專利名稱：一種含有g(shù)b1蛋白融合標(biāo)簽的快速克隆及表達(dá)質(zhì)粒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，即一種含有GBl蛋白融合標(biāo)簽的快速克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的克隆方法是通過將質(zhì)粒載體同目的基因片段分別用相同的雙酶切消化后產(chǎn)生2-4個堿基的粘性末端，利用連接酶將互補的粘性末端進(jìn)行連接，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，表達(dá)純化蛋白。由于粘性末端長度比較短，后續(xù)必須通過T4 DNA連接酶將載體和目的基因片段進(jìn)行連接，并且在此過程中可能會有部分載體發(fā)生自連接。這種方法克隆基因 大約需要兩到三天時間。為了實現(xiàn)不依賴于連接酶的克隆方法，就需要構(gòu)建一種更加方便有效的克隆載體。而且，目前市場上的商品化載體能夠利用的融合標(biāo)簽也非常有限，將載體上設(shè)計的將目的蛋白同標(biāo)簽分離的蛋白酶價格也都比較昂貴?；谏鲜鰩追矫娴目紤]，有必要提供一種帶有常用的融合蛋白標(biāo)簽的快速克隆及蛋白表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，即一種在N端含有GBl融合蛋白標(biāo)簽并且能夠?qū)⒛康牡鞍椎幕蜻M(jìn)行快速克隆及蛋白表達(dá)的載體，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的所述的質(zhì)粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼GBl蛋白的基因片段；兩側(cè)帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。上述的GBl蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO: I。上述的兩側(cè)帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明的載體，還包括有轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列和復(fù)制子片段。本發(fā)明的載體，其遺傳圖譜如圖I所示,核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒載體用于在原核菌中表達(dá)重組蛋白。本發(fā)明構(gòu)建的載體可以在不依賴于連接酶的情況下實現(xiàn)目的基因的快速高效克隆及蛋白表達(dá)。并且在載體中引入了 GBl融合蛋白標(biāo)簽和TEV酶切位點，GBl融合蛋白標(biāo)簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位于GBl蛋白的基因序列的下游，通過TEV酶對純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，可以將GBl蛋白標(biāo)簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經(jīng)濟(jì)適用的酶，從而極大地節(jié)約了實驗成本。


圖I :本發(fā)明的質(zhì)粒載體PJM-GBI的遺傳圖譜；圖2 :重組蛋白pJM-GBI的表達(dá)純化蛋白圖譜；
其中M、PageRuler PrestainedProtein Ladder ;1、誘導(dǎo)前 BL21/pJM_GBl 的總蛋白；2、誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解并離心后的上清部分；3、誘導(dǎo)后經(jīng)超聲裂解并離心后的沉淀部分；4、親和層析流穿液；5、20mM咪唑洗滌液；6、200mM咪唑洗脫液。
具體實施例方式本發(fā)明的載體以pET_24d為出發(fā)質(zhì)粒，在構(gòu)建過程中，分別加入了 GBl蛋白基因，TEV酶切位點以及GFP基因。在GFP基因兩側(cè)各引入了一個BsaI單酶切位點。一方面，通過BsaI單酶切，該載體被線性化并在線性化的片段兩側(cè)各產(chǎn)生5'端突出的4個堿基的粘性末端，通過T4 DNA Polymerase及dTTP處理后，粘性末端的堿基數(shù)各增加至10個和12個，利用該粘性末端，能夠方便快速將的目的基因克隆到該載體上并進(jìn)行蛋白的表達(dá)純化。另一方面，為了更快，更方便的控制克隆質(zhì)量，在克隆的酶切位點BsaI位點中間插入的GFP 基因，在后續(xù)篩選陽性克隆的過程中，能夠通過觀察是否產(chǎn)生綠色熒光，來判斷克隆基因是否插入到載體當(dāng)中。下面對本發(fā)明的載體構(gòu)建過程及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。一、表達(dá)質(zhì)粒載體(pJM-GBl)的構(gòu)建第一步，在pET_24d (購買自Novogen公司，編號69772-3)的多克隆位點的N端加上his-Tag-GBl標(biāo)簽及TEV酶切位點。首先全序列合成his-tag-GBl-TEV，合成時在his-tag-GBl-TEV核酸序列的兩端分別加上XbaI和NcoI的酶切位點，再連接到克隆載體上(其中his-tag-GBI-Tag-TEV序列為SEQ ID NO: I)。制備的克隆質(zhì)粒用XbaI和NcoI雙酶切后得到包含有his-Tag-GBl標(biāo)簽的小片段，與pET-24d經(jīng)過XbaI和NcoI雙酶切處理得到的載體進(jìn)行連接，通過篩選得到N端帶有his-Tag-GBl標(biāo)簽及TEV酶切位點的質(zhì)粒，暫時命名為 pET-24d-GBl。第二步，將兩個BsaI酶切位點引入上述構(gòu)建好的質(zhì)粒pET-24d_GBl當(dāng)中，取代其中的多克隆位點。設(shè)計引物引物合成時要求5’端經(jīng)過磷酸化修飾上游引物5’ -GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3 ’下游引物5’ -CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3 ’以pET-24d-GBl_Tag為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后利用T4連接酶連接，篩選得到帶有BsaI酶切位點的質(zhì)粒pET-24d-GBl-2BsaI。第三步，根據(jù)GFP蛋白(SEQ ID NO: 2)的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆載體上。制備的克隆載體用BsaI酶切處理后得到的包含GFP的片段，與pET-24d-GBl-2BsaI經(jīng)過BsaI酶切處理后的載體進(jìn)行連接，得到最終的質(zhì)粒pJM_GBl。制備的質(zhì)粒pJM-GBl的遺傳圖譜如圖I所示，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3。二、本發(fā)明質(zhì)粒的應(yīng)用效果檢測本發(fā)明提供的質(zhì)粒載體在其GFP基因外側(cè)各包含一個BsaI的酶切位點(黑體表示)，該載體經(jīng)BsaI單酶切去除GFP基因后，載體被線性化，并且在線性化的片段兩側(cè)各產(chǎn)生5’端突出的4個堿基的粘性末端。BsaI酶切后的載體經(jīng)過T4 DNA polymerse和dTTP處理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端堿基直到遇到T終止，由此質(zhì)粒載體被線性化并且兩端的粘性末端堿基數(shù)目增加至10個和12個。該粘性末端可以在不依賴于連接酶的情況下同互補鏈發(fā)生特異性的退火。
ATTTTCAGGGCGCCATGAGACCG.. .GFP. ■ .GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCAC TAAAAGTCCCGCGGTACTCTGGC.. .GFP.. CCAGAGTGGCGCAGCCCAGTGGTG
h /I
V
ATTTTCAGGGCGCCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTCAGCCCAGTGGTG
T4 DNA polymerse +dTTP
V
ATTTTCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTTGGTG具體實驗步驟I. BsaI消化質(zhì)粒載體配置混合體系5 μ g質(zhì)粒載體2. 5 μ I BsaI (lOunits/ μ I)5 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 3無菌水補齊到50 μ I5(TC 酶切 Ih。O. 8%瓊脂糖電泳檢測酶切效果，膠回收質(zhì)粒載體片段。2. T4 DNA polymerse 處理質(zhì)粒載體配置混合體系600ng BsaI消化后載體O. 5μ I dTTP(IOOmM)I μ I DTT(IOOmM)O. 2μ I 100XBSAO.4 μ I T4 DNA polymerse(3units/μ I)2 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 2無菌水補齊到20 μ I22°C孵育 3Omin。75°C孵育 2Omin,滅活 T4 DNA polymerse。制備目的基因片段2. 2. I設(shè)計目的基因的引物 上游引物CAGGGCGCCATG-目的基因下游引物GACCCGACGCGGTTA_目的基因上下游引物含有同質(zhì)粒載體粘性末端互補的堿基序列，上游引物中含有ATG起始密碼子，下游引物含有TAA終止密碼子。2. 2. 2 利用 T4 DNA polymerse 處理 PCR 產(chǎn)物利用設(shè)計好的引物，以目的基因為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出來的產(chǎn)物回收后，利用T4 DNA polymerse和dATP處理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端堿基直到遇到A終止。
CAGGGCGCCATG...!丨的 ...TAACCGCGTCGGGTC GTCCCGCGGTAC.」11城W.. .ATTGGCGCAGCCCAG
^ 7 T4 DNA polymerse +dATP
CAGGGCGCCATG...目的基因...TAA
AC I 的 IM...ATTGGCGCAGCCCAG2. 3目的基因片段同載體進(jìn)行快速連接
CAGGGCGCCATG... S 的基因...TAA
AC...目的基因...ATTGGCGCAGCCCAG
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ATTTTCAGGGCGCCATG... 11 的 .. .TAACCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTAC... i I ^ W.. .ATTGGCGCAGCCCAGTGGTG取I. 5ml離心管，按照下面方法操作取I μ I處理好的質(zhì)粒載體(25_50ng)，同2 μ I處理好的目的基因片段(O. 02pmol)混勻后置于22°C孵育5min。加入I μ I EDTA(25mM)，混合后置于22°C繼續(xù)孵育5min。利用本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建新的克隆，從PCR結(jié)束到連接的完成，僅僅需要Ih即可完成。而傳統(tǒng)的方法需要通過對目的基因片段進(jìn)行雙酶切后再利用T4 DNA連接酶連接，一般需要Id時間。2. 4 轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。2. 5鑒定陽性克隆通過菌落PCR方法鑒定陽性克隆，測序表明為目的陽性克隆。本發(fā)明所述的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，最佳的大腸桿菌細(xì)胞為BL2U BL21(DE3)等。表達(dá)質(zhì)粒pJM-GBl轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)至0D600約為O. 6，加入終濃度為O. 3mM IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物跑SDS-PAGE電泳。如圖2所示，第二泳道為目的蛋白的可溶性表達(dá)量，第六泳道為純化后的電泳結(jié)果；上述結(jié)果表明目的蛋白的可溶性表達(dá)量和純度都滿足實驗的需要。利用本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒成功的表達(dá)出一種蛋白質(zhì)連接酶(SortaseA)的缺失體蛋白SortaseA (61_621)，可溶性效果很好。首先設(shè)計目的基因的引物上游引物5’ -CAGGGCGCCAT GGCATATTTGT-3’ 下游引物 5’ -GACCCGACGCGGTTATT TGACTTCT-3’，以含有Sortase基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物回收后利用BsaI進(jìn)行酶切處理，與pJM_GBl載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a ，篩選得到陽性克隆。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21,IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，利用鎳柱親和層析對該蛋白進(jìn)行純化，通過TEV酶對純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，將GBl蛋白標(biāo)簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經(jīng)濟(jì)適用的酶，這也極大地節(jié)約了實驗成本。
權(quán)利要求
1.一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，其特征在于所述的質(zhì)粒載體包含有 O一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼GBl蛋白的基因片段； 2)兩側(cè)帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。
2.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的編碼GBl蛋白的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:I。
3.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的兩側(cè)帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4.如權(quán)利要求I所述的載體，其特征更在于所述的質(zhì)粒載體還包括有轉(zhuǎn)錄啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、卡那霉素編碼序列和復(fù)制子片段。
5.權(quán)利要求I所述的載體，其遺傳圖譜如圖I所示。
6.權(quán)利要求I所述的載體，其核苷酸序列為SEQID N0:3。
7.權(quán)利要求I所述的載體用于在原核菌中高效表達(dá)重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種克隆及蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用于編碼GB1蛋白的基因序列和兩側(cè)帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。本發(fā)明構(gòu)建的載體可以在不依賴于連接酶的情況下實現(xiàn)目的基因的快速高效克隆及蛋白表達(dá)。并且在載體中引入了GB1融合蛋白標(biāo)簽和TEV酶切位點，GB1融合蛋白標(biāo)簽幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位于GB1蛋白的基因序列的下游，通過TEV酶對純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行切割，可以將GB1蛋白標(biāo)簽切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經(jīng)濟(jì)適用的酶，從而極大地節(jié)約了實驗成本。
文檔編號C12N15/63GK102827858SQ201210336689
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者鄒培建, 蓋園明, 趙普亞, 秦剛 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所