專利名稱：抗人前胃液素多肽免疫組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改良的抗人類延伸型胃泌素免疫組合物。
背景技術(shù)：
胃腸腫瘤是人類最常見的腫瘤，也是導(dǎo)致世界上許多國家死亡率最高的疾病。已知許多生長因子尤其是由前胃泌素原加工處理過程中產(chǎn)生的肽類激素家族影響惡性胃腸 細(xì)胞的增殖。前胃泌素原在正常組織中成熟過程涉及前胃液素中間體的多個(gè)加工處理步 驟，最終在外周循環(huán)中形成酰胺化形式的胃泌素，即胃泌素G34和胃泌素G17，又分別被稱 為“大”胃泌素和“小”胃泌素。已知這些激素可調(diào)節(jié)黏膜細(xì)胞的增殖和進(jìn)食后(餐后)胃 酸的分泌。有報(bào)道稱前胃液素、胃泌素尤其是G17和甘氨酸延伸型胃泌素(gly_G17)在體 內(nèi)外可營養(yǎng)惡性胃腸腫瘤細(xì)胞的生長，因此，許多實(shí)驗(yàn)都支持靶向抑制胃泌素的治療方法。已知免疫抑制特定的促進(jìn)腫瘤生長因子和激素對于治療特定的疾病和癌癥，特別 是胸部、肺部和某些胃腸(GI)型腫瘤很有效。此外，免疫學(xué)療法對于預(yù)防和治療胃-食管和 胃-十二指腸潰瘍這些慢性病也很有效。一些治療方法已成功應(yīng)用，其中最引人注目的是 用靶向人的或人源單抗的方法。然而，建立生產(chǎn)人源單抗生產(chǎn)線需要巨額投資，購買商業(yè)化 的人源單抗不僅費(fèi)用高，而且運(yùn)輸也是問題，考慮到上述因素，在發(fā)展中國家急需建立低成 本的治療策略。對于胃腸腫瘤或疾病，在治療上應(yīng)采用能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和促胃腸肽激素生物 活性的中和抗體。要求這些抗體必須是特異性針對特定生長因子或激素或激素前體。治療 一種特定疾病可以選擇一種或多種因子或激素。例如，人胃腸道胃泌激素17(“huG17”)參 與胃腸疾病過程，包括胃食管返流疾病，由于“huG17”可刺激產(chǎn)生酸性物質(zhì)，造成胃和十二 指腸潰瘍。此外，huG17還可刺激一些胃腸腫瘤細(xì)胞生長。因此，能中和huG17活性的抗 huG17抗體在臨床上被用來治療由huG17誘導(dǎo)和參與的疾病.可以將抗huG17抗體直接給病人注射(即通過被動免疫)或通過主動免疫讓病人 自己產(chǎn)生抗huG17的抗體來達(dá)到治療目的。同樣，盡管人們認(rèn)為在外周循環(huán)中只有酰胺化 的胃泌激素才具有生物活性，但根據(jù)已有的臨床胃腸腫瘤及其衍生的人癌細(xì)胞株的研究， 表明前胃泌素原的前胃液素形式也具有促細(xì)胞增殖潛能。事實(shí)上，胃腸腫瘤細(xì)胞沒有能力 將胃泌激素前體如前胃泌素原和前胃液素加工成正常的酰胺化形式的能力，因此，腫瘤患 者血清中胃泌激素的前體水平較酰胺化的形式高。有報(bào)道，與結(jié)腸直腸息肉或正常人相比，結(jié)腸直腸癌患者血漿中前胃液素的水平， 而不是酰胺化或甘氨酸延伸型前胃液素顯著提高(Siddheshwar et al.，2001)。在結(jié)腸癌 腫瘤患者體內(nèi)，前胃液素、酰胺化的胃泌激素、總胃泌激素與甘氨酸延伸型前胃液素的檢出 率分別為100%,69%, 56%, and 44% (Ciccotosto et al，1995)，該現(xiàn)象提示腫瘤患者的 胃泌激素加工的確存在異常。通過給予患者具有一定化學(xué)結(jié)構(gòu)的、誘導(dǎo)產(chǎn)生能與靶因子或激素結(jié)合的抗體的免 疫原，可以完成針對生長因子或胃腸激素的主動免疫。使用的免疫原在結(jié)構(gòu)上應(yīng)該是靶分 子或靶激素的抗原模擬肽，且含有能與靶分子或靶激素或其抗原表位發(fā)生交叉反應(yīng)的分子。這些抗原模擬肽具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力。例如，某靶分子具有一定的免 疫原性，但天然的抗原模擬肽往往其免疫原性較低，無法有效激活機(jī)體免疫反應(yīng)，所以必須 將該模擬肽與具有強(qiáng)免疫刺激的免疫載體偶聯(lián)形成具有免疫活性的復(fù)合物。典型的抗原模擬肽具有兩個(gè)功能域一個(gè)可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的抗原肽序列，一 個(gè)間隔子?？乖M肽的功能是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生能夠與肽靶分子結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。任何具有 可以與huG17肽單一抗原表位發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)均可作為抗原模擬肽。優(yōu)選實(shí) 施例中的抗原模擬肽是包含huG17的氨基末端表位的huG17片段，其可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗人 小胃泌激素及甘氨酸延伸型胃泌激素的交叉反應(yīng)抗體。其中的間隔子作為抗原模擬肽與載 體分子之間的連接點(diǎn)，也會影響機(jī)體對免疫原表位部分的免疫應(yīng)答。最近用一種具有專利權(quán)的huG17分子的N-末端9肽通過一個(gè)間隔子與白喉類 毒素偶聯(lián)制備的免疫原，不僅可成功抑制了實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍的發(fā)生，還可抑制人的胃腸腫 瘤移植物在免疫缺損小鼠體內(nèi)生長。許多臨床試驗(yàn)也證實(shí)，給胃腸腫瘤患者使用該免疫原 (被稱為G17DT)也得到很好的結(jié)果(Watson et al，2001)，但遺憾的是，最近在美國給晚期 胰腺癌患者進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)并沒有得到理想的治療效果。盡管在早期臨床試驗(yàn)中顯 示出一些成功，但G17DT的使用并未考慮到胃泌素基因表達(dá)的異質(zhì)性，尤其在胃腸惡性腫 瘤中。雖然正常胃黏膜細(xì)胞和組織分泌/外周循環(huán)最多的胃泌素是G17和G34，但多數(shù)報(bào)道 顯示在外周循環(huán)中G34含量占胃泌素的50%，甚至10-20%。大多數(shù)胃泌素是被加工的被 稱為前胃液素的中間體，前胃液素具有獨(dú)立(獨(dú)立于傳統(tǒng)的胃泌素受體)的生長促進(jìn)活性。 這樣，由G17DT誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體只可捕獲G17和C-末端延伸的形式，卻不能捕獲胃腸患者 循環(huán)中大量存在的未被加工或部分加工的胃泌素(前胃液素)。針對重大缺陷和關(guān)鍵問題， 我們對其序列進(jìn)行了新的設(shè)計(jì)，使得新型多肽免疫組合物物激活機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體能 在腫瘤患者循環(huán)中同時(shí)捕獲存在的胃泌素和前胃液素。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們已確定的是huG17抗原模擬肽與特定的間隔子肽偶聯(lián)可提高模擬 肽的免疫原性，與以前使用的免疫原相比，產(chǎn)生了意想不到的改善免疫反應(yīng)的效果。我們制 備的免疫原可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對前胃液素和經(jīng)加工處理的前胃液素N-末端氨基酸的多克隆抗 體，該免疫原包含了已鑒定的 Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO :1 的肽段，該肽段偶聯(lián)了一個(gè)免疫載體白 喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳素等。其中在該實(shí)施例中破傷風(fēng)類毒素是與抗原模擬肽偶 聯(lián)的優(yōu)選免疫載體，而抗原模擬肽為一個(gè)21個(gè)氨基酸的肽段(G21肽，即“前胃泌素”(前胃 泌素原的第88-101氨基酸殘基)連接7個(gè)氨基酸的“間隔子”)。另一個(gè)改進(jìn)的免疫原可 誘導(dǎo)產(chǎn)生針對huG17和gly-huG17氨基末端的多克隆抗體，該免疫原包含了已鑒定的SEQ ID NO 2 的肽段 pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys，該肽段偶聯(lián)了一個(gè)免疫載體白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、百日咳素等，β Leu 為亮氨酸的β氨基酸類似物。破傷風(fēng)類毒素是該肽段(G-18肽)(即為經(jīng)過修飾的huG17 的N-末端(前胃泌素原第76-86肽段)上連接一個(gè)7氨基酸的間隔子)優(yōu)選的免疫載體。使用經(jīng)過修飾的氨基酸常?？商岣咂渑B的抗原肽“異源的”特性，與未經(jīng)修飾的天然的抗 原肽相比，可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的交叉反應(yīng)性抗體。已被鑒定的SEQ ID NO :3pGlu-Gly-Pro一Trp一Val一Glu一Glu一Glu一Glu一Glu_Ala一Thr一Thr一Pro一Pro一Pro一pro一Cys 與白喉類毒素、破 傷風(fēng)類毒素或百日咳素等免疫載體偶聯(lián)，其中破傷風(fēng)類毒素是該肽段(G18LV)，即“修飾的 huG17的N-末端”(包含修飾的前胃泌素原第76-86肽段)連接一個(gè)7氨基酸的間隔子形 成的huG17同源抗原模擬肽的優(yōu)選免疫載體。已被鑒定SEQID NO 4序列為pGlu-Gly-Pro -Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, (G18LI肽)，也形成 一個(gè)huG17同源抗原模擬肽。序列表中SEQ ID NO 5的序列為Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp -Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly ；即(G-20)肽，包含一個(gè) 甘氨酸延伸的huG17抗原模擬肽(前胃泌素原第79-93氨基酸殘基)連接一個(gè)7個(gè)氨基酸 的間隔子。序列表中 SEQ ID NO :6 的序列是 Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu -Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, (G20YF)，包含了一個(gè)經(jīng)過修飾的甘氨 酸延伸的huG17抗原模擬肽(前胃泌素原第79-93氨基酸殘基)連接一個(gè)7個(gè)氨基酸的間 隔子。其余的肽序列(SEQ ID NO :7-10)，包含一個(gè)或多個(gè)脯氨酰氨基酸的D型異構(gòu)體，在 免疫載體上，這些氨基酸對于正確呈遞其毗鄰的抗原肽非常重要。D型氨基酸異構(gòu)體不僅使 免疫原在構(gòu)象上，而且使其在體內(nèi)的儲留時(shí)間上均利于APC細(xì)胞的呈遞，產(chǎn)生高滴度的抗體。序列表中鑒定為SEQ ID NO. :7的載體肽是間隔子肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys， 序列表中 SEQ ID NO. :8 是間隔子肽 Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys，SEQ ID NO. 9間隔子肽序列是Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. 10間隔子肽序列是 Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys，序列表中 SEQ ID NO :7_10 均為間隔子肽。一般來說，用抗原模擬肽-載體復(fù)合物進(jìn)行免疫，需要注射2次或2次以上，且需 要幾周或幾個(gè)月的時(shí)間才能使抗體滴度升到理想水平。用本發(fā)明改進(jìn)的免疫原在初次免疫 后很短的時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生有效水平的抗體，抗體水平可穩(wěn)定維持幾個(gè)月之久，且只需一次 加強(qiáng)免疫即可迅速產(chǎn)生更高水平的抗體。


圖1(1A、1B、1C、1D)描述ELISA檢測的小鼠抗體反應(yīng)，其是對三個(gè)多肽免疫原的免 疫反應(yīng)，該多肽免疫原分別含有偶聯(lián)物hG18TT ；hG18DT ；hG21TT和hG21DT，其中，圖IA為小 鼠抗人GT18TT ELISA滴度，圖IB為小鼠抗人GT18DT ELISA滴度，圖IC為小鼠抗人GT21TT ELISA滴度，圖ID為小鼠抗人GT21DT ELISA滴度。圖2 (2A、2B)描述了給予與實(shí)施例1和實(shí)施例2中的與肽1 (hG18TT)和肽 2(hG21TT)偶聯(lián)結(jié)合的多肽免疫組合物后，ELISA法檢測的兔中抗體反應(yīng)結(jié)果，其中，圖2A 為兔抗G18滴度，圖2B為兔抗G21ELISA滴度。圖3描述了用hG18TT和hG21DT多肽免疫組合物免疫處理小鼠對移植的人胃癌細(xì) 胞(BCC-823細(xì)胞)的抑制作用，將含有人胃癌細(xì)胞的無菌的中空密封纖維管移植給42日 齡小鼠。如圖所示，一些動物除了接受免疫原外還接受了傳統(tǒng)的胃癌化療藥物。圖4(4A、 4B、4C、4D)描述ELISA檢測的小鼠抗體反應(yīng)比較，其中，圖4A為小鼠抗人G18-a TT與小鼠 抗人G21TT抗體滴度比較，圖4B為小鼠抗人G18-b TT與小鼠抗人G21TT抗體滴度比較，圖 4C為小鼠抗人G20TT與小鼠抗人G21TT抗體滴度比較，圖4D為小鼠抗人G20_a TT與小鼠 抗人G21TT抗體滴度比較。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1多肽合成采用標(biāo)準(zhǔn)固相合成方法。每個(gè)多肽的氨基酸含量和純度均采用本領(lǐng)域通 用的方法進(jìn)行了鑒定。合成如下列氨基酸序列的多肽肽的氨基酸序列1) Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn(SEQ ID NO. 1)(G-21) ；2)pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(SEQ ID NO. 2) (G-18) ；3) (hu G17 同源物)pGlu-Gly-Pro-Trp-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro -pro-Cys(SEQ ID NO. 3) (G-18LV) ；4)pGlu-Gly-Pro-Trp-IIe-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala -Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys(SEQ ID NO. 4)(G18LI) ；5)Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Le u-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly ； (SEQ ID No. 5)(G_20a) ；6) Cy s-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Me t-Asp-Phe-Gly ； (SEQ ID No. 6) (G_20b) ；7) Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :7 ；絲氨 ?；?脯胺醯基(Seryl-Prolyl)間隔子 7 氨基酸肽；8) Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys， SEQ ID NO. :8 ；絲氨?；?絲氨?；緿-脯胺醯基間隔子7氨基酸肽，and 9) Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :9 (蘇胺醯基-脯胺醯基(Threonyl-Prolyl) 7 氨基酸肽)，and 10) Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :10(蘇胺醯基-蘇胺醯 基全部D-脯胺醯基7氨基酸肽)。肽1(SEQ ID NO . 1)包含前胃泌素的氨基端模擬肽(-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-G Iy-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn),碳末端間隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys (SEQ ID NO. :7)連接到該前胃泌素原殘基88-101的N末端.肽2 (SEQ ID NO. :2)包含 huG17 的 11 個(gè)氨基酸(pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-β Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-，用 β 亮氨 酸代替了亮氨酸的 huG17 的同源物，間隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-D-Pro-Cys，(SEQ ID NO. :7)連接到huG17抗原模擬肽的氨基酸殘基86的C末端.肽1(SEQ ID NO. :3)包含 抗原模擬肽同源物的上述11個(gè)氨基酸(除了用纈氨酸代替了 β亮氨酸外，其余與肽2中 的相同)，-Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys，(SEQ ID NO. 8)連接到上述前胃泌素原的氨 基酸殘基86的C末端。肽i(SEQ IDN0. 4)包含huG17的11個(gè)抗原模擬肽(pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly(與肽 2 中的相 同，除了用亮氨酸代替了纈氨酸)，間隔子(-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys ；SEQ ID N0. 7)連接到該人前胃泌素原的氨基酸殘基79的C末端。肽^iSEQ ID NO. 5)含有huG17的 15 個(gè)抗原模擬肽 gly-huG17 Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly，間隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys ； (SEQ IDN0. 7)連接到該人前胃泌素原 的氨基酸殘基79的N末端，形成huG17的甘氨酸延伸型模擬肽；肽^iSEQ ID NO. 6)包含 para-nitrophenylalanine修飾的甘氨酸_huG17的15個(gè)免疫模擬氨基酸Trp-Ile-Glu-G lu-Glu-Glu-Glu-Ala-pN02-Phe-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly,間隔子-Ser-Ser-Pro-Pro-Pr o-pro-Cys (SEQ ID NO. 7)連接到該人前胃泌素原的氨基酸殘基79的N末端，形成huG17 的甘氨酸延伸型模擬肽。ltl(SEQ ID NO:. 1)包含前胃液素的抗原模擬肽(-Gly-Trp-Me t-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn)，羧基端間隔子(SEQID N0. 8)連接到該人前胃泌素原的氨基酸88-101肽段的N末端，形成人前胃液素模擬肽。I在優(yōu)選的方法中，每一個(gè)多肽通過末端的半胱氨酸殘基端利用異(基)雙功能 試劑被偶聯(lián)到免疫載體破傷風(fēng)類毒素(TT)的氨基，該雙功能試劑在一端含有琥珀酰亞胺 酯，另一端含有馬來酰亞胺。為了完成上述多肽1和2與載體連接，多肽的半胱氨酸首先要 被還原。多肽干粉用PH7-9含有5-50摩爾過量二硫蘇糖醇(DTT)的0. IM的PBS緩沖液溶 解。然后真空凍干保存直至使用。
采用異(基)雙功能試劑ε -maleimidocaproic酸N-羥基琥珀酰亞胺酯 (epsilon-maleimidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester, ^MCS“)處理破傷風(fēng)類 毒素(TT)使之被激活，按每IO5相對分子量的TT大約25個(gè)游離氨基的比例加入異(基) 雙功能試劑.采用超濾的方法進(jìn)行破傷風(fēng)類毒素的純化?；厥盏募兓腡T的最終濃度應(yīng) 大于5-40mg/ml。采用色譜法進(jìn)行純度測定(SEC HPLC)，Lowry法進(jìn)行蛋白濃度測定，(水 合)茚三酮法測定游離的氨基。通過商業(yè)途徑獲得多肽(Biosyn Corp, USA)，已知其還原程度及含量的肽用于與 載體偶聯(lián)。多肽經(jīng)TCEP (tris (2-carboxyethyl) -phosphine-HCl)進(jìn)行還原，然后該混合物 用于偶聯(lián)。Ellmans分析可用于進(jìn)行游離氫硫化物基團(tuán)(sulfhydral)的檢測。破傷風(fēng)類毒 素的激活首先用活化緩沖液將純化的TT稀釋到5-50mg/ml，然后將需要量的TT轉(zhuǎn)移至玻 璃瓶，加入EMCS(50-90mg/ml 二甲基甲酰胺(DMF)到TT溶液中，EMCS/TT的摩爾比率決定 了活化水平。進(jìn)行超濾以純化活化物。最后經(jīng)過濃縮，使蛋白濃度大于5-50mgTT/ml。將濃 縮后的TT采用色譜法(SEC HPLC)進(jìn)行純度測定，Lowry法進(jìn)行蛋白濃度測定，Ellman' s 法測定TT的活性水平。多肽-TT的偶聯(lián)首先計(jì)算與Maleimido-TT反應(yīng)所需要的多肽的 量，然后將多肽加入到M-TT溶液中，多肽-TT偶聯(lián)物經(jīng)過超濾的方法進(jìn)行純化，純化后過濾 除菌。采用色譜法(SEC HPLC)進(jìn)行純度測定，Lowry法進(jìn)行蛋白濃度測定，氨基酸分析法 確定交聯(lián)的比率。多肽G18和G21通過EMCS與TT形成的的偶聯(lián)物再經(jīng)4°C G50S印hadex低壓層析 分離純化，采用0. 1-05M的碳酸銨平衡。洗脫液經(jīng)冷凍干燥后低溫保存?zhèn)溆?。偶?lián)物可以被稱為多肽免疫組合物，其含量可通過本領(lǐng)域公知的多種方法，如重 量增加、氨基酸分析等進(jìn)行測定。按照該方法制備的G18和G21與TT的偶聯(lián)物，經(jīng)氨基酸分 析法測定，每IO4-IO6MW的TT含有10-30摩爾的多肽，所有的偶聯(lián)物適合作為免疫原去免疫 動物。同樣地，經(jīng)相同方法制備的G18和G21與DT的偶聯(lián)物，-采用huG17為基礎(chǔ)經(jīng)ELISA 方法對抗體的結(jié)合情況進(jìn)行了分析。實(shí)施例2實(shí)施例1中的多肽-TT交聯(lián)物乳化后進(jìn)行免疫，乳化物制備方法如下交聯(lián)物與佐 劑在水相中的濃度是在最終乳化物中濃度的2倍。，交聯(lián)物溶解在pH為6. 5-8的PBS中，使 最終濃度達(dá)5-12mg/ml。將水相與油相介質(zhì)按1 1 (體積/體積)混合形成包含最終免疫 原的乳化物。各種類型的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的油狀介質(zhì)都可使用。其中有一種油相介質(zhì) 是由20-60份角鯊烯、70-30份角鯊?fù)椤?-12份司盤80、0. 6-2份單硬脂酸鉛、0. 1-1份吐溫 80和0. 2-1. 2份吐溫40混合而成。水相與油相可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法混 合并形成乳化劑的混合物。乳化劑在儲存過程中必須穩(wěn)定(如在幾周到幾個(gè)月的保藏期不 能出現(xiàn)明顯的油相和水相分離的現(xiàn)象)，另外，其粘稠度也要一致，以便可用可接受的皮下注射針注射。含有免疫原的水相的油狀介質(zhì)按1 1(V/V)的比例，通過中間由一個(gè)18號針頭 大小的針狀物(乳膠管)聯(lián)通的兩個(gè)玻璃注射器進(jìn)行乳化，需要使水相與油狀介質(zhì)的混合 物反復(fù)通過針管50次。乳化好的免疫原隨即吸入一次性注射器內(nèi)用于給動物免疫。實(shí)施 例4所使用的免疫原最終濃度是交聯(lián)物hG18-TT為1-5. Omg/ml實(shí)施例3正如在實(shí)施例1和2中描述的那樣，我們用實(shí)施例1中的肽G18和G21分別與TT和DT連接構(gòu)建了交聯(lián)物，然后用肽G18免疫原(圖1A，1B)和肽G21免疫原(圖1C，1D)分 別免疫6只小鼠。實(shí)施例4正如在實(shí)施例1和2中描述的那樣，我們用實(shí)施例1中的交聯(lián)物G18和G21分別 與TT和DT連接構(gòu)建了交聯(lián)物，然后用肽G18TT免疫原免疫4只家兔(圖2A)，用肽G21TT 免疫原免疫4只家兔(圖2B)。圖1和圖2的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從對不同動物免疫應(yīng)答誘導(dǎo)潛能及誘導(dǎo)產(chǎn)生 的抗體維持情況看，免疫原1和2(實(shí)施例1和實(shí)施例2)是有效的。實(shí)施例5正如在實(shí)施例1和2中描述的那樣，我們用交聯(lián)物G18和G21分別與TT和DT連 接構(gòu)建了兩種交聯(lián)物，然后用免疫原G18TT和G21TT分別免疫了 6只小鼠。在抗體滴度達(dá) 到高峰時(shí)(42天)，所有小鼠腹腔植入每2. Ocm攜帶50，OOO個(gè)人胃癌細(xì)胞(BCG-823)的中 空纖維管，植入的纖維管壁口徑小于500KD，所以宿主細(xì)胞，如CTL和NK細(xì)胞等無法滲入，使 人腫瘤細(xì)胞在有免疫活性的小鼠體內(nèi)存活。5天后取出植入的纖維管，MTT法計(jì)數(shù)活細(xì)胞， 并與植入非免疫小鼠的對照組進(jìn)行比較。按照實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，給有些小鼠注射一次順_ 二氯二 氨絡(luò)鉬(cisplatin，CP)，劑量10mg/kg ；或注射一次5-氟尿嘧啶(5-FU)，劑量為20mg/kg ； 或?qū)烧呗?lián)合注射(CP+5-FU，F(xiàn)UP) —次，兩種藥物劑量均為10mg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。根據(jù)使用抗胃泌素/前胃液素(免疫原G18和G21)抑制人胃 癌細(xì)胞生長，以及在傳統(tǒng)化療基礎(chǔ)上由免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的抗體反應(yīng)可知，免疫原1和 2(實(shí)施例1和2中制備的)是有效的。圖3為人胃癌細(xì)胞(BCG-823)生長抑制率。(相對于未經(jīng)藥物處理的陰性對照(綠 色柱)細(xì)胞，G18TT或G21不與化療藥聯(lián)用或與化療藥聯(lián)用對人胃癌細(xì)胞(BCG-823)生長 抑制作用)，其中，CP為cisplatin (即順-二氯二氨絡(luò)鉬)，5FU為5-氟尿嘧啶，F(xiàn)CP為CP 和5FU的聯(lián)合。與未處理的陰性對照細(xì)胞相比，G18TT與G21TT對人胃癌細(xì)胞的生長抑制 達(dá)到60%。實(shí)施例6用在實(shí)施例1和實(shí)施例2中已描述的方法，我們構(gòu)建了與實(shí)施例1中列舉的相似 的包含G18a，G18b，G20，G20-a和G21抗原肽的耦合抗原，所有抗原與破傷風(fēng)毒素進(jìn)行了交 聯(lián)。然后我們用Gla8TT，G18bTT，G20TT和G20aTT分別免疫6只小鼠，并對這些抗原誘導(dǎo)產(chǎn) 生抗體的能力與G21抗原肽進(jìn)行了比較。(圖4A-D)如上所示，G18-a, G_18_b，G20和G20_a免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗胃泌激素抗體與G21 相當(dāng)，或優(yōu)于已報(bào)道的G17DT。
對模擬肽及抗原肽間隔子進(jìn)行改進(jìn)制備的免疫原，通過對肽免疫原與沒有用模擬肽和間隔子的免疫原的免疫原性進(jìn)行的測試，我們發(fā)現(xiàn)免疫效果均較差，因此，我們對免疫 模擬肽及間隔子進(jìn)行了修改和完善。本發(fā)明引用的參考文獻(xiàn)為1.專利文獻(xiàn)US40693131978.6 Woodhour et al.US42017701980.5 StevensUS43849951983.3 StevensUS45267161985.7 StevensUS46910061987.9 SteyensUS48944431990.1 Greenfield et al.US50230771991.6 Gevas et al.US51208291992.6 Pierschbacher et al.US52565421993. 10 ChangUS54684941995.11 Gevas et al.W01997/028821 1997.7 Gevas et al.2.非專利文獻(xiàn)Kothary, et al. " Identification of Progastrin-17 " , Biochem. Biophys. Res. Comm. 146 =884-888,1987. ·Larsson, " Characterization of Antral Gastrin Cells with Region-Specific Antiserum" , J. Histochem. Cytocem. 25 :1317_21,1977..Nemeth,J. " Development of a Sequence-Specific RIA by Using N-Terminal Gastrin l-13Antibody“ ，Chem. Abs. 98 :51653w,1983..Dockray, G. J. " Immunochemical Studies on Big Gastrin Using NH. sub. 2-Terminal specificAntiserums" , Chem. Abs. 94 :119200w,1981..Iwanaga, T. " Immunocytochemical Localization of the Different Gastrin Forms in the PyloricAntrum" , Biom. Res. 1 :316_320,1980..Cunningham, et al. " High-Resolution Epitope Mapping of hGH-Receptor Interactions. . . "，Science 244 :1081_1085，1989..Dockray, " Amino-terminal gastrin fragment in serum of Zollinger-Ellison Syndrome patients" , Gatroenterology 68 -.222-230,1975..Nemeth et al. " A Gastrin Aminoterminalis 1-13 Fragmensevel Kido-Kidolgozott, ..."，Izotoptechnika 25 =288-294,1982. ·ffendlberger,et al. " The synthesis of human big gastrin I and 32-leucine analog"，Chem. Abs. 92 :198749s，1980..Power, et al. " A novel gastrin-processing pathway in mammalian antrum"，Chem. Abs. 109 :67341z，1988..Dockray, et al. " Heptadecapeptide gastrin !measurement in blood by specificradioimmunoassay" , Gastroenterology 71:971-977,1976··
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權(quán)利要求
一種多肽免疫組合物，其包含一個(gè)模擬肽序列Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO.1，所述肽與免疫載體偶聯(lián)，其中大寫字母開頭的氨基酸是L-型異構(gòu)體，小寫字母開頭的氨基酸是D-異構(gòu)體氨基酸，pGlu是焦谷氨酸。
2.一種多肽免疫組合物，其包含選自以下組的模擬肽肽pGlu-Gly-Pro-Trp-β -am inoLeu(β Leu)-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. 2 ；免疫原模擬肽 pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :3 ；免疫原模擬肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu_Glu -Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :4 ；免疫原模擬肽Cys-pro-Pro_Pr o-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. 5 ；免疫原模擬肽Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala_pN02-Phe-G Iy-Trp-Met-Asp-Phe-Gly SEQ ID NO. 6 ；每種肽均偶聯(lián)一種免疫載體。
3.如權(quán)利要求1和2的多肽免疫組合物，其中所述的免疫載體選自由破傷風(fēng)類毒素 (TT)，白喉類毒素(DT)，百日咳類毒素(PT)以及純蛋白衍生物(Pure ProteinDerivative, PPD)組成的組。
4.如權(quán)利要求1或2的多肽免疫組合物，其中所述的免疫載體為破傷風(fēng)類毒素。
5.包含有效量的權(quán)利要求1、2或3的多肽免疫組合物以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物 組合物。
6.權(quán)利要求4所述的多肽免疫組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包含具水相和油 相的乳液，其中油相是含角鯊烯、角鯊?fù)椤⒕凵嚼娲减?0、去水山梨糖醇單油酸酯(Sorbitan monooleate)及吐溫40的油性賦形劑。
7.權(quán)利要求5所述的多肽免疫組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包含具水相和油 相的乳液，其中油相是含角鯊烯、角鯊?fù)?、聚山梨醇?0、去水山梨糖醇單油酸酯(Sorbitan monooleate)、吐溫40及單硬脂酸鋁的油性賦形劑。
8.權(quán)利要求5、6或7的多肽免疫組合物，其中藥學(xué)上可接受的載體包含具水相和油相 的乳液，其中油相是含角鯊烯、角鯊?fù)?、聚山梨醇?0、去水山梨糖醇單油酸酯(Sorbitan monooleate)、吐溫40的油性賦形劑，其中水相和油相均包含佐劑，所述佐劑包含但不限 于去甲亞甲基雙磷酸氫鈉(Nor-MDP)，爾吉咪唑(Ergamisol)，西咪替丁(Cimetidine)， 咪喹莫特(Imiquimod)，尿酸(uric acid)，環(huán)化雙鳥甘酸(cyclicdiguanylate)，蘇氨 酰(基)-N_乙酰胞壁酰-L-丙氨酰(基)-D-異谷氨酰胺(threonyl-N-acetyl-muram yl-L-alanyl-D-isoglutamine)，異丙月Λ Ρ (Isoprinosine)，甘露聚It (mannan)，海藻H (trehalose) dimycolate, QS—21 或 α-半乳糖神經(jīng)酷胺(alpha-galactosylceramide) (α -GalCer)或 α -葡糖苷(酯)酰鞘氨醇(alpha-glucosylceramide) ( α -GluCer)。
9.抗原模擬妝:Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Ser-Ser-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Arg-Arg -Ser-Ala-Glu-Asp-Glu-Asn SEQ ID NO. :1。
10.抗原模擬肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-β -aminoLeu ( β Leu) -GIu-GIu-GIu-GIu-GIu-Gl u-Ala-Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :2。
11.抗原模擬肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-Ile-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :3。
12.抗原模擬肽:pGlu-Gly-Pro-Trp-Val-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Ser-Ser-Pro-P ro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :4。
13.抗原模擬妝:Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gl y-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. :5。
14.抗原模擬肽Cys-pro-Pro-Pro-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu_Ala-pN02-Ph e-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly, SEQ ID NO. :6。
15.間隔子模擬肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-pro-Cys，SEQID NO :7。(其中大寫字母開 頭的氨基酸是L型異構(gòu)體，小寫字母開頭的氨基酸是D-異構(gòu)體)，pGlu是焦谷氨酸，自然存 在于huG17激素的N-末端。
16.間隔子多肽Ser-Ser-pro-pro-pro-pro-Cys,SEQ ID NO. :8。
17.間隔子模擬Jft:Thr-Thr-Pro-Pro-Pro-pro-Cys, SEQ ID NO. :9。
18.間隔子模擬肽Thr-Thr-pro-pro-pro-pro-Cys，SEQID NO. :10。
全文摘要
一種新型改良的抗人類延伸型胃泌素免疫組合物，其包含一個(gè)21個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO1)或其它相關(guān)多肽(SEQ ID NO2-5)，以及免疫載體和具有特定化療作用的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK101797382SQ201010116229
公開日2010年8月11日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者戚勝美, 王賓, 理查德·阿斯旺 申請人:戚勝美