專利名稱：能夠刺激粘膜免疫性的乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸菌和含有這些細(xì)菌、更具體來說是能夠刺激粘膜免疫性的乳酸菌的組合物，以及含有這些細(xì)菌的食品和飲料。
背景技術(shù)：
在植物性食品例如泡菜、辣泡菜(朝鮮泡菜)、面包、清酒(日本酒)、日本豆醬和醬油中檢測到了多種乳酸菌。東京農(nóng)業(yè)大學(xué)的Sanae Okada教授將在植物性食品中檢測到地乳酸菌命名為“植物性乳酸菌”，并建議將它們與來自動物性食物例如發(fā)酵奶和乳酪中的乳酸菌區(qū)分開來(Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria，Vol.13，No.1，pp.23-36(2002))。這是因?yàn)橹参镄匀樗峋谏L環(huán)境上與動物性乳酸菌不同，能夠利用更多種的糖類，并使它們自己適應(yīng)在抗細(xì)菌物質(zhì)抗性、酶抗性、氧抗性等方面更嚴(yán)酷的環(huán)境。
本發(fā)明人研究了這些植物性乳酸菌，已經(jīng)報(bào)道了使用植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ONC141作為起始菌種制備的發(fā)酵奶具有下列性能改善人胃腸道微生物群落(Megumi Kumemura，Masamichi Toba，Yoshiro Sogawa，Seiichi Shimizu，Shinzo Kawaguchi，“腸細(xì)菌學(xué)雜志(Enterobacteriology Magazine)”15，15，(2001))；增加便秘成年人的排便頻率(Masamichi Toba，Megumi Kumemura，Satoshi Muneyuki，YoshiroSogawa，Hisao Yoshizawa，Yoichi Yajima，Yutaka Matsuda，HajimeIijima“腸細(xì)菌學(xué)雜志(Enterobacteriology Magazine)”15，21，(2001))；以及增加了宿主對病原性鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)引起的口腔感染的抗性(IgA產(chǎn)量增加，胃腸道粘膜刺激)(Takeshi Ikenaga，Satoko Yamahira，Hideki Nachi，Masamichi Toba，Hiroshi Okamatsu，“乳制品科學(xué)(Milk Science)”，Vol.51，No.1，pp.27-32(2002))。
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ONC141(發(fā)酵奶)在已知的植物性和動物性乳酸菌中具有最高的增強(qiáng)宿主對沙門氏菌感染抗性的效應(yīng)，因此被認(rèn)為能夠增強(qiáng)粘膜免疫功能，對人類宿主防御非常有用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的乳酸菌，它們與本發(fā)明人已經(jīng)研究和開發(fā)的那些乳酸菌相比，具有更高的粘膜免疫刺激能力和增強(qiáng)宿主防御機(jī)制的能力，并可以用做微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，此外還提供了含有這些乳酸菌的終端產(chǎn)品(食品和飲料，例如發(fā)酵奶和乳酸菌飲料)。
本發(fā)明人新近獲得了許多不同的微生物，并使用小鼠派伊爾淋巴結(jié)(Peyer’s Patch)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)試驗(yàn)了它們誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了兩株乳酸菌，具有特別優(yōu)良的誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力。
本發(fā)明人在這個(gè)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了下列1到15條中概括的發(fā)明。
第一條、選自乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)的乳酸菌菌株。
第二條、第一條中的乳酸菌菌株，該菌株是乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)。
第三條、第一條中的乳酸菌菌株，該菌株是乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
第四條、含有第一條的乳酸菌菌株和食用載體或可藥用的賦形劑或稀釋劑的組合物，該組合物能夠刺激粘膜免疫。
第五條、第四條中的組合物，該組合物是食品或飲料的形式。
第六條、第五條中的組合物，該組合物是發(fā)酵奶、乳酸菌飲料、發(fā)酵植物性飲料、發(fā)酵水果飲料、或發(fā)酵豆奶飲料。
第七條、在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象給藥第一到第三條之一的乳酸菌。
第八條、在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象給藥第四到第六條之一的組合物。
第九條、在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象給藥第一到第三條之一的乳酸菌。
第十條、在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象給藥第四到第六條之一的組合物。
第十一條、第一到第三條之一的乳酸菌在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用。
第十二條、第四到第六條之一的組合物在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用。
第十三條、第一到第三條之一的乳酸菌在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用。
第十四條、第四到第六條之一的組合物在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用。
第十五條、第一到第三條之一的乳酸菌在制備第四到第六條之一的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的乳酸菌菌株和含有細(xì)菌的本發(fā)明的組合物將在下面描述。
本發(fā)明的乳酸菌菌株
本發(fā)明的乳酸菌菌株是新近從天然產(chǎn)品中通過下面描述的分離和篩選方法分離和獲得的，并已經(jīng)由本發(fā)明人保藏。這些菌株被命名為乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
(1)篩選
(1-1)源微生物
所用的源微生物是從人類腸道內(nèi)含物、植物性食品和動物性食品中分離并在Otsuka制藥有限公司的Otsu Nutraceuticals研究所中保存的乳酸菌。
(1-2)篩選方法
靶菌株的篩選是使用小鼠派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)利用誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生能力作為指標(biāo)來進(jìn)行的。詳細(xì)的篩選方法在下面的實(shí)施例2中進(jìn)行描述。
(2)通過篩選獲得的微生物
(2-1)乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239
(a)宏觀特征
(a-1)MRS瓊脂培養(yǎng)基
圓形到輕微不規(guī)則形，半球狀，光滑，乳白
(a-2)BL瓊脂培養(yǎng)基
圓形到輕微不規(guī)則形，半球狀，光滑，棕白
(b)微觀特征
桿菌，無運(yùn)動性，無孢子
(c)最適生長溫度
30到33℃
(d)生理和生化特征
革蘭氏染色能力陽性
糖類利用
甘油 -
赤蘚糖醇 -
D-阿拉伯糖 -
L-阿拉伯糖 -
核糖 ±
D-木糖 ±
L-木糖 -
核糖醇 -
β-甲基-D-木糖苷 -
半乳糖+
D-葡萄糖 +
D-果糖+
D-甘露糖 +
L-山梨糖 -
鼠李糖-
半乳糖醇 -
環(huán)己六醇 -
甘露糖醇 -
山梨糖醇 +
α-甲基-D-甘露糖苷+
α-甲基-D-葡萄糖苷±
N-乙基-葡萄糖胺 +
扁桃苷+
對苯二酚葡萄糖苷 +
七葉苷+
水楊苷+
纖維二糖 +
麥芽糖+
乳糖 +
蜜二糖+
蔗糖 +
海藻糖+
菊糖 -
松三糖-
D-棉子糖 +
Amidon-
糖原 -
木糖醇-
龍膽二糖+
D-松二糖-
D-來蘇糖-
D-塔格糖-
D-巖藻糖-
L-巖藻糖-
D-阿拉伯糖醇±
L-阿拉伯糖醇-
葡萄糖酸-
2-酮-葡萄糖酸 -
5-酮-葡萄糖酸 -
按照Bergey’s系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中顯示的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)上面的各種特征，將獲得的分離株鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，并命名為乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239，于2003年8月6日保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu)，國立高等工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院國際專利生物保藏中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-keb，日本，登記號為FERM P-19469。然后它根據(jù)布達(dá)佩斯公約被轉(zhuǎn)移到一個(gè)國際保藏中心，收到的登記號為FERM BP-10064。
(2-2)乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240
(a)宏觀特征
(a-1)MRS瓊脂培養(yǎng)基
圓形到輕微不規(guī)則形，半球狀，光滑，乳白
(a-2)BL瓊脂培養(yǎng)基
圓形到輕微不規(guī)則形，半球狀，光滑，棕白
(b)微觀特征
桿菌，無運(yùn)動性，無孢子
(c)最適生長溫度
30到33℃
(d)生理和生化特征
革蘭氏染色能力陽性
糖類利用
甘油-
赤蘚糖醇-
D-阿拉伯糖 -
L-阿拉伯糖 -
核糖±
D-木糖 -
L-木糖 -
核糖醇 -
β-甲基-D-木糖苷-
半乳糖 +
D-葡萄糖+
D-果糖 +
D-甘露糖+
L-山梨糖-
鼠李糖 -
半乳糖醇±
環(huán)己六醇-
甘露糖醇+
山梨糖醇+
α-甲基-D-甘露糖苷 -
α-甲基-D-葡萄糖苷 -
N-乙基-葡萄糖胺 +
扁桃苷 +
對苯二酚葡萄糖苷+
七葉苷 +
水楊苷 +
纖維二糖+
麥芽糖 +
乳糖 +
蜜二糖 +
蔗糖 +
海藻糖 -
菊糖 -
松三糖 -
D-棉子糖 +
Amidon -
糖原 -
木糖醇 -
龍膽二糖 +
D-松二糖 -
D-來蘇糖 -
D-塔格糖 -
D-巖藻糖 -
L-巖藻糖 -
D-阿拉伯糖醇 -
L-阿拉伯糖醇 -
葡萄糖酸 -
2-酮-葡萄糖酸 -
5-酮-葡萄糖酸 -
按照Bergey’s系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊中顯示的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)上面的各種特征，將獲得的分離株鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)菌株，并命名為乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240，于2003年8月6日保藏在獨(dú)立的管理機(jī)構(gòu)，國立高等工業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院國際專利生物保藏中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-keb，日本，登記號為FERM P-19470。然后它根據(jù)布達(dá)佩斯公約被轉(zhuǎn)移到一個(gè)國際保藏中心，收到的登記號為FERM BP-10065。
本發(fā)明的組合物
本發(fā)明的組合物主要含有本發(fā)明的乳酸菌菌株作為活性成分。該組合物可以通過使用適當(dāng)?shù)目墒秤玫妮d體(食品材料)制備成食品、飲料或藥物產(chǎn)品的形式。該組合物也可以通過使用適當(dāng)?shù)目伤幱玫馁x形劑或稀釋劑制備成藥物產(chǎn)品的形式。
本發(fā)明的組合物獲得的顯著的粘膜免疫刺激和增強(qiáng)IgA產(chǎn)生被認(rèn)為是如下導(dǎo)致的作為腸免疫系統(tǒng)的組成部分的派伊爾淋巴結(jié)M細(xì)胞在細(xì)胞腔中接受了抗原。該抗原由抗原呈遞細(xì)胞例如樹突細(xì)胞呈遞到CD4 T細(xì)胞。當(dāng)未成熟的B細(xì)胞通過T細(xì)胞的抗原特異性反應(yīng)成熟成為IgA抗體產(chǎn)生細(xì)胞時(shí)，B細(xì)胞移動到固有層黏膜最終分化成IgA抗體分泌細(xì)胞。盡管尚不清楚本發(fā)明的乳酸菌是如何參與IgA產(chǎn)生的增強(qiáng)機(jī)制的，至少派伊爾淋巴結(jié)M細(xì)胞對抗原的攝取對由本發(fā)明細(xì)菌的存在而引起的IgA產(chǎn)生的增強(qiáng)是必需的。因此，本發(fā)明的乳酸菌被推測其功能是作為這樣的抗原。為了作為抗原起作用，本發(fā)明的乳酸菌不必是活細(xì)胞。細(xì)菌可以通過常規(guī)的熱消毒方法進(jìn)行滅菌。但是，正如眾所周知的那樣，攝取酵奶等中活的乳酸菌由于腸道內(nèi)的調(diào)節(jié)和腸道內(nèi)的微生物群落平衡效應(yīng)，對于健康的維護(hù)和持久是有效的，攝取活的本發(fā)明的乳酸菌也預(yù)期具有這些效應(yīng)，因此在優(yōu)選情況下活的乳酸菌被包含在本發(fā)明的組合物中。
這些乳酸菌(活細(xì)胞)可以以例如培養(yǎng)物、這些培養(yǎng)物的粗產(chǎn)物或純化產(chǎn)物及其凍干粉的形式被包含在本發(fā)明的組合物中。
一般來說，培養(yǎng)物可以通過各種方法獲得，包括在適合每個(gè)菌株的培養(yǎng)基，例如MRS培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)大約16小時(shí)。
培養(yǎng)后，細(xì)胞可以通過例如將培養(yǎng)液在4℃以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心大約10分鐘來回收。它們可以以常規(guī)的方式純化，也可以被凍干。這樣獲得的凍干粉也可以被用做本發(fā)明的組合物的活性成分。
如果需要，組合物中可以補(bǔ)充適當(dāng)量的適合本發(fā)明的微生物維持和生長的營養(yǎng)物質(zhì)。具體的例子包括用于培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)，例如各種碳源如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等，氮源例如酵母提取物、蛋白胨等，維生素、礦物質(zhì)、微量金屬元素和其它營養(yǎng)物質(zhì)。這些維生素的例子包括維生素B、維生素D、維生素C、維生素E和維生素K。這些微量金屬元素的例子包括鋅、硒等。其它的營養(yǎng)物質(zhì)的例子包括各種寡糖例如乳糖蔗糖、大豆寡糖、乳果糖、乳糖醇、果糖寡糖以及半乳糖寡糖。這些寡糖摻入的量沒有特別的限制，但是優(yōu)選情況下其在本發(fā)明的組合物中的濃度為重量比大約1％到3％的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的組合物的具體的食品和飲料形式包括發(fā)酵奶、乳酸菌飲料、發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵水果飲料和發(fā)酵豆奶飲料。在本說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語“發(fā)酵奶”和“乳酸菌飲料”符合前日本衛(wèi)生福利部的“涉及奶和奶制品的成分等的部頒條令”的條款2-37“發(fā)酵奶”和條款2-38“乳酸菌飲料”中的定義。也就是說，“發(fā)酵奶”是指通過用乳酸菌或酵母發(fā)酵奶或乳制品而制備的糊狀或液體制劑。因此，“發(fā)酵奶”不僅包括飲料形式的產(chǎn)品而且包括酵奶形式的產(chǎn)品?！叭樗峋嬃稀笔侵咐猛ㄟ^用乳酸菌或酵母發(fā)酵奶或乳制品而制備的糊狀或液體制劑作為主要原料，用水稀釋而制備的飲料。
發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵水果飲料和發(fā)酵豆奶飲料在本文的后文中描述。
本發(fā)明的組合物的其它的食品形式包括含有細(xì)胞的微膠囊包裹的形式、固體食物形式(例如顆粒、粉末(包括發(fā)酵奶的凍干粉等)、片劑、泡騰片、口香糖、goumi和布丁)、以及上述發(fā)酵奶和乳酸菌飲料之外的乳制品。
藥物形式的例子包括用于口服給藥的形式，例如溶液、乳劑、顆粒、粉末、膠囊、片劑等。
這些食品或飲料形式及藥物形式的加工可以以常規(guī)的方式進(jìn)行。用于這些形式的加工的載體可以是任何可食用的載體、可藥用的賦形劑和稀釋劑。關(guān)于可以在食品和飲料形式中使用的食用載體及加工的詳細(xì)情況將在下面的“組合物的食品和飲料形式”章節(jié)中描述。在制備食品形式中，特別優(yōu)選的載體是那些具有具有良好口感和增味效果的載體。藥品形式的加工以及可使用的藥用賦形劑和稀釋劑將在下面的“組合物的藥品形式”章節(jié)中描述。
在本發(fā)明的組合物中摻入的乳酸菌的量可以被適當(dāng)?shù)剡x擇，以便獲得大約每100克組合物108到1011細(xì)胞的濃度(細(xì)胞計(jì)數(shù)不必需是活細(xì)胞計(jì)數(shù)；當(dāng)包括了死細(xì)胞數(shù)量時(shí)，應(yīng)該將其被計(jì)算作滅菌前活細(xì)菌的數(shù)量；在本文后文中也是同樣)?；罴?xì)胞數(shù)量用下面的方式確定。將稀釋的樣品加到瓊脂細(xì)菌培養(yǎng)基上，在37℃厭氧培養(yǎng)，對形成的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。因?yàn)榛罴?xì)胞數(shù)量與濁度彼此相關(guān)，因此，如果活細(xì)胞數(shù)量與濁度之間的這種相關(guān)性被事先確定，就可以利用測定濁度代替活細(xì)胞計(jì)數(shù)來計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量。摻入的乳酸菌的量可以按照將要制備的本發(fā)明的組合物的形式以及所用的乳酸菌的種類等來進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，使用上面提到的范圍作為準(zhǔn)則。
因?yàn)楸景l(fā)明的組合物被設(shè)計(jì)為包含有乳酸菌(主要是活細(xì)胞)，在將組合物加工成最終產(chǎn)物的過程中不推薦使用例如熱和壓力這樣的條件。因此，例如在將本發(fā)明的組合物加工成固體食品形式的過程中，優(yōu)選以凍干細(xì)胞的形式將乳酸菌直接配制，或用適當(dāng)?shù)陌噭┨幚韮龈杉?xì)胞并使用包裹的細(xì)胞。
組合物的食品和飲料形式
本發(fā)明的組合物的代表性的優(yōu)選食品和飲料形式包括發(fā)酵奶、乳酸菌飲料、發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵水果飲料、發(fā)酵豆奶飲料等。發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵水果飲料、發(fā)酵豆奶飲料在后面詳細(xì)描述。這種形式的加工可以通過以下的步驟進(jìn)行，包括將乳酸菌在含有乳酸菌的營養(yǎng)物質(zhì)例如來自蔬菜或水果的汁液、豆奶(大豆乳液)等的適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵原料中培養(yǎng)，從而引起這些原料的發(fā)酵。用作發(fā)酵材料的蔬菜和水果包括切屑、壓碎片、磨屑、壓榨汁液、酶處理產(chǎn)物及其稀釋液或濃縮液?？捎玫氖卟税ɡ缒瞎?、胡蘿卜、西紅柿、甜椒、芹菜、菠菜、有色甘薯、玉米、beats、甘藍(lán)、香芹、卷心菜和花椰菜?？捎玫乃ɡ缣O果、桃、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、柑和橘。
蔬菜和水果的切屑、壓碎片和磨屑可以通過例如下面的方法獲得，包括清洗至少一種蔬菜和水果，并在需要時(shí)將其進(jìn)行煮白處理，例如放在熱水中，然后通過破碎機(jī)、攪拌機(jī)、食品加工機(jī)、粉碎機(jī)、MycolloiderTM(Tokushu Kika Kogyo股份有限公司產(chǎn)品)等切碎、粉碎或磨碎。壓榨汁液可以通過使用過濾壓力汁液攪拌機(jī)等來制備。壓榨汁液也可以將磨碎物通過濾布過濾來制備。酶處理產(chǎn)物可以通過使用纖維素酶、果膠酶、原果膠酶等作用于切屑、壓碎片、磨屑或壓榨汁液來制備。稀釋液包括1到50倍的水稀釋液。濃縮液包括通過例如冷凍濃縮、減壓濃縮等方法濃縮1到100倍的汁液。
豆奶是另一種特別的發(fā)酵原料的例子，可以以常規(guī)的方式從大豆材料制備。這樣的豆奶的例子包括通過將有皮的大豆浸泡在水中、用適當(dāng)?shù)哪ダ缒z體磨濕磨大豆、以常規(guī)的方式將研磨物勻漿、然后將水溶性的大豆蛋白溶解在水中而制備的勻漿液。
為了使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，優(yōu)選事先制備起始物并用起始物接種發(fā)酵材料。這樣的起始物的代表性例子是通過將本發(fā)明的乳酸菌接種到補(bǔ)充了酵母提取物的事先在90到121℃以常規(guī)方式滅菌5到20分鐘的10％的脫脂奶粉或發(fā)酵材料，然后培養(yǎng)本發(fā)明的乳酸菌獲得的培養(yǎng)物。這樣制備的起始物經(jīng)常在每克培養(yǎng)物中含有大約107到大約109個(gè)乳酸菌細(xì)胞。
用于起始物的發(fā)酵材料也可以補(bǔ)充促進(jìn)發(fā)酵的物質(zhì)以確保本發(fā)明的乳酸菌的良好生長，例如各種碳源例如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨糖醇、果糖等，氮源例如酵母提取物、蛋白胨等，維生素和礦物質(zhì)。
乳酸菌接種物一般來說應(yīng)該等同于每立方厘米發(fā)酵液不少于大約1×106活細(xì)胞數(shù)，優(yōu)選大約1×107活細(xì)胞數(shù)。至于培養(yǎng)條件，發(fā)酵溫度一般在大約20到大約45℃的范圍內(nèi)、優(yōu)選在大約25到大約37℃的范圍內(nèi)選擇，發(fā)酵時(shí)間在大約5到72小時(shí)的范圍內(nèi)選擇。
這樣獲得的乳酸發(fā)酵產(chǎn)品可以是凝塊的形式(酵奶樣或布丁樣的形式)，這樣的產(chǎn)品可以直接作為固體食品消化。這樣凝塊形式的乳酸發(fā)酵產(chǎn)品可以進(jìn)一步勻漿以制備所需的飲料形式。勻漿可以使用常規(guī)的勻漿器來進(jìn)行。具體來說，可以使用Gaulin高壓勻漿器(LAB 40)在大約200到大約1000kgf/cm2、優(yōu)選在大約300到大約800kgf/cm2、或Sanwa機(jī)器工業(yè)股份公司的勻漿器(產(chǎn)品號HAx4571，H20-A2等)在不少于150kg/cm2的壓力下進(jìn)行。通過這樣的勻漿，可以獲得具有極好的可口性、具體來說有光滑口感的飲料產(chǎn)品。在進(jìn)行勻漿過程中，如果需要也可能進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?、加入有機(jī)酸調(diào)整pH、和/或加入適當(dāng)量的各種一般用于飲料制造中的其它添加劑，例如寡糖、果汁、增稠劑、表面活性劑和調(diào)味劑。優(yōu)選的添加劑和它們的量(基于凝塊形式的發(fā)酵產(chǎn)品的重量百分比)是例如8％葡萄糖(重量百分比，下文同)、8％蔗糖、8％糊精、0.1％檸檬酸、0.2％脂肪酸甘油酯和0.1％調(diào)味劑。
這樣獲得的本發(fā)明的飲料可以被無菌地分配到適當(dāng)?shù)娜萜髦幸蕴峁┳罱K產(chǎn)品。該產(chǎn)品具有良好的可口性，使得可以順滑地吞咽，并具有愉快的香味。
產(chǎn)品的使用量(攝取量)可以按照接受者的年齡、性別、體重和疾病的嚴(yán)重程度等進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇，沒有具體的限制。一般來說，具有活菌數(shù)大約每毫升106-109細(xì)胞的產(chǎn)品可以以每天大約50-1000毫升的攝取速度給予人體。
本發(fā)明的組合物的食品形式的另一個(gè)具體的例子是泡騰產(chǎn)品形式的組合物。該產(chǎn)品的制備方法是配制10到35％(重量百分比，下面同)的碳酸鈉和/或碳酸氫鈉和20到70％中和劑作為泡騰成分，以及0.01到50％本發(fā)明的乳酸菌(凍干細(xì)胞)。使用的中和劑是能夠中和碳酸鈉和/或碳酸氫鈉產(chǎn)生二氧化碳?xì)怏w的酸性化合物。這樣的化合物的代表性例子是有機(jī)酸例如L-酒石酸、檸檬酸、延胡索酸和抗壞血酸。
在本發(fā)明的泡騰產(chǎn)品中的泡騰成分的量使得當(dāng)本發(fā)明的產(chǎn)品溶解在水中時(shí)，溶液是酸性的，具體來說酸度大約是pH3.5-4.6。更具體來說，含量可以在10-35％的碳酸鈉和/或碳酸氫鈉以及20-70％中和劑的范圍內(nèi)選擇。具體來說，碳酸鈉的量可以在11-31％的范圍內(nèi)選擇，優(yōu)選為22-26％；并且/或碳酸氫鈉在10-35％的范圍內(nèi)，優(yōu)選為20-30％。最優(yōu)選的是單獨(dú)使用碳酸氫鈉，在20-25％的范圍內(nèi)。中和劑的量從20-70％的范圍內(nèi)選擇，優(yōu)選30-40％。具體來說，最優(yōu)選的是使用范圍在20-25％內(nèi)的L-酒石酸和范圍在8-15％內(nèi)的抗壞血酸。
本發(fā)明的泡騰產(chǎn)品含有本發(fā)明的乳酸菌和泡騰成分作為主要成分，也可以補(bǔ)充適當(dāng)量的各種已知添加劑，例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、增稠劑、表面活性劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、電解質(zhì)、甜味劑、調(diào)味劑、色素、pH調(diào)節(jié)劑等。這樣的添加劑的例子包括淀粉例如小麥淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉、糊精等；糖類例如蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、乳糖等；糖醇例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等；糖苷例如連接糖(coupling sugar)、巴拉金糖等；賦形劑例如磷酸鈣、硫酸鈣等；粘合劑和增稠劑例如淀粉、糖類、明膠、阿拉伯樹膠、糊精、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羥基丙基纖維素、黃原膠、果膠、黃蓍膠、酪蛋白、藻酸等；潤滑劑例如亮氨酸、異亮氨酸、L-纈氨酸、糖酯、氫化油、硬脂酸、硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇等；崩解劑例如結(jié)晶纖維素(商標(biāo)名“Avicel”，Asahi化學(xué)工業(yè)股份有限公司產(chǎn)品)、羧甲基纖維素(CMC)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、羧甲基纖維素鈣(CMC-Ca)等；表面活性劑例如脂肪酸聚氧乙烯脫水山梨醇酯(聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯)、卵磷脂等；二肽例如阿斯巴甜、阿力甜等；以及甜味劑例如甜菊糖醇(stevia)、糖精等。這些添加劑可以參考每種添加劑與主要成分的關(guān)系、制劑的性質(zhì)、生產(chǎn)制劑的方法等其它因素來進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，并使用適當(dāng)?shù)牧俊?br> 此外，維生素、具體來說是氰鈷胺素和抗壞血酸(維生素C)，可以以適當(dāng)?shù)牧考尤氲奖景l(fā)明的泡騰產(chǎn)品中。對量沒有具體的限制，但是例如維生素C通常最多添加到30％，優(yōu)選在大約5％到大約25％的范圍內(nèi)。
生產(chǎn)本發(fā)明的泡騰產(chǎn)品的方法可以基本上與生產(chǎn)這種泡騰片的常規(guī)方法相同。因此，本發(fā)明的泡騰片形式的產(chǎn)品的制備可以通過稱量預(yù)定量的相應(yīng)成分、將它們混合、然后通過例如直接的粉末壓縮方法或濕或干顆粒壓縮方法來加工它們。
這樣獲得的本發(fā)明的產(chǎn)品可以簡單地通過放置在水中被轉(zhuǎn)變成適合口服的飲料的形式，并口頭給藥。
對其給藥量(攝取量)沒有具體的限制，可以根據(jù)接受者的年齡、性別、體重、疾病嚴(yán)重程度以及其它變量來適當(dāng)?shù)貨Q定。一般來說，1-2片每片大約1.5到6.0克重的本發(fā)明的泡騰片溶解到100-300毫升水中，產(chǎn)生用于人類接受者的單劑量。
組合物的藥物形式
本發(fā)明的組合物可以使用適當(dāng)?shù)目伤幱玫妮d體以及作為主要成分的本發(fā)明的乳酸菌制造成普通的藥物產(chǎn)品，并投入實(shí)際應(yīng)用?？捎玫目伤幱玫妮d體的例子包括各種稀釋劑和賦形劑例如填料、補(bǔ)充劑、粘合劑、增濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等，這些在本技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。這些載體可以按照產(chǎn)生的藥物制劑的單位劑量形式來選擇性地使用。
藥物產(chǎn)品的單位劑量形式可以從各種劑量形式中選擇。代表性的形式是片劑、丸劑、粉劑、溶液、懸浮液、乳液、顆粒和膠囊。
片劑可以使用作為藥物載體的下列物質(zhì)來制備，例如賦形劑如乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結(jié)晶纖維素、硅酸、磷酸鉀等；粘合劑例如水、乙醇、丙醇、凈糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明膠溶液、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑例如羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、低取代的羥丙基纖維素、干淀粉、藻酸鈉、瓊脂粉、海帶多糖粉、碳酸氫鈉、碳酸鈣等；表面活性劑例如脂肪酸聚氧乙烯失水山梨醇酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯等；崩解抑組合物例如蔗糖、硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸附促進(jìn)劑例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；增濕劑例如甘油、淀粉等；吸附劑例如淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、硅膠等；以及潤滑劑例如純化的滑石粉、硬脂酸鹽、硼酸粉末、聚乙二醇等。
此外，如果需要，片劑可以包被上標(biāo)準(zhǔn)的包被材料，以提供糖包被的片劑、明膠包被的片劑、腸衣包被的片劑、薄膜包被的片劑等，或加工成多層的片劑例如雙層片劑。
丸劑可以使用如下的藥物載體制備，例如賦形劑如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、高嶺土、滑石粉等；粘合劑例如阿拉伯樹膠粉、黃蓍膠粉、明膠、乙醇等；以及崩解劑例如海帶多糖、瓊脂等。
此外，如果需要，增色劑、防腐劑、香味化合物、調(diào)味劑、甜味劑和其它藥物物質(zhì)也可以被摻入到本發(fā)明的藥物產(chǎn)品中。
被摻入到本發(fā)明的藥物產(chǎn)品中的本發(fā)明的乳酸菌的數(shù)量沒有特別的限制，可以從廣泛的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇。一般來說推薦的比例是每單位劑量形式藥物產(chǎn)品大約107-1012細(xì)胞。
給藥藥物產(chǎn)品的方法沒有特別的限制，可以根據(jù)藥物產(chǎn)品的形式、病人的年齡、性別和其它變量、疾病的嚴(yán)重程度等來進(jìn)行適當(dāng)?shù)臎Q定。例如，片劑、丸劑、溶液、懸浮液、乳液、顆粒和膠囊可以口服給藥。
藥物產(chǎn)品的劑量可以根據(jù)給藥的方法、病人的年齡、性別和其它變量、疾病的嚴(yán)重程度等來進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，但是優(yōu)選為每公斤體重每天大約0.5-20毫克本發(fā)明的乳酸菌、即活性成分。藥物產(chǎn)品可以一天給藥1-4個(gè)分劑。
本發(fā)明組合物的改造使得一旦攝入(給藥)，組合物中的乳酸菌定居在下消化道中作為腸道微生物群落的部分，在那里可以獲得乳酸菌的預(yù)期效果例如腸道調(diào)節(jié)和腸道微生物群落改善。因此，特別優(yōu)選的藥物產(chǎn)品形式是腸溶片，通過它乳酸菌可以被運(yùn)送到腸道而避免了胃酸的攻擊。
本發(fā)明的乳酸菌菌株和含有細(xì)菌的組合物，一旦被攝取或給藥，能夠刺激人類粘膜免疫并促進(jìn)IgA產(chǎn)生。因此本發(fā)明提供了在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象給藥本發(fā)明的乳酸菌；在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象使用本發(fā)明的組合物；在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象使用本發(fā)明的乳酸菌；以及在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象使用本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的乳酸菌在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用；本發(fā)明的組合物在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用；本發(fā)明的乳酸菌在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用；本發(fā)明的組合物在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用。
此外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的乳酸菌在制備本發(fā)明的組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的效果
本發(fā)明提供了新的乳酸菌，它們具有極好的誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生能力，能夠有效地提供改善的人類粘膜免疫刺激，特別是腸道免疫刺激性，并且增強(qiáng)宿主的防御系統(tǒng)，以及提供含有細(xì)菌的組合物。更具體來說，提供了食品或藥物產(chǎn)品形式的組合物。
附圖簡述


圖1顯示給藥本發(fā)明的乳酸菌對派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞IgA產(chǎn)生的影響。
圖2顯示給藥本發(fā)明的乳酸菌對IgG產(chǎn)生的影響。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式
提供了下面的實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實(shí)施例1
關(guān)于本發(fā)明的組合物配制的例子在下面顯示。
(1)發(fā)酵豆奶飲料的制備
按照下面的配方稱量成分，然后混合來制備飲料形式的本發(fā)明的組合物。
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239發(fā)酵的豆奶 100mL
乳蔗糖(含量55％)10.0g
維生素和礦物質(zhì) 適量
調(diào)味劑 適量
水 適量
合計(jì)150mL
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239發(fā)酵的豆奶是通過在1升豆奶(蛋白含量大約5g/100mL)中加入108個(gè)乳桿菌(Lactobacillus)ONRICb0239(FERM BP-10064)細(xì)胞，然后在37℃發(fā)酵48小時(shí)而獲得的。發(fā)酵奶的細(xì)菌細(xì)胞含量是1×109細(xì)胞/mL。
(2)發(fā)酵牛奶的制備
按照下面的配方稱量成分，然后混合來制備發(fā)酵牛奶形式的本發(fā)明的組合物。
乳蔗糖(含量55％) 10.0g
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240發(fā)酵的牛奶 100mL
維生素和礦物質(zhì) 適量
調(diào)味劑 適量
水 適量
合計(jì) 150mL
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240發(fā)酵的牛奶是通過在1升牛奶中加入108個(gè)乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)細(xì)胞，然后在37℃發(fā)酵24小時(shí)而獲得的。牛奶的細(xì)菌細(xì)胞含量是1×108細(xì)胞/mL。
(3)冷凍干燥的發(fā)酵牛奶粉的制備
使用大約107個(gè)乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERMBP-10064)細(xì)胞，在37℃對100克牛奶進(jìn)行乳酸發(fā)酵24小時(shí)，然后對發(fā)酵產(chǎn)品(包括細(xì)菌)進(jìn)行冷凍干燥以制備粉末。
得到的粉末和各種其它成分按照下面的配方稱量，然后混合來制備發(fā)酵牛奶凍干粉形式的本發(fā)明的組合物。粉末的細(xì)菌細(xì)胞含量是1×109細(xì)胞/mL。
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239發(fā)酵
的牛奶的冷凍干燥粉 2.2g
賦形劑 適量
維生素和礦物質(zhì) 適量
調(diào)味劑 適量
合計(jì) 20g
玉米淀粉被用作賦形劑。
(4)粉末的制備
按照下面的配方稱量成分，然后混合來制備粉末形式的本發(fā)明的組合物。
酪蛋白 4.5g
乳蔗糖(含量55％) 10.0g
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240凍干粉 1.0g
維生素和礦物質(zhì) 適量
調(diào)味劑 適量
合計(jì) 20g
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240凍干粉是通過在10％脫脂奶粉水溶液、即生長乳桿菌(Lactobacillus)的發(fā)酵原料中于37℃培養(yǎng)乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)24-48小時(shí)，然后冷凍干燥而獲得的。粉末的細(xì)菌細(xì)胞含量是109-1010細(xì)胞/mL。
(5)顆粒的制備
按照下面的配方稱量成分，然后混合來制備顆粒形式的本發(fā)明的組合物。
乳蔗糖(含量55％)10.0g
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240凍干粉 1.0g
山梨醇 適量
維生素和礦物質(zhì) 適量
調(diào)味劑 適量
合計(jì)20g
使用的乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240凍干粉與實(shí)施例1-(4)中所用的相同。
(6)含有乳桿菌(Lactobacillus)的微膠囊
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)以實(shí)施例1-(4)中中同樣的方式冷凍干燥。每克獲得的凍干粉含有6×1010個(gè)細(xì)胞，與乳蔗糖一起分散在融化的氫化椰子油(熔點(diǎn)34℃)中，制備成含有乳酸菌(25％)、油(70％)和寡糖(5％)的混合融化物。得到的融化物通過三重同心噴嘴最內(nèi)部的噴嘴以0.3米/秒的平均流速滴加到流動的冷卻油中；氫化椰子油(熔點(diǎn)34℃)和氫化大豆油的混合融化物通過內(nèi)部噴嘴附近的中間噴嘴以0.3米/秒的平均流速滴加；用來形成膠囊殼的明膠/果膠溶液(體積比85/15)通過最外部的噴嘴以0.3米/秒的平均流速滴加，這就產(chǎn)生了三層無縫膠囊(每克膠囊1.4×109個(gè)細(xì)胞)，直徑為2.5毫米。
內(nèi)含物、中間涂層和外部膠囊殼的重量比是35∶35∶30。
膠囊被空氣干燥，然后進(jìn)行真空干燥或真空凍干以便將膠囊的水活性減少到Aw值為0.20或以下，熱傳導(dǎo)率為0.16kcal/mh℃或以下。Aw值的測定使用了電阻抗型的水活性儀(Aw儀，WA-360，Shibaura電子股份有限公司產(chǎn)品)。熱傳導(dǎo)率使用Fitch方法測量。
實(shí)施例2
在本實(shí)施例中，在體外使用了派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)按照Yasui等和Ikenaga等中描述的方法(Yasui，H.等，Microbial Ecology inHealth and Disease，5，155(1992)；Ikenaga，T.等，Milk Science，51，27(2002))對本發(fā)明的乳酸菌的誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力進(jìn)行了試驗(yàn)。試驗(yàn)如下。
(1)實(shí)驗(yàn)動物
使用了純株系SPF/VAF BALB/cAnNCrj雌性小鼠。
將獲得的試驗(yàn)小鼠隔離檢疫一個(gè)星期。在隔離檢疫期間，隨意地供應(yīng)固態(tài)飲食(MF，Oriental Yeast股份有限公司產(chǎn)品)和自來水。
(2)派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)方法
在隔離檢疫期后，將80只小鼠分成8組，每組10只小鼠，使得每組的平均體重基本相同。分組后，每天處死10只小鼠，取出小腸，從小腸中分離出派伊爾淋巴結(jié)。將派伊爾淋巴結(jié)放置在含有MEM[Eagle’s MEM(NISSUI產(chǎn)品)，2mM谷氨酰胺(GIBCO產(chǎn)品)，1mM丙酮酸鈉(GIBCO產(chǎn)品)，以及MEM非基本氨基酸(GIBCO產(chǎn)品)]的離心管中，用冰冷卻。將細(xì)胞通過一個(gè)篩子制備出單細(xì)胞懸浮液，用5mLMEM洗滌孔。將細(xì)胞懸浮液過濾，在4℃以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘。離心后，吸取出培養(yǎng)上清液，將沉淀懸浮在5mL MEM中。將此步驟重復(fù)兩遍后，將沉淀懸浮在10mL含有5％FBS(GIBCO產(chǎn)品)的MEM中，并對活派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸浮液接種到96孔板中制備細(xì)胞培養(yǎng)板。
(3)試驗(yàn)細(xì)胞的制備
乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)和乳桿菌(Lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)被用做本發(fā)明的乳酸菌。這些細(xì)菌被培養(yǎng)在適合它們培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，直到達(dá)到靜止生長期，然后將得到的培養(yǎng)液在7000g離心10分鐘(4℃)。細(xì)胞用PBS(-)洗三次，懸浮在5mL生理鹽水中。為了確定細(xì)胞的數(shù)量，在660nm測量濁度。然后將細(xì)胞在100℃高壓滅菌30分鐘。確定了660nm處濁度1.0等價(jià)于2.0×109細(xì)胞/毫升。
(4)培養(yǎng)上清液中IgA濃度的測定
在前面(2)中制備的派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞被懸浮在含有5％FBS的MEM中，調(diào)整到2.5×106細(xì)胞/毫升，將200μL懸浮液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將20μL上面(3)中制備的濃度為2.0×109細(xì)胞/毫升的試驗(yàn)細(xì)胞懸浮液加到板的每個(gè)孔中，在存在5％CO2的情況下在37℃培養(yǎng)7天。
20μL濃度為50μg/mL的LPS(脂多糖)代替20μL上述細(xì)胞作為陽性對照。
隨后，使用商業(yè)化的試劑盒通過ELISA測定了獲得的培養(yǎng)上清液的總IgA濃度。
(5)本發(fā)明的乳酸菌的增強(qiáng)IgA產(chǎn)生活性
下面的表1顯示了本發(fā)明的乳酸菌的增強(qiáng)IgA產(chǎn)生活性，其指標(biāo)為刺激指數(shù)(S.I.)，即前面(4)中測定的含有本發(fā)明的乳酸菌的上清液的總IgA濃度相對于對照培養(yǎng)上清液中的總IgA濃度的值，對照培養(yǎng)上清液的制備是通過在MEM中加入10μL PBS(-)，然后以同樣的方式培養(yǎng)無細(xì)胞培養(yǎng)基7天作為參照(1.0)。
使用各種已知的乳酸菌獲得的試驗(yàn)結(jié)果顯示在表1-4中。陽性對照(LPS 50μg/mL)的試驗(yàn)結(jié)果被標(biāo)明為“陽性對照(LPS)”。表中“菌株號”下面顯示的縮寫代表下列的微生物保藏中心
ATCC美國典型培養(yǎng)物保藏中心；Manassas，VA，U.S.A.
JCM日本理化研究所微生物包藏中心，RIKEN
NRIC東京農(nóng)業(yè)大學(xué)NODAI培養(yǎng)物保藏中心；Setagaya-ku，東京，日本。
表1
表2
表3
表4
如同表1-4中顯示的那樣，PBS對照的IgA產(chǎn)量被當(dāng)作1，陽性對照的平均S.I.為13.1，表明了IgA產(chǎn)量的強(qiáng)烈增強(qiáng)。因此證實(shí)了該培養(yǎng)系統(tǒng)可用于評估派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞的IgA產(chǎn)量。
根據(jù)誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力，對各種乳酸菌進(jìn)行的比較表明本發(fā)明的乳酸菌ONRIC b0239和ONRIC b0240分別具有S.I.值為5.61和6.31，因此與其它菌株相比具有明顯較高的誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力，這些其它菌株的S.I.值是0.8-1.4。
IgA抑制病原菌侵入，中和病毒和毒素，抑制飲食性過敏原侵入。這些IgA的增加對于宿主防御是重要的。
實(shí)施例3
在本實(shí)施例中，通過下面的方式在體內(nèi)試驗(yàn)了本發(fā)明的乳酸菌的誘導(dǎo)IgA產(chǎn)生的能力。
(1)實(shí)驗(yàn)動物及其飼養(yǎng)
購買50只雄性的8周齡BALB/c小鼠，并隔離檢疫一個(gè)星期。在隔離檢疫期間和隨后的試驗(yàn)期間，隨意地供應(yīng)MF固態(tài)飲食(OrientalYeast股份有限公司產(chǎn)品)和自來水。
在隔離檢疫期后，將小鼠分成3組，即生理鹽水給藥組(15只小鼠)，本發(fā)明的乳酸菌(活細(xì)胞)給藥組(15只小鼠)，以及本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組(15只小鼠)
(2)制備用于口服的本發(fā)明的乳酸菌
通過下列方法制備了用于口服的本發(fā)明的乳酸菌(活的和非活的細(xì)胞)。
活細(xì)胞
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)b0240(FERM BP-10065；在本文后面簡稱為“b0240”)在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到達(dá)到靜止生長期，得到的培養(yǎng)物在3500rpm離心10分鐘(4℃)。細(xì)胞用生理鹽水離心清洗兩次，懸浮于生理鹽水中，使?jié)舛冗_(dá)到4×109CFU/mL。
非活細(xì)胞
將獲得的活細(xì)胞高壓滅菌(121℃加熱15分鐘)，然后使用超聲清洗器(BRANSON)超聲45分鐘。
(3)試驗(yàn)方法
將(2)中制備的本發(fā)明的乳酸菌(活細(xì)胞)給本發(fā)明的乳酸菌(活細(xì)胞)給藥組的15只小鼠(5+5+5＝15只小鼠)口服，分別在每天早晨以109CFU/250μL/小鼠/天的劑量口服7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。同樣地，將(2)中制備的本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組的15只小鼠口服，分別口服7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。在相應(yīng)的給藥期后，每個(gè)組的小鼠被斬首處死，將它們的血收集在管中，以3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度在4℃離心10分鐘以獲得血清。派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞通過下面的方法制備。在處死每組的小鼠后，取出小腸，用眼科剪刀從小腸的外表面取下派伊爾淋巴結(jié)。將派伊爾淋巴結(jié)放置在含有不完全培養(yǎng)基(含有10mg慶大霉素的RPMI1640)的24孔微孔板中，用冰冷卻。得到的培養(yǎng)液通過篩子制備出單細(xì)胞懸浮液，用5mL不完全培養(yǎng)基洗滌孔。將獲得的懸浮液過濾，在4℃以1000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心10分鐘。離心后，吸取出培養(yǎng)上清液，將沉淀懸浮在5mL不完全培養(yǎng)基中。將包括清洗、過濾、離心和吸取的上述步驟重復(fù)一次后，將獲得的沉淀用作派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞。
生理鹽水給藥組的對照小鼠(15只小鼠)在飼養(yǎng)中沒有給予本發(fā)明的乳酸菌(活的和非活的細(xì)胞)，它們的血清和派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞，在試驗(yàn)開始后7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)時(shí)以與上述相同的方式制備。
IgA產(chǎn)生試驗(yàn)
這樣制備的派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞(沉淀)被懸浮在0.5mL完全培養(yǎng)基中(含有2mM L-谷氨酰胺、50μM巰基乙醇、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素和10％FBS的RPMI1640)，調(diào)整使得細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/mL。在對活細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)后，將100μL細(xì)胞懸浮液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。
派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的IgA的量通過兩種方法評估，即一種方法包括如上培養(yǎng)派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞，然后測量產(chǎn)生的IgA的量，另一種方法包括將派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞在含有作為派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞刺激物的本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)的培養(yǎng)細(xì)胞中培養(yǎng)，然后測量產(chǎn)生的IgA的量。在后一種方法中使用的條件被認(rèn)為更接近真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境。具體來說，當(dāng)在本試驗(yàn)中本發(fā)明的乳酸菌(活的和非活的細(xì)胞)被口服時(shí)，預(yù)計(jì)被消化的乳酸菌將給派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞提供一些刺激。
作為派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞刺激物的本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)按照下面的方法制備。
用于派伊爾淋巴結(jié)刺激的本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)
前面制備的用于口服的本發(fā)明的乳酸菌(活細(xì)胞)懸浮液進(jìn)一步用磷酸緩沖液稀釋，使?jié)舛冗_(dá)到107CFU/mL(660nm處濁度為0.275)，將得到的細(xì)胞懸浮液高壓滅菌(121℃加熱15分鐘)，然后使用超聲波清洗器(BRANSON 2510)超聲45分鐘。
在使用派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞刺激物的方法中，10μL用于派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞刺激的本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)被加到每個(gè)孔中，然后在每個(gè)孔中加入100mL無FCS的RPMI1640，在存在5％CO2的情況下于37℃將派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)7天。在不使用派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞刺激物的方法中，10μL生理鹽水代替本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)被加到每個(gè)孔中，然后通過同上的步驟培養(yǎng)派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞。
(4)測量
從細(xì)胞培養(yǎng)溶液通過離心分離培養(yǎng)上清液，并將它們在-80℃冷凍儲存直到它們用于測量培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生的IgA的總濃度。
培養(yǎng)上清液的總IgA濃度和血清的總IgG濃度使用商業(yè)化的試劑盒通過ELISA測定。
(5)結(jié)果
圖1和圖2顯示了結(jié)果(分別為IgA濃度和IgG濃度)。
圖1是一個(gè)條形圖，顯示了培養(yǎng)上清液的IgA濃度(μg/mL)。在圖1中，白色的條顯示了對照的生理鹽水給藥組的結(jié)果(標(biāo)為“生理鹽水”)。斜線條顯示了本發(fā)明的乳酸菌(活b0240細(xì)胞)給藥組的結(jié)果(標(biāo)為“b0240活細(xì)胞”)。黑色的條顯示了本發(fā)明的乳酸菌(非活b0240細(xì)胞)給藥組的結(jié)果(標(biāo)為“b0240非活細(xì)胞”)?！盁o刺激”表示來自每個(gè)組的小鼠的派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞在不含本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的情況。“細(xì)胞刺激”表示來自每個(gè)組的小鼠的派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞在本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)的刺激下，通過在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入乳酸菌培養(yǎng)的情況。每組使用5只小鼠獲得的結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(平均值±SD)。在結(jié)果上方顯示的p值代表了學(xué)生t-檢驗(yàn)中相對于對照的顯著水平。
圖1中顯示的結(jié)果清楚地表明
(1)7天給藥
在細(xì)胞刺激的情況下，本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組與生理鹽水給藥組相比具有明顯高的值(p＝0.01.0)。
(2)14天給藥
在無刺激的情況下，本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組與對照組(在給藥生理鹽水后無刺激)相比具有明顯高的值(p＝0.048)(無刺激的黑色條)。
在細(xì)胞刺激的情況下，本發(fā)明的乳酸菌給藥組兩組(非活細(xì)胞和活細(xì)胞)與對照組(生理鹽水給藥組)相比都具有明顯高的值(分別為p＝0.034和p＝0.002)。
(3)21天給藥
在無刺激的情況下，本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組與對照組相比具有明顯高的值(p＝0.047)。
在細(xì)胞刺激的情況下，本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞和活細(xì)胞)給藥組兩組與對照組相比都具有明顯高的值(分別為p＝0.015和p＝0.005)。
圖2是一個(gè)條形圖，顯示了本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥21天對IgG產(chǎn)量的影響。血清IgG濃度(μg/mL)作圖在縱軸上。
圖2顯示的結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的乳酸菌(非活細(xì)胞)給藥組與對照組(生理鹽水給藥組)相比具有明顯高的血清IgG濃度(p＝0.0064)；本發(fā)明的乳酸菌(活細(xì)胞)給藥組與對照組(生理鹽水給藥組)相比也具有明顯高的血清IgG濃度。
上述的結(jié)果被認(rèn)為是如下發(fā)生的本發(fā)明的乳酸菌通過刺激派伊爾淋巴結(jié)或小腸上皮細(xì)胞中的免疫活性細(xì)胞和周圍的免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)了粘膜免疫反應(yīng)，最終增加了派伊爾淋巴結(jié)細(xì)胞的總IgA產(chǎn)量。結(jié)果也清楚地顯示，給藥本發(fā)明的乳酸菌不僅可以增加IgA，也可以增加血清IgG。這些情況表明攝取本發(fā)明的乳酸菌不僅刺激了粘膜免疫，而且刺激了系統(tǒng)免疫，以致于體內(nèi)免疫反應(yīng)被加倍刺激，從而使宿主生物體能夠從內(nèi)部和外部防御。由于不僅活細(xì)胞而且非活細(xì)胞都顯示了這樣的活性，本發(fā)明的乳酸菌被預(yù)期可用于新的益生方法，例如口服疫苗。
實(shí)施例4
本實(shí)施例將要證實(shí)本發(fā)明的乳酸菌防止下呼吸道流感感染的有效性。
粘膜免疫是病原接觸到粘膜時(shí)感染防御機(jī)制的第一步(Brandtzaeg，P.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.14613 1989)。粘膜分泌的IgA(S-IgA)具有針對病原例如細(xì)菌和病毒的防御性質(zhì)(Czinn，S.J.等，Vaccine11637，1993；Renegar，K.等，J.Immunol.1461972，1991)，在中和微生物產(chǎn)生的毒素的過程中也發(fā)揮重要作用(Brandtzaeg，P.，APMIS 1031，1995；Kilian，M.等，Microbiol.Rev.52296 1988)。近年來在針對通過粘膜免疫系統(tǒng)的感染防護(hù)效應(yīng)的傳染病藥物方面進(jìn)行了許多研究和開發(fā)。流感感染在免疫系統(tǒng)發(fā)育不全的兒童和免疫功能已經(jīng)降低的老年人中有高的死亡率，因此需要開發(fā)更有效的疫苗代替現(xiàn)有疫苗。具體來說，因?yàn)榱餍械牧鞲胁《镜念愋兔磕甓几淖?，在病毒感染位點(diǎn)由粘膜免疫產(chǎn)生的中度特異性IgA的基礎(chǔ)上開發(fā)粘膜疫苗代替透皮給藥產(chǎn)生的高特異性IgG，已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試。使用乳酸菌的食品例如發(fā)酵奶，已經(jīng)被報(bào)道具有基于IgA的感染防護(hù)效應(yīng)。例如Yasui等進(jìn)行了輪狀病毒(為一種造成嬰兒腹瀉主要原因的病毒)感染小鼠的實(shí)驗(yàn)，其中B.breve YIT4064被給藥母鼠，然后用母鼠的奶喂養(yǎng)子鼠，報(bào)道結(jié)果抑制了子鼠的腹瀉(H.Yasui等，J.Infect.Dis.，172403，1995)。Yasui等還報(bào)道了B.breve YIT4064的給藥增加了血清中流感病毒特異性IgG，從而保護(hù)小鼠抵抗流感感染，這是因?yàn)獒槍α鞲胁《靖腥镜谋Ｗo(hù)程度與體液免疫和細(xì)胞免疫例如呼吸道中的粘膜免疫球蛋白A(IgA)和血清IgG的水平相關(guān)(H.Yasui等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.6186，1999)。
為了研究乳酸菌的基于IgA的感染防護(hù)效應(yīng)，使用流感病毒(IFV)到達(dá)下呼吸道的下呼吸道感染模型小鼠，使用感染后存活的天數(shù)作為指標(biāo)評估了攝取本發(fā)明的組合物(使用本發(fā)明的乳酸菌制備的發(fā)酵奶)的感染防護(hù)效應(yīng)。試驗(yàn)按照下面的方法進(jìn)行。
(1)實(shí)驗(yàn)動物
5周齡SPF/VA/VAF純系雌性小鼠(BALB/cAnNCrj株系)從CharlesRiver日本公司購買，在下面顯示的條件下隔離檢疫4天，然后分成3組(蒸餾水組、牛奶組和含有本發(fā)明的乳酸菌的發(fā)酵奶組)使得每組的平均體重基本上相同。
飼料供應(yīng)MF固體飲食(Oriental Yeast股份有限公司產(chǎn)品)/自由喂食
水供應(yīng)自來水/從瓶中隨意喂食
環(huán)境溫度23±2℃；濕度60±10％。
照明時(shí)間照明期，7:00到19:00；暗期，19:00到7:00。
(2)試驗(yàn)方法
試驗(yàn)物((1)蒸餾水、(2)牛奶或(3)含有本發(fā)明的乳酸菌的發(fā)酵奶)隨著MF固體飲食(Oriental Yeast股份有限公司產(chǎn)品)給藥每組小鼠(n＝45)2個(gè)星期。
試驗(yàn)用的牛奶是通過用蒸餾水稀釋LL牛奶(Oaso牛奶；RakunouMothers(Kumamoto乳制品合作聯(lián)合公司)產(chǎn)品)到75％而制備。含有本發(fā)明的乳酸菌的試驗(yàn)用發(fā)酵奶是使用懸浮在10％脫脂奶水溶液中的植物乳桿菌(L.plantarum)ONRIC b0240并在-80℃冷凍儲存作為起始物而制備的。起始物(活細(xì)胞數(shù)108細(xì)胞)被加入到1升牛奶中，于33℃發(fā)酵16小時(shí)，使?jié)舛冗_(dá)到5×107細(xì)胞/mL，用蒸餾水稀釋到75％。
試驗(yàn)物通過供水瓶隨意喂食。喂食攝取量通過比較試驗(yàn)物的起始重量和喂食后的重量得出的試驗(yàn)物的重量減少值計(jì)算出來。
開始攝食兩周后，每組的小鼠用“Ketalar”(克他命鹽酸鹽)麻醉，用IFV通過一個(gè)鼻腔用于鼻腔接種，給藥50μL濃度為10、102或103pfu/50μL PBS/小鼠(每組15只小鼠)的IFV溶液感染小鼠。每天檢查每組中小鼠的存活或死亡。從感染開始到證實(shí)死亡期間，小鼠可以自由接近試驗(yàn)物。
儲存在Otsuka制藥股份有限公司微生物研究所的IFVA/PR/8/34/H1N1株系被用做IFV株系。該株被懸浮在含有0.1％BSA和10mM HEPES的MEM中，用PBS(+)稀釋使?jié)舛冗_(dá)到10-103pfu/50μL，從而提供了用于IFV接種的病毒溶液。PBS(+)通過將9.55克PBS(-)粉末(Kojin-Bio股份公司產(chǎn)品)、100.00mg無水氯化鈣和46.90mg無水氯化鎂溶解在蒸餾水中使體積達(dá)到1000mL而制備。
結(jié)果
每組中的小鼠在鼻腔接種IFV后存活的天數(shù)在每天早晨(8:30-9:00)和晚上(17:30-18:00)通過觀察進(jìn)行檢查，即一日兩次。
當(dāng)病毒以102pfu/小鼠的濃度接種時(shí)，對照組(蒸餾水給藥組)和比較組(牛奶給藥組)中的所有小鼠都在7天內(nèi)死亡。當(dāng)病毒以103pfu/小鼠的濃度接種時(shí)，兩組中的所有小鼠都在第6天晚上前死亡。相反，含有本發(fā)明的乳酸菌的發(fā)酵奶給藥組顯示出小鼠的存活期超過對照組的趨勢。
當(dāng)病毒以10pfu/小鼠的濃度接種時(shí)，在14天時(shí)所有組中70％或以上的小鼠都存活；在含有本發(fā)明的乳酸菌的發(fā)酵奶給藥組中86.7％的小鼠存活，因此顯示出與對照組(80％)相比增加存活率的趨勢。
從開始攝取試驗(yàn)物到感染時(shí)，每兩天用電子稱測量每組中的小鼠的重量，在感染后每天早晨(8:30-9:00)測量。在每個(gè)測量日對存活的小鼠進(jìn)行測量，同一組中小鼠所有測量值的平均值被顯示為獲得的值。
在所有組中，從第2天起觀察到輕微的重量減少。在所有組中重量變化的趨勢是相似的，沒有觀察到明顯的區(qū)別。
體會
從該試驗(yàn)的結(jié)果和實(shí)施例2和3中的結(jié)果，推論出本發(fā)明的乳酸菌和含有乳酸菌的發(fā)酵奶具有針對IFV感染的防護(hù)效果。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供了能夠刺激粘膜免疫和促進(jìn)IgA產(chǎn)生的乳酸菌，以及含有該菌的組合物。該乳酸菌和組合物可以抑制傳染性微生物通過粘膜的侵入，從而提供了宿主保護(hù)性效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.乳酸菌菌株，該菌株選自乳桿菌(lactobacillus)ONRICb0239(FERM BP-10064)和乳桿菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERMBP-10065)。
2.權(quán)利要求1中的乳酸菌菌株，該菌株是乳桿菌(lactobacillus)ONRIC b0239(FERM BP-10064)。
3.權(quán)利要求1中的乳酸菌菌株，該菌株是乳桿菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP-10065)。
4.含有權(quán)利要求1中的乳酸菌菌株和可食用載體或可藥用賦形劑或稀釋劑的組合物，該組合物能夠刺激粘膜免疫。
5.權(quán)利要求4中的組合物，該組合物是食品或飲料的形式。
6.權(quán)利要求5中的組合物，該組合物是發(fā)酵奶、乳酸菌飲料、發(fā)酵蔬菜飲料、發(fā)酵水果飲料或發(fā)酵豆奶飲料。
7.在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象給藥權(quán)利要求1-3之一的乳酸菌。
8.在需要刺激粘膜免疫的人類對象中刺激粘膜免疫的方法，包括給該人類對象給藥權(quán)利要求4-6之一的組合物。
9.在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象給藥權(quán)利要求1-3之一的乳酸菌。
10.在需要促進(jìn)IgA產(chǎn)生治療的人類對象中促進(jìn)IgA產(chǎn)生的方法，包括給該人類對象給藥權(quán)利要求4-6之一的組合物。
11.權(quán)利要求1-3之一的乳酸菌在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求4-6之一的組合物在人類粘膜免疫刺激中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1-3之一的乳酸菌在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求4-6之一的組合物在促進(jìn)人類IgA產(chǎn)生中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求1-3之一的乳酸菌在制備權(quán)利要求4-6之一的組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了選自乳桿菌(lactobacillus)ONRICb0239(FERMBP－10064)和乳桿菌(lactobacillus)ONRIC b0240(FERM BP－10065)的乳酸菌，以及含有該菌的組合物，該組合物能夠刺激粘膜免疫，更具體來說，組合物是食品或飲料或藥物產(chǎn)品的形式。乳酸菌和含有該菌的組合物能夠提供良好的粘膜免疫刺激效應(yīng)，可用于加強(qiáng)宿主防御系統(tǒng)。
文檔編號A23L2/38GK1849388SQ200480023999
公開日2006年10月18日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月21日
發(fā)明者山平聰子, 戶羽正道, 岡松洋 申請人:大塚制藥株式會社