苷酸是具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激寡核苷酸，其中只在至少一個(gè)包括嘧啶-噤呤堿基(YZ)的內(nèi)部二核苷酸內(nèi)部出現(xiàn)磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。相對于相應(yīng)的完全穩(wěn)定免疫刺激寡核普酸來說，半軟寡核苷酸通常具有增加的免疫刺激效力。例如，半軟SEQIDNO:35的免疫刺激效力是全^l代磷酸酯SEQIDNO:34的2-5倍，這兩個(gè)寡核苷酸具有相同的核苷,列，只是關(guān)于內(nèi)部YZ核苷酸間鍵具有如下不同，其中*指示硫代磷酸酯，—指示磷酸二酯T*cg*T*cg*T*T*T^Tg^T^cg^T^T^TaT^G^T^Cg^T》T(SEQIDNO:35)和T頭C!^G^T論(^AG頭T頭TAT論T頭G頭T女C!^G先T頭T六T頭TAG先TAG頭GAT眾T(SEQIDNO:34)。SEQIDNO:35摻入包括CG和TG(都是YZ)二核苦酸的內(nèi)部磷酸二酯核苷酸間鍵。由于半軟寡核苷酸的增強(qiáng)的效力，在很多實(shí)例中，半軟寡核苷酸可以在較^f氐的有效濃度使用，并且比常規(guī)的完全穩(wěn)定的免疫刺激寡核苷酸具有較低的有效劑量以達(dá)到希望的生物效應(yīng)。除了在優(yōu)選的內(nèi)部位置的磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵外，本發(fā)明的寡核苷酸一般還包括抵抗降解的5，和3，末端。這種抵抗降解的末端可以包括任何適當(dāng)小務(wù)飾，其比相應(yīng)未修飾末端產(chǎn)生對核酸外切酶消化的增強(qiáng)的抗性。例如，可以通過包括骨架的至少一個(gè)砩酸酯修飾使5，和3，末端穩(wěn)定化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，骨架在每個(gè)末端的至少一個(gè)磷酸酯修飾獨(dú)立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、曱基膦酸酯、磷酸乙酯或者曱基硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抵抗降解的末端包括在3，末端通過肽或酰胺鍵連接的一個(gè)或多個(gè)核苷酸單元。包括但不限于下文所描述的其它穩(wěn)定末端將會(huì)包括在本發(fā)明中。如上文所描述，本發(fā)明的寡核苷酸包括在內(nèi)部YZ二核苷酸內(nèi)和任選地鄰近內(nèi)部YZ二核苷酸的磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵。這種YZ二核苦酸常常是免疫刺激基序的部分。然而，寡核苷酸有必要在每個(gè)免疫刺激基序內(nèi)部包含磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵。磷酸二酯核苷酸間鍵是自然界中發(fā)現(xiàn)的寡核苦酸特有的鍵類型。磷酸二酯核苷酸間鍵包括在側(cè)面為兩個(gè)橋連的氧原子，并且還與另外兩個(gè)氧原子(一個(gè)是帶電的，另一個(gè)是不帶電的)相連的磷原子。當(dāng)它在降低寡核苷酸的組織半衰期起重要作用時(shí)，尤其優(yōu)選磷酸二酯核苷酸間鍵。磷酸二酯樣核苷酸間鍵是包含磷的橋連基，它在化學(xué)上和/或非對映異構(gòu)類似于磷酸二酯。與磷酸二酯的相似性測量包括對核酸酶消化的敏感性和激活RNAseH的能力。因此，例如磷酸二酯(而不是硫代磷酸酯)寡核苷酸是對核酸酶消化敏感的，而磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸都激活RNAseH。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，磷酸二酯樣核苷酸間鍵是硼代膦酸酯(boranophosphate)(或者等同地硼代膦酸酯(boran叩hosphonate))鍵。美國專利號5,177,198;美國專利號5，859，231;美國專利號6,160,109;美國專利號6,207,819;Sergueev等人，(1998)JAmChemSoc120:9417-27。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，磷酸二酯樣核苷酸間鍵是非對映純的Rp硫代磷酸酯?？梢韵嘈?，與混合的或者非對映純的Sp硫代磷酸酯相比，非對映純的Rp硫代磷酸酯對核酸酶消化更敏感，并且能更好地激活RNAseH。應(yīng)當(dāng)注意，對于本發(fā)明的目的，術(shù)語"磷酸二酯樣核苷酸間鍵"明確排除硫代磷酸酯和曱基膦酸酯核苷酸間鍵。本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸分子可以具有嵌合骨架。對于本發(fā)明的目的，嵌合骨架是指部分穩(wěn)定的骨架，其中至少一個(gè)核苷酸間鍵是磷酸二酯或磷酸二酯樣的，并且其中至少一個(gè)核苷酸間鍵是穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，其中至少一個(gè)磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵和至少一個(gè)穩(wěn)定化的鍵是不同的。由于已經(jīng)報(bào)導(dǎo)硼代膦酸酯鍵相對于磷酸二酯鍵是穩(wěn)定的，為了骨架的嵌合特性的目的，硼代膦酸酯鍵依賴于具體情況可以歸類為磷酸二酯樣或穩(wěn)定化的。例如，按照本發(fā)明的嵌合骨架在一個(gè)實(shí)施方案中可以包括至少一個(gè)磷酸二酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)鍵以及至少一個(gè)硼代膦酸酯(穩(wěn)定化的)鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合骨架可以包括硼代膦酸酯(磷酸二酯或磷酸二酯樣)和硫代磷酸酯(穩(wěn)定化的)鍵。"穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，，是指與磷酸二酯核苷酸間鍵相比，更能抵抗體內(nèi)降解(例如，通過外切或內(nèi)切核酸酶)的核苷酸間鍵。優(yōu)選的穩(wěn)定化的核苷酸間鍵包括(但不限于)硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，磷酸乙酯和甲基硫代磷酸酯。其它的穩(wěn)定化的核苦酸間鍵包括(但不限于)肽，烷基，脫磷酸和上文所描述的其它穩(wěn)定化的核普酸間鍵。使用利用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學(xué)的自動(dòng)化技術(shù)可以合成經(jīng)修飾的骨架(如石克代磷酸酯)?？梢园凑杖缑绹鴮＠?，469，863中所描述來制備芳基和烷基膦酸酯；可以使用可商購試劑通過自動(dòng)化固相合成來制備烷基磷酸三酯(其中帶電的氧部分按照美國專利號5,023,243和歐洲專利號092,574中所描述烷基化)。已經(jīng)描述了進(jìn)行其它DNA骨架J務(wù)飾和替代的方法。UhlmannE等人(1990)ChemRev90:544;GoodchildJ(19卯)BioconjugateChem1:165。制備嵌合寡核苷酸的方法也是已知的。例如，Uhlmann等人的專利描述了這種技術(shù)?？梢允褂每缮藤彽腄NA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)合成混合的骨架修飾的ODN。(F.E.Eckstein,"OligonucleotidesandAnalogues-APracticalApproach"IRLPress,Oxford,UK,1991，和M.D.MatteucciandM.H.Caruthers,TetrahedronLett.21,719(1980)、。在偶聯(lián)之后，通過使用Beaucage試劑(R.P.Iyer,W.Egan，J.B.ReganandS.L.Beaucage,^Am,Chem.Soc.112,1253(1990))(乙腈中0.075M)或苯基乙?；嘶?PADS)硫化，然后使用乙酸酐、2,6-二甲基吡咬在四氫呋喃中(1:1:8;v:v:v)和N-甲基咪唑(四氫呋喃中16%)帽化，從而引入PS鍵。在硫化反應(yīng)之后進(jìn)行這種帽化步驟以減少在硫代磷酸酯鍵的位置形成不需要的磷酸二酯(PO)鍵。在引入磷酸二酯鍵的情況下，例如在CpG二核苷酸處，通過用在7K/吡啶中的碘溶液處理使中間產(chǎn)物三價(jià)磷氧化。在從固相支持體上剪切并通過用濃氨處理(在50C處理15小時(shí))最終脫保護(hù)之后，通過在Gen-PakFax柱(Millipore-Waters)上以NaCl梯度(例如乙腈/水中緩沖液A:10mMNaH2P04=l:4/v:vpH6.8;乙腈/水中緩沖液B:10mMNaH2P04，1.5MNaCl=l:4/v:v;在30分鐘內(nèi)以流速1ml/min完成梯度5-60%B)通過HPLC或者毛細(xì)管凝膠電泳分析ODN。可以通過HPLC或者FPLC在SourceHighPerformance柱(AmershamPharmacia)上純化ODN。合并HPLC同質(zhì)級分，并通過柱或超濾脫鹽。用MALDI-TOF質(zhì)譜分析ODN以證實(shí)計(jì)算的質(zhì)量。本發(fā)明的寡核苷酸還可以包括其它修飾。這些修飾包括非離子DNA類似物，例如烷基-和芳基-磷酸酯(其中帶電的膦酸酯氧被烷基或芳基取代)，磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中帶電的氧部分被烷基化)。在任一或兩個(gè)末端包含二元醇(如四乙二醇或六乙二醇)的寡核苷酸還顯示出充分抵抗核酸酶降解。本發(fā)明的寡核苷酸是包含發(fā)現(xiàn)引起免疫應(yīng)答的特異序列的核酸。引起免疫應(yīng)答的這些特異序列被稱作"免疫刺激基序"，包含免疫刺激基序的寡核苷酸被稱作"免疫剌激核酸分子"和等同地"免疫刺激核酸"或"免疫刺激寡核苷酸"。因此本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸包括至少一個(gè)免疫刺激基序。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫刺激基序是"內(nèi)部免疫刺激基序"。術(shù)語"內(nèi)部免疫刺激基序"是指基序序列在更長的寡核普酸序列內(nèi)的位置，所述寡核苷酸序列比基序序列長度至少長一個(gè)核苷酸，其與免疫刺激基序序列的5，和3，末端相連。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，免疫刺激寡核苷酸包括免疫刺激基序，其是"CpG二核苷酸"。CpG二核苷酸可以被甲基化或未甲基化。包含至少一個(gè)未甲基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸是包含未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸序列(即，未曱基化5，胞嘧咬核苷接著與3'鳥嘌呤核苷通過磷酸酯鍵相連)并且激活免疫系統(tǒng)的寡核苷酸分子；這種免疫剌激寡核苷酸是CpG寡核苷酸。CpG寡核苷酸在很多公布的專利、公布的專利申請和其它出版物中有所描述，包括美國專利號6,194,388;6，207，646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。包含至少一個(gè)曱基化CpG二核苷酸的免疫刺激寡核苷酸是包含甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核普酸序列(即，甲基化5，胞嘧咬核苷接著與3，鳥嘌呤核苷通過磷酸酯鍵相連)并且激活免疫系統(tǒng)的寡核苷酸。在其它實(shí)施方案中，免疫刺激寡核苷酸沒有CpG二核苷酸。沒有CpG二核苷酸的這些寡核苷酸被稱作非CpG寡核苷酸，它們具有非CpG免疫刺激基序。因此，本發(fā)明還包括具有其它類型免疫刺激基序(可以被甲基化或未甲基化)的寡核苷酸。本發(fā)明的免疫刺激寡任一組合。關(guān)于CpG寡核苷酸，最近描述有不同類的CpG寡核苷酸。一類可以有效激活B細(xì)胞，但是在誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞激活方面較弱；這一類被稱作B類。B類CpG核酸一般是完全穩(wěn)定的，并且在一些優(yōu)選堿基環(huán)境中包括未曱基化CpG二核香酸。參見，例如，美國專利號6,194,388;6,207,646;6,214,806;6,218,371;6,239,116;和6,339,068。另一類可有效誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞激活，但是在激活B細(xì)胞方面較弱；這一類^皮稱作A類。A類CpG核酸一般在5，和3'末端具有穩(wěn)定化的poly-G序列和包含回文磷酸二酯CpG二核苷酸的至少6個(gè)核香酸的序列。參見，例如，公布的專利申請PCT/USOO/26527(WO01/22990)。另一類CpG核酸激活B細(xì)胞和NK細(xì)胞，并誘導(dǎo)IFN-a，這一類被稱為C類。如最初所表征的，C類CpG核酸一般是完全穩(wěn)定的，包含B類型的序列和富含GC的回文序列或近似回文序列。這一類在共同待決的提交于2002年8月19日的美國專利申請US10/224，523中有所描述，此處引入全部內(nèi)容作為參考。因此，本發(fā)明在一個(gè)方面包括如下發(fā)現(xiàn)，即具有嵌合骨架的CpG免疫刺激寡核苷酸的特定亞類高效介導(dǎo)免疫刺激效應(yīng)。這些CpG核酸可治療和預(yù)防性用于刺激免疫系統(tǒng)，從而治療癌癥、感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)、哞喘、自身免疫病和其它病癥，并幫助保護(hù)癌癥化學(xué)治療后的機(jī)會(huì)感染。這種來自CpG刺激的強(qiáng)烈而平衡的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答反映了機(jī)體自身的抵抗入侵病原體和癌細(xì)胞的自然防御系統(tǒng)。在一方面，本發(fā)明包括如下發(fā)現(xiàn)，即一亞類CpG免疫刺激寡核苷酸具有改良的免疫刺激性質(zhì)和降低的腎臟炎性作用。在某些實(shí)例中，在已經(jīng)施用完全硫代磷酸酯寡核苷酸的受試者中觀察到腎臟炎癥。認(rèn)為此處所描述的嵌合寡核苷酸比完全硫代磷酸酯寡核苷酸引起更少的腎臟炎癥。此外這些寡核苷酸可以高效刺激免疫應(yīng)答。因此，分子的磷酸二酯區(qū)不會(huì)減少它的有效小生。提及寡核苷酸的核苷酸間鍵時(shí)所用的符號*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。只要寡核苷酸包括至少2-3個(gè)磷酸二酯核苷酸間鍵，沒有用*標(biāo)記的核普酸間鍵就可以是穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸優(yōu)選包括3-6個(gè)磷酸二酯鍵。在某些實(shí)例中CG基序間的鍵是磷酸二酯，在其它實(shí)例中，它們是疏代磷酸酯或其它穩(wěn)定的鍵。提及寡核苷酸的核苷酸間鍵時(shí)所用的符號一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。術(shù)語"核酸"和"寡核苷酸"還包括具有取代或修飾(如在堿基和/或糖中)的核酸或寡核苷酸。例如，它們包括具有在2，位共價(jià)結(jié)合到低分子量有機(jī)基團(tuán)而不是羥基和在5，位不是磷酸基或羥基的骨架糖的寡核苷酸。因此經(jīng)修飾寡核苷酸可以包括2，-0-烷基化核糖基團(tuán)。此外，經(jīng)修飾寡核苷酸可以包括諸如阿拉伯糖或2，-氟阿拉伯糖而不是核糖的糖。從而在骨架組成上寡核苷酸可以是異質(zhì)的，從而含有結(jié)合在一起的聚合體單元的任何可能組合，如肽-核酸(具有具核酸堿基的氨基酸骨架)。寡核苷酸還包括取代的嘌呤和嗜啶，如C-5丙炔嗜咬和7-脫氮-7-取代的嘌呤修飾的堿基。WagnerRW等人(1996)NatBiotechnol14:840-4。嘌呤和嘧啶包括(但不限于)腺嘌呤、胞嘧啶、鳥噤呤、胸腺嘧啶、5-曱基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-M-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤，以及其它具有取代和非取代的芳香部分的天然和非天然發(fā)生的核堿基。其它的這種修飾對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是眾所周知的，下文描述了很多這種修飾。與天然的RNA和DNA相比，本發(fā)明的免疫刺激寡核苷酸可以包括多種化學(xué)修飾和取代，包括磷酸二酯核苷酸間橋、p-D-核糖單元和/或非天然核苷酸堿基(腺嘌呤、鳥噤呤、胞嘧啶、胸腺嗜啶、尿嘧咬)?；瘜W(xué)修飾的實(shí)例對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是眾所周知的，并且描述于UhlmannEetal.(1990)ChemRev90:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs"SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal，Ed，HumanaPress,Totowa，USA1993;CrookeSTetal.(1996)AnnuRevPharmacolToxicol36:107-129;和HunzikerJetal.(1995)ModSynthMethods7:331-417。按照本發(fā)明的寡核苷酸可以具有一種或多種修飾，其中與由天然DNA或RNA所組成的相同序列的寡核苷酸相比，每種修飾位于特定的磷酸二酯核苷酸間橋和/或位于特定的p-D-核糖單元和/或位于特定的天然核苷酸堿基位置。例如，本發(fā)明涉及可以包含一種或多種修飾的寡核苷酸，其中每種修飾獨(dú)立地選自a)用修飾的核苷酸間橋取代位于核苷酸3，和/或5'末端的磷酸二酯核苷酸間橋，b)用脫磷酸橋取代位于核苦酸3，和/或5，末端的磷酸二酯橋，c)用另一個(gè)單元取代糖磷酸骨架中的糖磷酸單元，d)用經(jīng)修飾的糖單元取代p-D-核糖單元，e)用經(jīng)修飾的核苷酸堿基取代天然核苷酸堿基。寡核苷酸化學(xué)修飾的更詳細(xì)的實(shí)例如下。可以用經(jīng)修飾的核苷酸間橋取代位于核苷酸3，和/或5，末端的磷酸二酯核苷酸間橋，其中經(jīng)修飾核苷酸間橋選自諸如硫代磷酸酯、磷酸乙酯、二硫代磷酸酯、NRiR、氨基磷酸酯、硼代膦酸酯、a-羥基節(jié)基膦酸酯、磷酸-(CVC20-O-烷基酯、磷酸-(C6-d2)芳基-(d-Qn)-0-烷基酯、(Q-Q)烷基膦酸酯和/或(C6-Cu)芳基膦酸酯橋、(Od2)-a-羥基甲基-芳基(例如，公開于WO95/01363)，其中(CVd2)芳基、(C6-C加)芳基和(CVC")芳基可被卣素、烷基、烷氧基、硝基、H&任選取代，并且Ri和RZ互相獨(dú)立地是氫、(d-Cs)烷基、(C6-C加)-芳基、(C6-d4)-芳基-(d-Cs)-烷基，優(yōu)選氫、(d-Q)烷基，優(yōu)選(d-C4)-烷基和/或曱氧基乙基，或者Ri和R"與攜帶它們的氮原子一起形成5-6元雜環(huán)，其可以進(jìn)一步包含選自基團(tuán)O，S，和N的額外雜原子。用脫磷酸橋(例如，脫砩酸橋描述于UhlmannE和PeymanA，"MethodsinMolecularBiology",Vol.20，"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs",S.Agrawal，編輯，Humana出版社，Totowa1993，第16章，pp.355ff)取代位于核苷酸3，和/或5，末端的磷酸二酯橋，其中脫磷酸橋例如選自脫磷酸橋甲縮醛(formacetal)、3'國硫代甲縮醛(3'國thioformacetal)、甲基羥胺、肟、亞曱基二曱基-l，2-亞肼基、二亞甲基砜和/或甲硅烷基?？梢杂昧硪粋€(gè)單元取代糖磷酸骨架(即，糖磷酸骨架由糖磷酸單元組成)中的糖磷酸單元(即，p-D-核糖和磷酸二酯核普酸間橋共同形成糖磷酸單元)，其中另一個(gè)單元(例如)適合建立"嗎啉代衍生物"寡聚體(如StirchakEP等人(1989)NucleicAcidsRes17:6129-41中所描述的)，即，用嗎啉代衍生物單元取代；或者增加聚酰胺核酸("PNA";如NielsenPE等人(1994)BioconjugChem5:3-7中所描述的)，即，用PCA骨架單元(如2-氮基乙基甘氨酸)取代。可以用經(jīng)修飾的糖單元取代p-核糖單元或者p-D-2，-脫氧核糖單元，其中經(jīng)修飾的糖單元諸如選自P-D-核糖、a-D-2，-脫氧核糖、L-2，-脫氧核糖、2，-F-2，畫脫氧核糖、2，-F-阿拉伯糖、2，-0-(d-C6)烷基-核糖，2，-0-(d-C6)烷基-核糖優(yōu)選為2'-0-甲基核糖、2，-0-(CVC6)鏈烯基-核糖、2，--N，N，N-甲基硫酸三乙銨)后重復(fù)此實(shí)驗(yàn)。ODN與DOTAP的比率恒定保持在ljiMODN對10fig/mlDOTAP。圖3B顯示，與DOTAP絡(luò)合之后，半軟ODN(SEQIDNO:26)能夠激活TLR。實(shí)施例6:具有經(jīng)修飾的接頭的短ODN誘導(dǎo)人PBMC中細(xì)胞因子表達(dá)的能力檢驗(yàn)與實(shí)施例5中相同的ODN誘導(dǎo)PBMC中細(xì)胞因子表達(dá)的能力。在加入細(xì)胞中之前，ODN預(yù)先與DOTAP絡(luò)合。ODN與DOTAP的比率恒定保持在lnMODN對10ng/mlDOTAP。如圖4A所示，ODN顯示出不同的i秀導(dǎo)IFN-a分泌的活性。半軟ODN(SEQIDNO:26)和具有未修飾接頭的ODN顯示出最強(qiáng)的誘導(dǎo)圖語。對照ODN(SEQIDNO:38)甚至在非常低的濃度下也能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的IFN-a分泌。對于IL-10,對照ODN也會(huì)在所有的檢驗(yàn)濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌。檢驗(yàn)ODN都不顯示出IL-10分泌的強(qiáng)^l"導(dǎo)(圖4B)。當(dāng)監(jiān)視IL-6的分泌時(shí)，可以觀察到不同的圖鐠。用具有曱基膦酸酯和砩酸乙酯接頭(SEQIDNO:36和SEQIDNO:37)的ODN看到強(qiáng)誘導(dǎo)，而未修飾接頭顯示出較低的應(yīng)答。硫代磷酸酯ODN(SEQIDNO:25)顯示出較低低的誘導(dǎo)，半軟ODN(SEQIDNO:26)的誘導(dǎo)水平接近對照ODN(SEQIDNO:38)(圖4C)。IFN-y細(xì)胞因子的分泌再次顯示出不同的圖鐠。通過接觸半軟或未修飾ODN容易地實(shí)現(xiàn)分泌。具有曱基膦酸酯和磷酸乙酯接頭的ODN僅僅顯示出中等誘導(dǎo)，而對照ODN(SEQIDNO:38)則不能誘導(dǎo)IFN-y的分泌(圖4D)。實(shí)施例7:具有經(jīng)修飾的接頭的寡二核苷酸誘導(dǎo)在人PBMC中細(xì)胞因子表達(dá)的能力檢驗(yàn)5種具有不同接頭的GC二核苷酸誘導(dǎo)在PBMC中細(xì)胞因子分泌的能力。在加入細(xì)胞中之前，ODN預(yù)先與DOTAP以在ljiMODN對10ng/mlDOTAP的比率絡(luò)合。ODN二核苷酸在高濃度下能夠誘導(dǎo)IFN-a的分泌(圖5A)。如在實(shí)施例6中所觀察到的，對照ODN(SEQIDNO:38)在所有的檢驗(yàn)濃度下都能夠誘導(dǎo)IFN-a分泌。細(xì)胞因子IL-10的分泌顯示出相似的誘導(dǎo)圖鐠。ODN(SEQIDNO:38)在所有的檢驗(yàn)濃度下都能夠誘導(dǎo)IL-IO。3，氨基己基修飾的ODN(SEQIDNO:40)不展示出誘導(dǎo)IL-10分泌的能力(圖5B)。當(dāng)監(jiān)視IL-6細(xì)胞因子的分泌時(shí)，出現(xiàn)不同的圖諳。對照ODN(SEQIDNO:38)在每種檢驗(yàn)濃度下都能夠誘導(dǎo)中等水平的IL-6分泌。所有的二核苷酸ODN都能夠比對照ODN(SEQIDNO:38)誘導(dǎo)更高水平的IL-6，但是僅限于在更高的濃度下(圖5C)。實(shí)施例8:雙二核苷酸(C-G-L)-2doub-but資導(dǎo)在人PBMC中IFN-a分泌的能力圖6A顯示在人PBMC接觸ODN(C-G-L)-2doub-but(SEQIDNO:43)和陽性對照ODN(SEQIDNO:38)后從這些細(xì)胞中分泌的IFN-a的水平。沿X軸描繪ODN的濃度(nM)。ODN與DOTAP的比率恒定保持在4nMODN對10ng/mlDOTAP。將ODN預(yù)先與DOTAP絡(luò)合后將絡(luò)合物加入到PBMC。兩種ODN都能夠誘導(dǎo)IFN-a的分泌，盡管ODN(SEQIDNO:38)在更低的濃度下有活性。如圖6B所示，(C-G-L)-2doub-butODN不誘導(dǎo)IL-10的分泌(與對照ODN相比)。對于IL-6細(xì)胞因子，(C-G-L)-2doub-but在更高的濃度下誘導(dǎo)其分泌，但是只使用DOTAP的陰性對照實(shí)驗(yàn)顯示出類似的誘導(dǎo)(圖6C)。表4:ODN序列<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>認(rèn)為前面所寫的說明書足以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不限于所提供的實(shí)施例限制的范圍，因?yàn)閷?shí)施例是作為本發(fā)明一個(gè)方面的單一例證，其它功能等同的實(shí)施方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除了此處所顯示和描述的之外，從前面的描述中，本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和目標(biāo)不一定包括在本發(fā)明的每一個(gè)實(shí)施方案中。權(quán)利要求1.長度為3到24個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸和至少4T核苷酸，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嘧啶堿基的核苷酸，Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥嘌呤的核苷酸，并且其中該寡核苷酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。2.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括TTTT基序。3.權(quán)利要求2的寡核苷酸，其中該寡核苷酸只有一個(gè)YZ二核苷酸。4.權(quán)利要求3的寡核苷酸，其中該寡核苷酸是GTC—G*T*T*T*T*G*A*C(SEQIDNO.:16)或G*T*T*T*T*G*A*C—G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:11)，其中*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。5.權(quán)利要求2的寡核苷酸，其中該寡核苷酸只有兩個(gè)YZ二核苷酸。6.權(quán)利要求5的寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自T*C—G*T*T*T*T*G*A*CGTT(SEQIDNO.:3)、T*C—GTCG*T*T*T*T*G*A*C(SEQIDNO.:10)、G頭t頭tatat^G^A^ac！g先下w丁頭tatag^tagG六T論T(is￡c}IDNO12)、G*T*C_G*T*T*T*T*G*A*C—G*T*T(SEQIDNO.:13)、T*cg*TTT*T*G*A*C—G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:14)和G*T*C—G*T*T*T*T*G*A*C_G*T*T*T*T*G*T*C(SEQIDNO.:15)，其中*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，_是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。7.權(quán)利要求2的寡核苷酸，其中該寡核苷酸只有三個(gè)YZ二核苷酸。8.權(quán)利要求7的寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自t^cgatwt^t^t^gaa^cg^TaT^T^T^G^TaCg*t^t(iseqIDNO'2)、G^t^CG^tatat^t^G^aacg^TaTaT^T^GaT^CGaT^T(seqidno"8)、tacg^t^cg^tat^t^t^gaaacg^TaTaT^T^G^T^C(SEQIDno.:9)和t*C_G*T*C—G*t*t*t*t*G*A*C(SEQIDno.:10)，其中*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。9.權(quán)利要求2的寡核苷酸，其中該寡核苷酸只有四個(gè)YZ二核苷酸。10.權(quán)利要求9的寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自T*CG*T*CG*T*T*TT*G*A*CG*T*T*T*T*G*T*CG*T*T(SEQIDNO.:4)、T*CG*T*CG*T*T*TT*G*A*CG*T*T*TT*G*T*CG*T*T(SEQIDNO.:5)、T*CG*T*CG*TT*TT*GA*CG*TT*TT*GT*CG*T*T(SEQIDNO.:6)、GG頭TA(Z!GAT^T^T+TAGAA^AGGAT論T論T^T^GATAGG*T*T(SEC)IDNO.:17)、TAGI先T頭C!i先T頭T頭TAT頭G頭A^AGlAT^T六T頭TAG頭T女Gl女T頭TIDNO.:18)、T*MeC—G*T*MeC—G*T*T*T*T*G*A*MeC—G*TTT*T*G*T*MeC—G*T*T(SEQIDNO.:19)、T*HG*T*HG*T*T*T*T*G*A*HG*T*T*T*T*G*T*HG*T*T(SEQIDNO.:20)、T*c7*T*C"T*T*T*T*G*A*C"T*T*T*T*G*T*C"T*T(1SEQIDNO.:21)和U*cg*U*C_G*U*U*U*U*G*A*C_G*U*U*U*U*G*U*C—g*U*U(SEQIDNO.:22)，其中*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵，其中I是指包含次黃嘌呤堿基的次黃苷；MeC是5，-甲基-胞嘧啶，H是5-羥基-胞嘧啶，7是7-脫氮-鳥嘌呤，U是尿嘧啶。11.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中每個(gè)YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵。12.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中Y是包含未曱基化胞嘧啶的核苷酸。13.權(quán)利要求l的寡核苷酸，其中Z是包含鳥嘌呤的核苷酸.14.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中磷酸二酯樣鍵是硼代膦酸酯或者非對映純的Rp硫代磷酸酯。15.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中穩(wěn)定化的核苷酸間鍵選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、曱基硫代磷酸酯和其任一組合。16.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中Y是包含選自5-曱基胞嘧啶、5-甲基異胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-卣代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶和氫的胞嗜啶或經(jīng)修飾的胞嗜咬堿基的核苷酸。17.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中Z是包含選自7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤，如7-脫氮-7-(QrC6)炔基鳥嘌呤，7-脫氮-8-取代的鳥噤呤、次黃嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基噤呤、噤呤、8-取代的鳥嘌呤，如8-羥基鳥嘌呤，以及6-硫鳥嘌呤、2-氮基嘌呤和氫的鳥嘌呤或經(jīng)<資飾的鳥噤呤堿基的核苷酸。18.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有3，-3，鍵，其具有一個(gè)或兩個(gè)可接近的5'末端。19.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有兩個(gè)可接近的5，末端，每一個(gè)都是5，TCG。20.長度為2到7個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有至少一個(gè)YZ二核苷酸，該YZ二核苷酸具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嗜咬堿基的核苷酸，其中Z是包含鳥噪呤或經(jīng)^f務(wù)飾的鳥噤呤的核苷酸，并且其中該寡核苷酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。21.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中該寡核苷酸只有一個(gè)YZ二核苷酸。22.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中該寡核苷酸選自t*g*T*C*G*T*T(SEQIDNO.:23)、T*G*T*C_GTT(SEQIDNO.:24)、G*T*C*G*T*T(SEQIDNO.:25)、G*T*C_G*T*T(SEQIDNO.:26)、G*T*C*G*T(SEQIDNO.:27)、G*T*C—G*T(SEQIDNO.:28)、T*c*G*T*T(SEQIDNO.:29)、T*C_G*T*T(SEQIDNO.:30)和C—G(SEQIDNO.:31)，其中*是指存在穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，一是指存在磷酸二酯核苷酸間鍵。23.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中Y是未曱基化的C。24.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中Z是包含鳥噤呤的核苷酸.25.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中所述穩(wěn)定化的核苷酸間鍵是硫代磷酸酯。26.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中Y是包含選自5-甲基胞嘧啶、5-曱基異胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-卣代胞嘧啶、尿嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、5-氟尿嗜啶和氫的胞嘧啶或經(jīng)修飾的胞嘧咬威基的核苷酸。27.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中Z是包含選自7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的烏嘌呤，如7-脫氮-7-(QrC6)炔基鳥嘌呤，7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤、次黃嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基噪呤、嘌呤、8-取代的鳥嘌呤，如8-羥基鳥噤呤，以及6-硫鳥噤呤、2-氨基噤呤和氫的鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥噤呤堿基的核苷酸。28.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有3，-3，鍵，其具有一個(gè)或兩個(gè)可接近的5'末端。29.權(quán)利要求20的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有兩個(gè)可接近的5，末端，每一個(gè)都是5，TCG。30.長度為7個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中該寡核苷酸具有至少一個(gè)CG二核苷酸，其中該寡核香酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。31.權(quán)利要求30的寡核苷酸，其中所有的核苷酸間鍵都是硫代磷酸酉百32.長度為5到7個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其中該寡核苷酸包含GTCGT或TCGTT,并且其中該寡核苷酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷33.權(quán)利要求32的寡核苷酸，其中所有的核苷酸間鍵都是硫代磷酸酯鍵。34.包含至少一個(gè)具有磷酸乙酯或甲基膦酸酯鍵的YZ二核苷酸的寡核苷酸，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嘧咬堿基的核苷酸，其中Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥嘌呤的核苷酸。35.權(quán)利要求34的寡核苷酸，其中該寡核苷酸長度為4-100個(gè)核苷酸。36.寡核苷酸，其包含至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嘧咬堿基的核苷酸，其中Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥嘌呤的核苷酸，并且其中該寡核苷酸在其3'末端含有氨基己基基團(tuán)。37.寡核苷酸，其包含至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嘧咬堿基的核普酸，其中Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥噤呤的核苷酸，并且其中該寡核苷酸在其5'末端含有氨基己基基團(tuán)。38.寡核苷酸，其包含至少一個(gè)具有磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷酸間鍵的YZ二核苷酸，其中Y是包含嘧啶或經(jīng)修飾的嘧咬堿基的核苷酸，其中Z是包含鳥嘌呤或經(jīng)修飾的鳥嘌呤的核苷酸，并且其中該寡核苷酸在其5，和3，末端含有氨基己基基團(tuán)。39.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中該寡核苷酸包括至少一個(gè)穩(wěn)定化的核苷酸間鍵。40.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中該寡核苷酸長度為4-100個(gè)核苷酸。41.權(quán)利要求36-38任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中Y是包含未甲基化胞嘧啶的核普酸。42.治療癌癥的方法，其包括對患有癌癥的受試者施用治療癌癥有效量的權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的寡核苷酸。43.治療變態(tài)反應(yīng)的方法，其包括對患有變態(tài)反應(yīng)或有變態(tài)反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用治療變態(tài)反應(yīng)有效量的權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的寡核苷酸。44.治療哞喘的方法，其包括對患有哞喘的受試者施用治療津喘有效量的權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的寡核苷酸。45.治療感染性疾病的方法，其包括包含對患有感染性疾病或有感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用治療感染性疾病有效量的權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)的寡核苷酸。46.包含權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)所述的寡核苷酸和可藥用載體的藥物。47.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)所述的寡核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防受試者中病毒、真菌、細(xì)菌或寄生蟲感染的方法中。48.權(quán)利要求47的用途，其中所述病毒感染是由乙型肝炎病毒引起的。49.權(quán)利要求47的用途，其中所述病毒感染是由丙型肝炎病毒引起的。50.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)所述的寡核普酸在制造用于治療或預(yù)防受試者中癌癥的方法的藥物中的用途。51.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)所述的寡核苷酸在制造用于治療或預(yù)防受試者中哞喘或變態(tài)反應(yīng)的方法的藥物中的用途。52.權(quán)利要求1-41任一項(xiàng)所述的寡核苷酸在制造藥物中的用途，所述藥物在免疫治療/化學(xué)治療之前、與之一起或之后施用。全文摘要本發(fā)明涉及一類可用于刺激免疫應(yīng)答的短CpG免疫刺激寡核苷酸。這些短寡核苷酸優(yōu)選為軟或者半軟的寡核苷酸。文檔編號C12N15/117GK101160401SQ200680012811公開日2008年4月9日申請日期2006年2月24日優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日發(fā)明者A·M·克里格,J·沃爾默,U·薩姆洛維茨申請人:科勒制藥集團(tuán)公司;科勒制藥有限公司