專利名稱：一種腸上皮間淋巴細胞的分離方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞分離技術，涉及一種腸道中的腸上皮細胞間淋巴細胞的分離方法。
背景技術：
腸道是機體最大、最復雜的粘膜免疫器官，是識別“自我”和“異我”的重要器官，也是病原體入侵機體的主要門戶，因此腸道粘膜免疫系統(tǒng)構成了機體抵抗病原體入侵的第
一道免疫屏障。腸道粘膜免疫系統(tǒng)包括集合粘膜相關淋巴組織(腸系膜淋巴結、Peyer’ s結)和 彌散粘膜相關淋巴組織(包括固有層淋巴細胞和腸上皮間淋巴細胞)。腸上皮間淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocytes, iIELs)是分散在腸道上皮細胞基底面之間的一種T淋巴細胞，即細胞表面標記為⑶3+，并且85%以上為⑶8+T淋巴細胞，而且含有15%以上的T細胞受體⑶8+TCRY δ+，是腸道粘膜免疫反應中的效應細胞，可分泌細胞因子，具有淋巴毒T淋巴細胞的作用，同時可抑制粘膜部位的過敏反應。因此，iIELs在不同生理病理狀態(tài)下發(fā)揮著不同的免疫調節(jié)功能，在腸道粘膜免疫反應中具有非常重要的作用。目前分離iIELs多數(shù)采用機械法或酶消化法，不僅花費大量的時間，分離細胞非常復雜，存活率低，而且降低了分離后的iIELs的細胞活性，不利于針對性的研究iIELs的免疫調節(jié)功能。如何有效地分離腸道中的iIELs是急需解決的一個技術問題，為進一步深入研究iIELs在腸道粘膜免疫中的調節(jié)作用提供一個有力的技術手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種存活率高的分離腸上皮間淋巴細胞的方法，能有效地分離腸道中的上皮間淋巴細胞iIELs。本發(fā)明所述的目的是通過以下措施實現(xiàn)的—種淋巴細胞分離方法，其特征在于所述分離方法是利用溫差法與淋巴細胞分離液相結合的方法。上述淋巴細胞是腸上皮間淋巴細胞。上述溫差法是指待分離細胞在0_5°C冰浴后，在0_5min內轉移到30_40°C培養(yǎng)基中。優(yōu)選為4°C冰浴，瞬間轉移到37°C培養(yǎng)基中。瞬間轉移是指在O-IOs內轉移。上述冰浴的時間為1-4小時。優(yōu)選為2小時。上述培養(yǎng)基是含有ImM 二硫代蘇糖醇和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。上述淋巴細胞來源于大鼠小腸組織。上述淋巴細胞分離方法，其特征在于由以下步驟組成(I)小腸組織的提取和處理將禁食過夜的健康大鼠處死后，提取小腸組織，并用PBS沖洗腸腔，剪去peyer’ s結后，置于含有10 %小牛血清、I %青鏈霉素雙抗的PBS中冰浴。(2) iIELs的分離利用30-40C預熱的含有ImM 二硫代蘇糖醇和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復沖洗小腸組織腸腔，順著腸道輕輕擠出腸腔中內容物。靜置后離心，利用大鼠淋巴細胞分離液分離iIELs。(3)所獲得的iIELs的鑒定通過胎盤藍染色檢測iIELs的活性，利用抗大鼠的APC-⑶3、FITC-⑶8和PE-TCR γ δ熒光抗體進行染色，通過流式細胞儀進行鑒定。上述淋巴細胞分離方法，其特征在于由以下步驟組成第一步，實驗動物的選擇選擇無特殊病原體感染(SPF級)的健康大鼠(6 8周，雌雄不限)，禁食過夜；第二步，小腸組織的提取及處理 利用CO2處死大鼠后，迅速剖腹，從胃的幽門下段Icm處剪斷小腸，直至盲腸上段Icm處取出小腸全部組織于PBS中；利用PBS反復清洗腸道，以去除腸道內的內容物及粘液；從小腸漿膜面剪去整個腸段中的每個peyer’s結,并將已剪掉peyer’s結的小腸段置于含有10%小牛血清和1%青鏈霉素雙抗的PBS中，冰??；第三步，腸上皮間淋巴細胞(iIELs)的分離利用37°C預熱的含有ImM二硫代蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)和10%小牛血清的DMEM(Deulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基反復沖洗小腸腸腔后,用彎鑷子順著腸道輕輕將腸腔中的粘液及部分細胞擠出；收集上述DMEM液體于離心管中，靜置15分鐘后，輕輕吸取上清于另一離心管中，離心；加入小牛血清重懸細胞，使細胞懸液濾過100目的篩網(wǎng)后，將含有細胞的小牛血清緩慢加入到裝有大鼠淋巴細胞分離液的離心管中，使淋巴細胞分離液與小牛血清細胞懸液中間保持明顯的分層，離心；小心吸取分層界面中的白色絮狀淋巴細胞，利用PBS洗去多余的淋巴細胞分離液；第四步，iIELs的鑒定利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色，顯微鏡下觀察計數(shù)細胞活性；同時使用APC標記的⑶3、FITC標記的⑶8和PE標記的TCR γ δ抗大鼠抗體對分離的淋巴細胞進行染色，流式細胞儀進行檢測檢測鑒定。本發(fā)明有益效果(I)本發(fā)明分離的淋巴細胞，存活率高，能達到90%以上。在⑶3+標記的T淋巴細胞中，⑶8+Τ淋巴細胞比例達到85-95%，而有30%是⑶8+TCR γ δ +雙陽性T淋巴細胞，檢測結果完全符合iIELs的表性特征。(2)本發(fā)明所構建的分離方法簡單易行，耗時少，提高了科研效率和科研經(jīng)費的使用效率；為探討iIELs的免疫調節(jié)機理及作用提供了非常有利的技術工具；此分離方法流程簡單，價格低廉，無需特殊的試劑盒儀器設備，極易推廣應用。


圖I本發(fā)明實施例I的流式細胞儀檢測結果
具體實施例方式下面通過以下實施例對本發(fā)明進行進一步的具體描述實施例I第一步，實驗動物的選擇選擇SPF級的健康的6 8周大鼠(雌雄不限)，實驗前禁食(撤掉食物，只給飲水)過夜14小時。第二步，小腸組織的提取及處理將禁食過的大鼠放入密閉的容器中，通入C02氣體5-10分鐘處死動物后，迅速剖腹，剪取胃的幽門下段Icm處至盲腸上段Icm處的全部小腸，小心剝離腸系膜，并置于盛有30ml O. OlmM PBS的培養(yǎng)皿中。并通過20ml的注射器利用PBS反復清洗腸道2遍，以去除腸道內的內容物及粘液。用彎剪自腸道的漿膜面逐一剪去整個腸段中的peyer’s結,將已剪掉peyer’s結的小腸組織置于盛有4°C保存的15ml含有10%小牛血清和I %青鏈霉素雙抗PBS的培養(yǎng)皿中，冰浴2小時。 第三步，腸上皮間淋巴細胞(iIELs)的分離利用37°C預熱的15 20ml含有ImMDTT和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，反復沖洗步驟二中冰浴后的小腸組織腸腔2遍，并用彎鑷子順著腸道輕輕將腸腔中的粘液及部分細胞擠出。收集上述DMEM液體于50ml離心管中，室溫條件下靜置15分鐘，帶粘液沉至管底后，用毛細管輕輕吸取上清于另一 50ml離心管中，2500rpm/min離心10分鐘。棄上清后,加入2ml小牛血清重懸細胞,使細胞懸液濾過100目的鋼絲篩網(wǎng)后,利用毛細管將含有細胞的小牛血清緩慢地加入到裝有2ml大鼠淋巴細胞分離液(天津好養(yǎng)生物制品有限責任公司，貨號LTS1083)的15ml離心管中，使淋巴細胞分離液與小牛血清細胞懸液中間保持明顯的分層。放入離心機中，2000rpm/min離心15分鐘(注意升降速度調節(jié)至lj“4”，以保證分離層不被破壞)。用毛細管小心吸取分離層界面中的白色絮狀淋巴細胞于一個干凈的15ml離心管中，加入5ml O. OlmM PBS混勻，2500rpm/min離心10分鐘，棄上清后再用PBS清洗一遍，以洗去細胞中的淋巴細胞分離液。第四步，iIELs的鑒定利用胎盤藍對分離獲得的淋巴細胞進行染色，顯微鏡下觀察計數(shù)細胞活性，分離得到的淋巴細胞存活率高達80%以上。同時，利用APC標記的CD3、FITC標記的⑶8和PE標記的TCR γ δ抗大鼠抗體對分離的淋巴細胞進行染色，流式細胞儀進行檢測鑒定。以⑶3+標記的T淋巴細胞圈門，其中⑶8+Τ淋巴細胞比例達到95%，而有30%是⑶8+TCRY δ +雙陽性T淋巴細胞，見圖I所示，這種檢測結果完全符合iIELs的表性特征。實施例2參數(shù)選擇如表I所示，其它操作步驟同實施例I。
權利要求
1.一種淋巴細胞分離方法，其特征在于所述分離方法是利用溫差法與淋巴細胞分離液相結合的方法。
2.根據(jù)權利要求I所述淋巴細胞分離方法，其特征在于所述淋巴細胞是腸上皮間淋巴細胞。
3.根據(jù)權利要求I或2所述淋巴細胞分離方法，所述溫差法是指待分離細胞在0-5°C冰浴后，在0-5min內轉移到30-40°C培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權利要3所述淋巴細胞分離方法，所述溫差法是指待分離細胞在4°C冰浴后，瞬間轉移到37°C培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權利要求3所述淋巴細胞分離方法，所述冰浴時間為1-4小時。
6.根據(jù)權利要求5所述淋巴細胞分離方法，所述冰浴時間為2小時。
7.根據(jù)權利要求3或5所述淋巴細胞分離方法，所述培養(yǎng)基是含有ImM二硫代蘇糖醇和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權利要求7所述淋巴細胞分離方法，所述淋巴細胞來源于大鼠小腸組織。
9.根據(jù)權利要求8所述淋巴細胞分離方法，其特征在于由以下步驟組成 小腸組織的提取和處理將禁食過夜的健康大鼠處死后，提取小腸組織，并用PBS沖洗腸腔，剪去peyer’ s結后，置于含有10%小牛血清、I %青鏈霉素雙抗的PBS中冰浴； iIELs的分離利用30-40°C預熱的含有ImM 二硫代蘇糖醇和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基反復沖洗小腸組織腸腔，順著腸道輕輕擠出腸腔中內容物； 靜置后離心，利用大鼠淋巴細胞分離液分離iIELs ； 所獲得的iIELs的鑒定通過胎盤藍染色檢測iIELs的活性，利用抗大鼠的APC-⑶3、FITC-⑶8和PE-TCR Y δ熒光抗體進行染色，通過流式細胞儀進行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種淋巴細胞分離方法，其特征在于所述分離方法是利用溫差法與淋巴細胞分離液相結合的方法。本發(fā)明分離的淋巴細胞，存活率高，能達到90％以上。且本法簡單易行，耗時少，提高了科研效率和科研經(jīng)費的使用效率；為探討iIELs的免疫調節(jié)機理及作用提供了非常有利的技術工具；此分離方法流程簡單，價格低廉，無需特殊的試劑盒儀器設備，極易推廣應用。
文檔編號C12N5/0783GK102796703SQ20121033682
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權日2012年9月13日
發(fā)明者陳潔, 劉霞, 徐鵬輝, 李廷玉, 魏小平 申請人:重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院