專利名稱：抗原或藥物遞送復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型抗原遞送復(fù)合物、疫苗、藥物遞送復(fù)合物等。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，針對(duì)新發(fā)性和再發(fā)性感染性疾病，開(kāi)發(fā)了失活疫苗和低毒性疫苗，獲得了高的預(yù)防效果。但是，日本對(duì)感染病疫苗的開(kāi)發(fā)晚得多。為了撲滅發(fā)展中國(guó)家中的特定感染性疾病或者應(yīng)對(duì)大流行病，需要研發(fā)能夠大量生產(chǎn)和長(zhǎng)期保存，并且具有更高安全性和更強(qiáng)效價(jià)的疫苗。其中，DNA疫苗可以廉價(jià)地大量生產(chǎn)，其有效性受到期待，但從安全性或效價(jià)的觀點(diǎn)來(lái)看則尚未達(dá)到成功。此外，需要研發(fā)適用于激活全身免疫的靜脈注射、皮下/皮內(nèi)注射的制劑，適用于粘膜免疫的經(jīng)口、吸入或滴鼻給藥的制劑。
此外，針對(duì)人乳頭瘤病毒的疫苗作為宮頸癌疫苗已得到認(rèn)可，據(jù)報(bào)道表現(xiàn)出較高的效果。但是，針對(duì)癌癥抗原的疫苗療法在世界范圍內(nèi)尚未確立。雖然有使用多種多樣的抗原或DNA的疫苗的報(bào)道，但尚未獲得充分的免疫誘導(dǎo)效果，不能在臨床上應(yīng)用。特別地，DNA疫苗可選擇性活化與癌癥相關(guān)的細(xì)胞免疫，期待其可增強(qiáng)抗癌免疫。此外，雖然由于可廉價(jià)地大規(guī)模生產(chǎn)而令人注目，但從安全性和效價(jià)的觀點(diǎn)來(lái)看還沒(méi)有成功的例子。DNA藥物根據(jù)堿基的組合變化，表現(xiàn)出不同的藥理作用，可以廉價(jià)的大量生產(chǎn)，因此其作為有效的醫(yī)藥制品受人期待。迄今為止，已開(kāi)發(fā)了各種作為基因遞送載體的納米構(gòu)建體，報(bào)道了它們的器官特異性或細(xì)胞特異性。但是，由于安全性和效率低下，還不能在臨床上應(yīng)用。由于多數(shù)使用合成材料，尚未確定其安全性，而且醫(yī)療成本的負(fù)擔(dān)也大。需要開(kāi)發(fā)安全性高、具有普遍適用性的器官特異性載體。使載體具有器官趨向性有多種方法，一種方法是使用易于在目標(biāo)器官中積累的特定分子，還有使用其他抗體、適體等具有特異性結(jié)合能力的分子的方法。本發(fā)明人通過(guò)前者的方法，應(yīng)用藥物遞送復(fù)合物(專利文獻(xiàn)I)的技術(shù)，進(jìn)一步簡(jiǎn)單地加入生物可降解的脂類(lèi)，成功地構(gòu)建了對(duì)脾和肺具有選擇性的新型靶向化系統(tǒng)。具體地，只需向包合有DNA的陽(yáng)離子型核中加入磷脂酰絲氨酸(帶負(fù)電)，就可以提高納米顆粒的安全性，向小鼠靜脈注射后，實(shí)現(xiàn)僅在脾臟中的選擇性的基因表達(dá)。脾臟富含免疫細(xì)胞，借助向脾臟的選擇性基因表達(dá)，可以開(kāi)發(fā)DNA疫苗。進(jìn)一步地，通過(guò)添加N-月桂酰肌氨酸(帶負(fù)電)代替磷脂酰絲氨酸，同樣可以提高納米顆粒的安全性，向小鼠靜脈注射后，實(shí)現(xiàn)僅在肺中的選擇性基因表達(dá)(非專利文獻(xiàn)I)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :特開(kāi)2010-059064號(hào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Journal of Controlled Release, 136，213-219 (2009)發(fā)明概述發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題是提供安全、高效價(jià)，可以大量生產(chǎn)、保存的抗原遞送復(fù)合物、疫苗、藥物遞送復(fù)合物等。特別地，本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題是提供以具有對(duì)細(xì)胞或器官的趨向性為特征的抗原或藥物遞送復(fù)合物。解決技術(shù)問(wèn)題的手段本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將瘧疾抗原DNA與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物用Y-聚谷氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸中的任一種陰離子型分子包被而形成實(shí)質(zhì)上不帶電荷或者具有負(fù)的表面電荷的復(fù)合物，細(xì)胞毒性低，不會(huì)引起紅細(xì)胞凝集，在各種細(xì)胞中表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)一步通過(guò)在體內(nèi)全身給藥，能夠高效地將抗原DNA遞送至脾臟。此外發(fā)現(xiàn)，通過(guò)多次給藥可以產(chǎn)生對(duì)瘧疾特異性的抗體，由此可以抑制瘧疾感染。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在使用編碼作為癌抗原的惡性黑色素瘤表面抗原的PDNA的情況下，可以誘導(dǎo) 對(duì)惡性黑色素瘤特異性的細(xì)胞免疫，抑制惡性黑色素瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，本發(fā)明人將失活病毒或癌抗原與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物用Y-聚谷氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸中的任一種陰離子型分子包被，成功地制備了實(shí)質(zhì)上不帶電荷的、或者具有負(fù)的表面電荷的復(fù)合物。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，所獲得的疫苗能夠順利地被遞送到樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)，在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥時(shí)表現(xiàn)出高的免疫誘導(dǎo)效果。此外，本發(fā)明人應(yīng)用專利文獻(xiàn)I記載的技術(shù)，成功的構(gòu)建了使得細(xì)胞或器官特異性遞送成為可能的新型靶向化系統(tǒng)。具體地說(shuō)，成功的開(kāi)發(fā)了具有下述特征的抗原或藥物遞送復(fù)合物其含有抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物以及包合該復(fù)合物的陰離子型分子，并具有對(duì)細(xì)胞或器官的趨向性。此外，通過(guò)向抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物添加選自磷脂酰絲氨酸、N-月桂酰肌氨酸和甘草皂苷的陰離子型分子，成功的制備了被賦予對(duì)脾、肺或肝的選擇性(器官選擇性)的抗原或藥物遞送復(fù)合物。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，使用Y-聚谷氨酸作為陰離子型分子，可以制備出具有樹(shù)突狀細(xì)胞趨向性的復(fù)合物。這些復(fù)合物是抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物，以及陰離子型分子通過(guò)靜電結(jié)合而成的，因此已確定安全性極高，且沒(méi)有細(xì)胞毒性。此外，還通過(guò)向抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物添加選自適體、miRNA和抗體的陰離子型分子，成功地制備了被賦予更特異的細(xì)胞或器官選擇性的復(fù)合物。此外，在使用公知的成像用核素(成像探針)或診斷試劑作為抗原或藥物時(shí)，也成功地將上述復(fù)合物用作將成像用核素(成像探針)或診斷試劑遞送至特定細(xì)胞或器官的運(yùn)輸載體。換言之，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容。[I]抗原或藥物遞送復(fù)合物，其含有抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物、以及陰離子型分子，并且具有對(duì)細(xì)胞或器官的趨向性，所述陰離子型分子包合(內(nèi)包)所述抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物。[2] [I]記載的復(fù)合物，所述抗原或藥物是核酸、肽、蛋白質(zhì)或失活的病毒。[3] [I]或[2]記載的復(fù)合物，其特征是所述陰離子型分子選自磷脂酰絲氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷，具有對(duì)脾臟、肺或肝臟的趨向性。
[4] [3]記載的復(fù)合物，其特征是所述陰離子型分子是磷脂酰絲氨酸；抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子、磷脂酰絲氨酸的配比為1:2:4-1:8:8 ;且具有對(duì)脾臟的趨向性。[5] [3]記載的復(fù)合物，其特征是所述陰離子型分子是月桂酰肌氨酸；陽(yáng)離子型分子由陽(yáng)離子型高分子和陽(yáng)離子型脂類(lèi)組成；抗原或藥物與陽(yáng)離子型高分子、陽(yáng)離子型脂類(lèi)、月桂酰肌氨酸的配比為1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有對(duì)肺的趨向性。[6] [3]記載的復(fù)合物，其特征是所述陰離子型分子是甘草皂苷；抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子、甘草皂苷的配比為1:2:8-1:8:16;且具有對(duì)肝臟的趨向性。[7] [I]或[2]記載的復(fù)合物，其特征是所述陰離子型分子是Y-聚谷氨酸，具有對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞或脾臟的趨向性。[8] [7]記載的復(fù)合物，其特征是抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子、Y-聚谷氨酸的配比為1:2:8-1:8:16 ;且具有對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞或脾臟的趨向性。 [9] [I]或[2]記載的復(fù)合物，所述陰離子型分子選自適體、miRNA和抗體。[10] [9]記載的復(fù)合物，所述抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子、陰離子型分子的配比為1:2:8-1:8:16。[11] [1]-[10]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物，所述復(fù)合物由抗原或藥物；和選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚乙烯亞胺和陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物(dendrimer)的陽(yáng)離子型高分子；或選自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯銨的陽(yáng)離子型脂類(lèi)組成。[12] [1]-[10]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物，所述復(fù)合物由抗原或藥物；選自D0TMA、DOTAP和DC-Chol的陽(yáng)離子型脂類(lèi)；以及選自DOPE和膽固醇的脂類(lèi)組成的脂質(zhì)體或膠粒組成。[13]用于成像的、包含權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物的成像用核素的載體。[14] [13]記載的載體，其特征是抗原或藥物是由成像用核素、陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物(dendrimer)和螯合劑組成的復(fù)合物；陽(yáng)離子型分子是聚乙烯亞胺；陰離子型分子是
Y-聚谷氨酸；且具有對(duì)淋巴結(jié)的趨向性。[15]前哨淋巴結(jié)的成像方法，其特征是使用由藥物復(fù)合物、聚乙烯亞胺和Y-聚谷氨酸組成的復(fù)合物，其中所述藥物復(fù)合物由成像用核素、陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物(dendrimer)和螯合劑組成。[I’ ]抗原遞送復(fù)合物，包含抗原與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物，和將其包合在內(nèi)的陰離子型分子，是實(shí)質(zhì)上不帶電荷或具有表面負(fù)電荷的抗原遞送復(fù)合物，所述陰離子型分子選自Y-聚谷氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸及其鹽。[2’ ] [Γ ]記載的復(fù)合物，所述抗原是病原體抗原或編碼其的DNA。[3’ ] [2’ ]記載的復(fù)合物，所述病原體是瘧原蟲(chóng)。[4’ ] [Γ ]記載的復(fù)合物，所述抗原是失活的病毒。[5’] [4’]記載的復(fù)合物，病毒是流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、人乳頭瘤病毒或HIV病毒。[6’] [Γ]記載的復(fù)合物，陽(yáng)離子型分子的帶正電荷的官能團(tuán)與陰離子型分子的帶負(fù)電荷的官能團(tuán)的摩爾比是3: f 1:4。[7’ ][1’ ]記載的復(fù)合物，陰離子型分子的分子量為10萬(wàn)以下。
[8’ ] [Γ ]記載的復(fù)合物，陰離子型分子是Y-聚谷氨酸或其鹽。[9’ ][1’ ]記載的復(fù)合物，陽(yáng)離子型分子是聚乙烯亞胺、苯扎氯銨、Ν-[1_(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N, N-三甲基銨或其鹽。[10’ ] [8’ ]記載的復(fù)合物，使抗原遞送至脾臟。[11’ ]感染性疾病的疫苗，其包含[Γ ]_[10’ ]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物。
[12’ ] [11’ ]記載的疫苗，所述感染性疾病是瘧疾感染或病毒感染性疾病。[13’ ]向樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)遞送抗原的方法，其特征是使[Γ ]_[10’ ]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物或[11’ ]或[12’ ]記載的疫苗與樹(shù)突狀細(xì)胞接觸。[14’]向動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)遞送抗原的方法，其特征是向哺乳動(dòng)物細(xì)胞給藥[1’]-[10’]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物或[11’ ]或[12’ ]記載的疫苗。[15’]藥物遞送復(fù)合物，包含含有藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物的脂質(zhì)體，和將其包合在內(nèi)的陰離子型分子，是實(shí)質(zhì)上不帶電荷或具有表面負(fù)電荷的藥物遞送復(fù)合物，所述陰離子型分子選自月桂酰肌氨酸和磷脂酰絲氨酸。[16’ ] [15’ ]記載的復(fù)合物，使藥物遞送至脾臟。[17’ ] [15’ ]記載的復(fù)合物，使藥物遞送至肺。[18’ ] [15’ ]記載的復(fù)合物，所述脂質(zhì)體由藥物、陽(yáng)離子型分子和陽(yáng)離子型脂類(lèi)組成。[19’ ][18’ ]記載的復(fù)合物，所述陽(yáng)離子型分子是聚乙烯亞胺，陽(yáng)離子型脂類(lèi)是N-[I-(2，3- 二油酰氧基)丙基]-N, N, N-三甲基銨。[20’ ] [Γ ]和[6’ ]_[10’ ]的任一項(xiàng)記載的復(fù)合物，所述抗原是癌抗原或編碼癌抗原的DNA。[21’ ]包含[20’ ]記載的復(fù)合物的癌疫苗。[22’ ] [21’ ]記載的疫苗，所述癌是惡性黑色素瘤。[23’]向樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)遞送抗原的方法，其特征是使[20’]記載的復(fù)合物或[21’]或[22’ ]記載的疫苗與樹(shù)突狀細(xì)胞接觸。[24’ ]向動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)遞送抗原的方法，其特征是向哺乳動(dòng)物細(xì)胞給藥[20’ ]記載的復(fù)合物或[21’ ]或[22’ ]記載的疫苗。[25’]藥物遞送復(fù)合物，其特征是包含藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物，和將其包合在內(nèi)的抗體、適體或其鹽的器官特異性藥物遞送復(fù)合物，所述抗體、適體或其鹽與藥物和陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物靜電結(jié)合。[26’ ]向細(xì)胞內(nèi)遞送藥物的方法，其特征是將[25’ ]記載的藥物遞送復(fù)合物遞送到特定細(xì)胞。[27’ ]向動(dòng)物的特定細(xì)胞內(nèi)遞送藥物的方法，其特征是向哺乳動(dòng)物給藥[25’ ]記載的藥物遞送復(fù)合物。[28’ ] [15’ ]或[25’ ]記載的藥物遞送復(fù)合物，所述藥物是DNA、siRNA、miRNA、反義DNA等帶負(fù)電荷的核酸。發(fā)明的效果本發(fā)明的復(fù)合物不引起紅細(xì)胞凝集，且細(xì)胞毒性低，細(xì)胞內(nèi)攝入的效率好，可以安全有效地遞送抗原或藥物。
特別地，本發(fā)明的復(fù)合物的特征是具有對(duì)目標(biāo)細(xì)胞、器官的高趨向性，可以作為新型藥物遞送系統(tǒng)的有效成分。
附圖簡(jiǎn)介[圖I]示出了實(shí)施例I中的疫苗抗體效價(jià)。[圖2]示出了實(shí)施例I中的瘧疾感染后的小鼠的存活率。[圖3]示出 了實(shí)施例2中的疫苗抗體效價(jià)。[圖4]示出了向細(xì)胞添加實(shí)施例3中的復(fù)合物后的熒光顯微鏡觀察圖像。[圖5]示出了實(shí)施例4中的腫瘤重量的變化。[圖6]示出了實(shí)施例4中的惡性黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移情況。[圖7]示出了實(shí)施例4中的肺轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)。[圖8]示出了實(shí)施例5中的粒子大小和表面電荷。[圖9]示出了實(shí)施例5中的基因表達(dá)(螢光素酶活性)。[

圖10]示出了實(shí)施例5中的小鼠的螢光素酶成像圖像。[圖11]示出了實(shí)施例5中的多變量樣條插值法和貢獻(xiàn)指數(shù)。[圖12]示出了實(shí)施例6中的基因表達(dá)(螢光素酶活性)。[圖13]示出了實(shí)施例7中的粒子大小和表面電荷。[圖14]示出了實(shí)施例7中的基因表達(dá)(螢光素酶活性)。[圖15]示出了實(shí)施例7中的粒子大小和表面電荷。[圖16]示出了實(shí)施例8中的基因表達(dá)(螢光素酶活性)。[圖17]示出了樹(shù)突狀細(xì)胞攝入實(shí)施例9中的失活病毒。[圖18]示出了實(shí)施例10中的基因表達(dá)(螢光素酶活性)。[圖19]示出了實(shí)施例11中的基因抑制效率。[圖20]示出了實(shí)施例12中的感染瘧疾后的小鼠的存活率。[圖21]A:實(shí)施例13中基于稀釋小鼠血清的抗體效價(jià)變化。B :稀釋倍數(shù)10_4的小鼠抗體效價(jià)。[圖22]示出了實(shí)施例14中的腫瘤增殖變化。[圖23]示出了實(shí)施例15中的細(xì)胞毒性。[圖24]示出了實(shí)施例15中向大鼠足墊給藥24小時(shí)后，復(fù)合物在生物體內(nèi)的分布。[圖25]示出了實(shí)施例15中向大鼠足墊給藥24小時(shí)后的SPECT/CT圖像。箭頭(實(shí)線)表示胭淋巴結(jié)；箭頭(虛線)表示腰部淋巴結(jié)。發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明提供用于將抗原遞送至期望的細(xì)胞或器官內(nèi)的抗原或藥物復(fù)合物(下文稱為“本發(fā)明的抗原遞送復(fù)合物”、“本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物”，或合稱為“本發(fā)明的復(fù)合物”)下面分別針對(duì)本發(fā)明的抗原遞送復(fù)合物和本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物進(jìn)行說(shuō)明。本發(fā)明的“抗原遞送復(fù)合物”的特征是包含抗原與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物及包合所述復(fù)合物的陽(yáng)離子型分子，并具有對(duì)細(xì)胞或器官內(nèi)的趨向性。本發(fā)明的抗原遞送復(fù)合物中的“抗原”可列舉例如病原體抗原(特別是病原體的表面抗原)或編碼它的DNA，或失活病毒。作為病原體抗原中作為對(duì)象的“病原體”，考慮如后文所述的本發(fā)明的抗原遞送復(fù)合物作為疫苗使用的情況，可列舉疫苗療法期望的各種病原體。具體而言，可列舉瘧原蟲(chóng)、流感病毒、肝炎病毒、西尼羅熱病毒、HIV病毒(人免疫缺陷病毒)、乳頭瘤病毒、SARS (嚴(yán)重急性呼吸綜合征)病毒等。此類(lèi)病原體抗原選自病原體的表面抗原(例如蛋白質(zhì)(抗原)、肽(抗原)等)及其編碼核酸(例如，DNA)抗原等。上述核酸抗原中的核酸的種類(lèi)可以根據(jù)使用目的恰當(dāng)?shù)剡x擇，沒(méi)有特殊的限制，可列舉質(zhì)粒DNA (pDNA)、cDNA、反義DNA、siRNA、miRNA、染色體DNA、PAC, BAC等，優(yōu)選質(zhì)粒DNA、cDNA、反義DNA。質(zhì)粒DNA等環(huán)狀DNA通過(guò)適宜地限制性內(nèi)切酶消化后，也可以作為線性DNA使用。
核酸的大小沒(méi)有特殊的限制，在質(zhì)粒DNA的情況下，是2_15kbp，優(yōu)選2_10kbp，更優(yōu)選4-10kbp。此外，l-5kbp的DNA也是優(yōu)選的。核酸可以是天然存在的，或者也可以是合成的，如果大小在約IOObp以下，可以通過(guò)磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常規(guī)使用的核酸自動(dòng)合成儀來(lái)合成。對(duì)于大小更大的核酸，可以用通常使用的方法適宜地制備。本發(fā)明中使用的核酸沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法純化。本說(shuō)明書(shū)中的抗原除上述病原體的表面抗原或其編碼核酸以外，還可以使用病原體(病毒)自身。在此情況下，從防止感染的觀點(diǎn)看，使用失活病毒。就失活病毒而言，只要是通過(guò)常規(guī)方法獲得的就可以使用，例如，可以使用通過(guò)福爾馬林處理、紫外線照射、β-丙內(nèi)酯等獲得的失活病毒。此類(lèi)抗原可列舉優(yōu)選核酸、肽、蛋白質(zhì)或失活病毒，作為實(shí)例，可列舉瘧疾抗原基因、失活流感病毒等。作為本發(fā)明的其他實(shí)施方式，抗原可列舉用癌抗原或其編碼DNA獲得的抗原遞送復(fù)合物。從使用癌抗原作為抗原的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選所述抗原被細(xì)胞特異性地遞送。也就是說(shuō)，通過(guò)特異性地將抗原遞送至樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，可以期待高的免疫誘導(dǎo)效果。上述抗原可以與下文所述的本發(fā)明的藥物共同形成本發(fā)明的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的抗原遞送復(fù)合物也可以是納入了藥物的抗原遞送復(fù)合物。另一方面，本發(fā)明的“藥物遞送復(fù)合物”的特征是包含藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物，以及包合所述復(fù)合物的陰離子型分子，并具有對(duì)細(xì)胞或器官的趨向性。本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物中的“藥物”可以是任何物質(zhì)，可列舉例如核酸、肽、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、肽脂、糖、低分子化合物、其他合成的或天然的化合物等。這些化合物還可以包含各種核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正電子放射性核素等)，也可以通過(guò)核素進(jìn)行放射性標(biāo)記?；蛘咭部梢杂酶鞣N化合物(例如，公知的熒光色素、酶等)標(biāo)記。此外，所述藥物可以只有一種，也可以是兩種以上。在以治療和/或預(yù)防疾病為目的通過(guò)本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物向細(xì)胞或器官內(nèi)遞送藥物的情況下，所述藥物是具有治療和/或預(yù)防所述疾病的活性的藥物，可列舉例如可作為抗高血壓劑、抗低血壓劑、抗精神病劑、鎮(zhèn)痛劑、抗抑郁劑、抗躁劑、抗不安劑、鎮(zhèn)靜劑、催眠劑、抗癲癇劑、阿片激動(dòng)劑、哮喘治療劑、麻醉劑、抗心律不齊劑、關(guān)節(jié)炎治療劑、解痙劑、ACE抑制劑、解充血藥、抗生素、抗心絞痛劑、利尿劑、抗帕金森氏病劑、支氣管擴(kuò)張劑、促分娩劑、抗利尿劑、抗高脂血癥劑、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、止吐劑、抗感染劑、抗新生物劑、抗真菌劑、抗病毒劑、抗糖尿病劑、抗過(guò)敏劑、解熱劑、抗腫瘤劑、抗痛風(fēng)劑、抗組胺劑、止癢劑、骨調(diào)節(jié)劑、心血管劑、降膽固醇劑、抗瘧劑、用于戒煙的藥劑、鎮(zhèn)咳劑、去痰劑、粘液溶解劑、鼻塞用藥劑、多巴胺能劑、消化道用藥劑、肌肉舒張劑、神經(jīng)肌肉阻斷劑、副交感神經(jīng)激動(dòng)劑、前列腺素、興奮劑、食欲抑制劑、甲狀腺藥或抗甲狀腺藥、激素、抗偏頭痛劑、抗肥胖齊U、抗炎劑等發(fā)揮作用的藥物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，能夠?qū)爰?xì)胞內(nèi)的藥物是核酸。核酸沒(méi)有特殊的限制，可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的雜合體等。此外，核酸可以使用
1-3條鏈，優(yōu)選I條鏈或2條鏈。核酸也可以是作為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷的其他類(lèi)型的核苷酸，或者是具有非核苷酸骨架的其他寡聚體(例如，市售的肽核酸(PM)等)，或者是含有特殊聯(lián)接的其他寡聚體(但是，所述寡聚體含有DNA或RNA中可見(jiàn)的堿基對(duì)，或者具有允許堿基附著的配置的核苷酸)等。進(jìn)一步，可以添加有公知的修飾，例如具有所屬領(lǐng)域中 已知的標(biāo)志物的、加帽的、甲基化的、I個(gè)以上的天然核苷酸被類(lèi)似物替換的、經(jīng)過(guò)了分子內(nèi)核苷酸修飾的，例如具有不帶電聯(lián)接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基膦酸酯、氨基甲酸酯等)的、具有帶電聯(lián)接或含硫聯(lián)接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的、具有例如蛋白質(zhì)(核酸酶、核酸酶抑制劑、毒素、抗體、信號(hào)肽等)或糖(例如單糖等)等側(cè)鏈基團(tuán)的、具有插層化合物(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的、含有螯合化合物(例如，金屬、具有放射性的金屬、硼、氧化性的金屬等)的、含有烷化劑的、具有經(jīng)修飾的聯(lián)接(例如，α異頭物型核酸等)的。例如，DNA的類(lèi)型可以根據(jù)使用目的恰當(dāng)?shù)剡x擇，沒(méi)有特殊的限制，可列舉例如質(zhì)粒DNA、cDNA、反義DNA、染色體DNA、PAC、BAC等，優(yōu)選是質(zhì)粒DNA、cDNA、反義DNA。質(zhì)粒DNA等環(huán)狀DNA也可以通過(guò)適宜地限制性內(nèi)切酶消化后，作為線性DNA使用。此外，RNA的類(lèi)型可以根據(jù)使用目的恰當(dāng)?shù)剡x擇，沒(méi)有特殊的限制，可列舉例如siRNA、miRNA、shRNA、反義RNA、信使RNA、單鏈RNA基因組、雙鏈RNA基因組、RNA復(fù)制子、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA、核糖體 RNA 等，優(yōu)選 siRNA、miRNA、shRNA、mRNA、反義 RNA、RNA 復(fù)制子。核酸的大小沒(méi)有特殊的限制，從染色體(人工染色體等)等大型核酸分子(例如大小約107kbp)至低分子核酸(例如大小約5bp)都可以導(dǎo)入，但考慮到向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸的效率，優(yōu)選15kbp以下。例如，質(zhì)粒DNA這樣的高分子核酸的大小可示例為2-15kbp，優(yōu)選
2-10kbp,更優(yōu)選4-10kbp。此外，siRNA這樣的較低分子的核酸的大小可列舉5_1000bp,優(yōu)選 10-500bp，更優(yōu)選 15-200bp。核酸可以是天然存在的或者合成的，如果大小在約IOObp以下，可以通過(guò)磷酸三乙酯法、磷酸二酯法等，使用常規(guī)使用的核酸自動(dòng)合成儀來(lái)合成。本發(fā)明中使用的核酸沒(méi)有特殊的限制，優(yōu)選是通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法純化了的。上述藥物也可以與本發(fā)明的抗原一起形成本發(fā)明的復(fù)合物。因此，本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物也可以是納入了抗原的藥物遞送復(fù)合物。在以細(xì)胞或器官的診斷或成像為目的通過(guò)本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物向細(xì)胞或器官內(nèi)遞送藥物的情況下，，所述藥物可以是接受了適合診斷裝置或成像裝置的修飾(例如，核素、通過(guò)核素標(biāo)記(放射標(biāo)記)的化合物、熒光色素、用熒光色素標(biāo)記的化合物等)的化合物(下文有時(shí)將其統(tǒng)一簡(jiǎn)寫(xiě)為“成像用核素”)。此類(lèi)藥物可列舉例如用于正電子體層掃描(PET)的放射性核素(nC、13N、150、18F等)或用所述核素標(biāo)記的化合物、用于單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層掃描(SPECT)的放射性核素(67GA、99nTC、mIn、123I等)或用所述核素標(biāo)記的化合物、用于MRI (核磁共振成像)的造影劑(Gd3+等)或用所述造影劑標(biāo)記的化合物、色素(異舒泛藍(lán)(4 y 7 寸> O—)、舒泛藍(lán)、亞甲基藍(lán)、吲哚氰綠、靛胭脂等)或用所述色素標(biāo)記的化合物、熒光色素或用所述熒光色素標(biāo)記的化合物(形成熒光絡(luò)合物的鑭系元素等)、以及其他作為分子探針或示蹤物使用的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用本身已知的方法制備這些化合物?；蛘哌@些成像用核素可以通過(guò)共價(jià)鍵或配位鍵與后述各種陽(yáng)離子型分子或陰離子型分子(優(yōu)選陽(yáng)離子型分子)結(jié)合。此類(lèi)結(jié)合方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。作為上述藥物封入本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物中的化合物沒(méi)有特殊的限制，可使用 本身公知的核素、色素、熒光色素、分子探針、診斷藥物等。換言之，本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物可以作為用于遞送上述成像用核素的載體使用。所述復(fù)合物基于本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物所具有的趨向性而去往特定的細(xì)胞或器官，因此通過(guò)使用本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物作為遞送成像用核素的載體，與只使用成像用核素的傳統(tǒng)診斷方法、成像方法相比，可以更正確地對(duì)目的部位進(jìn)行診斷、成像?；蛘?，本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物本身可作為用作診斷或成像試劑的藥物的分子探針使用。本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物不引起紅細(xì)胞凝集，細(xì)胞毒性低，且向細(xì)胞內(nèi)攝入的效率好，并具有對(duì)細(xì)胞、器官的趨向性，因此可以說(shuō)是可以安全且有效地使用的分子探針。當(dāng)本發(fā)明的藥物遞送復(fù)合物作為用于遞送成像用核素的載體使用的情況下，本發(fā)明的藥物優(yōu)選制備為陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物與螯合劑的復(fù)合物(下位簡(jiǎn)稱為藥物復(fù)合物)。對(duì)于陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物所具有的陽(yáng)離子基團(tuán)(例如氨基)，可以通過(guò)共價(jià)鍵導(dǎo)入色素、熒光色素分子等藥物，此外，對(duì)于螯合劑，也可以導(dǎo)入放射性核素、MRI造影劑、鑭系元素等藥物。使陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物與螯合劑結(jié)合的方法，或制備本發(fā)明的藥物與陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物和螯合劑的復(fù)合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，藥物復(fù)合物的制備方法可列舉混合陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物和螯合劑而形成陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物與螯合劑的復(fù)合物，并用成像用核素加以標(biāo)記的方法。通過(guò)適用作為此類(lèi)陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物和螯合劑的復(fù)合物而制備的藥物，本發(fā)明的載體也可能適用于多模態(tài)成像探針。在用于所述用途時(shí)，包含在藥物復(fù)合物中的陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物可列舉聚酰胺樹(shù)形化合物等。此外作為螯合劑，可列舉P-SCN芐基二乙烯三胺五乙酸(DTPA)等。用于本發(fā)明的復(fù)合物中的陰離子型分子是與上述抗原或后述藥物和陽(yáng)離子型分子一起形成的具有細(xì)胞或組織趨向性的復(fù)合物的、作為陰離子型的分子。陰離子型分子與后述的陽(yáng)離子型分子通過(guò)靜電相互作用締合，形成實(shí)質(zhì)上不帶電荷或帶負(fù)的表面電荷的本發(fā)明的復(fù)合物。優(yōu)選的陰離子型分子可列舉陰離子型高分子、陰離子型脂類(lèi)(例如月桂酰肌氨酸(下文有時(shí)縮寫(xiě)為L(zhǎng)S)、磷脂酰絲氨酸(下文有時(shí)縮寫(xiě)為DOPS)等)、整體上帶負(fù)電荷的基因(例如適體等)、整體上帶負(fù)電荷的抗體等。其中，例如月桂酰肌氨酸、Y-聚谷氨酸(下文有時(shí)縮寫(xiě)為Y-PGA)、甘草皂苷(下文有時(shí)縮寫(xiě)為GLY)、磷脂酰絲氨酸、硫酸軟骨素、海藻酸等是特別優(yōu)選的。這些陰離子型分子可以是包含各種核素(例如，天然放射性核素、人工放射性核素、正電子放射性核素等)的，也可以是用核素進(jìn)行放射性標(biāo)記的?；蛘撸部梢允怯酶鞣N化合物(例如，公知的熒光色素、酶等)標(biāo)記的。各種陰離子型分子可以呈現(xiàn)鹽的形態(tài)，所述鹽的形態(tài)可列舉鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、鋁鹽、鹽酸鹽等。在本發(fā)明的復(fù)合物中，陰離子型分子是賦予復(fù)合物的細(xì)胞或器官趨向性最重要的分子。 例如，在賦予脾、肺或肝趨向性的情況下，陰離子型分子優(yōu)選選自磷脂酰絲氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷。特別是在賦予脾趨向性的情況下，優(yōu)選選擇磷脂酰絲氨酸，在賦予肺趨向性的情況下，優(yōu)選選擇月桂酰肌氨酸，在賦予肝臟趨向性的情況下，優(yōu)選選擇甘草皂苷。對(duì)各器官中攝入本發(fā)明的復(fù)合物的細(xì)胞沒(méi)有特殊的限制，可以是形成各器官的任何細(xì)胞。例如，具有肝趨向性的本發(fā)明的復(fù)合物可以被肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞攝入。陰離子型脂類(lèi)也可以作為本發(fā)明的復(fù)合物中的脂質(zhì)體的組成成分使用。此類(lèi)陰離子型脂類(lèi)可列舉磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、LS等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，陰離子型分子可選自適體、miRNA和抗體。在本說(shuō)明書(shū)中，適體是指通過(guò)體外選擇方法(SELEX:基于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)性進(jìn)化)產(chǎn)生的高親和力、高特異性的基于RNA或DNA的配體。適體是從20-30個(gè)核苷酸的隨機(jī)配列生成的，基于與分子抗原或細(xì)胞的吸附選擇性地進(jìn)行篩選，并進(jìn)行濃縮以特異性地純化高親和力的結(jié)合配體。為了提高體內(nèi)的穩(wěn)定性和實(shí)用性，通?；瘜W(xué)修飾適體，以抑制核酸酶分解，或使其易于與試劑、標(biāo)志物或顆粒結(jié)合。此外，通過(guò)更簡(jiǎn)單的化學(xué)交聯(lián)方法，替換不具體參與與配體的相互作用的核酸。在溶液中，適體雖不形成結(jié)構(gòu)，但有可能折疊、包圍目標(biāo)表位，據(jù)此特異性地識(shí)別。表位周?chē)暮怂岬奶禺愓郫B產(chǎn)生氫鍵、靜電力、堆積、具有由形狀互補(bǔ)性介導(dǎo)的識(shí)別力的分子間接觸。與基于蛋白質(zhì)的配體相比，一般而言，適體是穩(wěn)定的，加熱滅菌的傳導(dǎo)性高，免疫原性低?，F(xiàn)在，適體已以包括血管形成、血小板活化、實(shí)體腫瘤在內(nèi)的多種具有臨床意義的病變?yōu)槟繕?biāo)使用，其用途正在增多。在適體作為成像和/或治療用乳液顆粒中的靶向配體使用的情況下，其臨床實(shí)用性有時(shí)依賴于相對(duì)于清除率的由核酸的磷酸基賦予的表面負(fù)電荷強(qiáng)度。使用基于脂類(lèi)的顆粒進(jìn)行的在先研究表示，負(fù)的4電位顯著降低脂質(zhì)體的血液半衰期，另一方面，中性或陽(yáng)離子型顆粒則都在全身維持更長(zhǎng)的時(shí)間。本發(fā)明的適體還可以采用鹽的形態(tài)，此類(lèi)適體的鹽可列舉鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、招鹽等。所述適體或其鹽可以使用市售的(例如，北海道SystemScience公司生產(chǎn)),也可以使用常用規(guī)程來(lái)恰當(dāng)?shù)刂苽?。在本發(fā)明的復(fù)合物中，作為陰離子型分子使用的抗體只要是表現(xiàn)為陰離子型分子(例如，抗體表面作為整體帶負(fù)電)的抗體即可，沒(méi)有特殊的限制。使用抗體作為陰離子型分子，可以利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)一步提高對(duì)細(xì)胞、器官的趨向性。此類(lèi)抗體可以使用市售的，也可以使用常用的規(guī)程，針對(duì)所選定的抗原來(lái)適宜地制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的復(fù)合物中的陰離子型分子選自Y-聚谷氨酸、硫酸軟骨素(下文縮寫(xiě)為CS)、海藻酸(下文縮寫(xiě)為AGA)及其鹽。所述實(shí)施方案中的陰離子型分子優(yōu)選是Y-PGA。本說(shuō)明書(shū)中，Y-PGA或其鹽可列舉下列通式(I)所表示的化合物。[化學(xué)式I]
權(quán)利要求
1.抗原或藥物遞送復(fù)合物，其含有抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物、以及陰離子型分子，并且具有對(duì)細(xì)胞或器官的趨向性，所述陰離子型分子包合所述抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物。
2.權(quán)利要求I所述的復(fù)合物，其中，所述抗原或藥物是核酸、肽、蛋白質(zhì)或失活的病毒。
3.權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子選自磷脂酰絲氨酸、月桂酰肌氨酸和甘草皂苷，并具有對(duì)脾、肺或肝的趨向性。
4.權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子是磷脂酰絲氨酸；抗原或藥物、陽(yáng)離子型分子、及磷脂酰絲氨酸的配比為1:2:4-1:8:8 ;且具有對(duì)脾臟的趨向性。
5.權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子是月桂酰肌氨酸；陽(yáng)離子型分子由陽(yáng)離子型高分子和陽(yáng)離子型脂類(lèi)組成；抗原或藥物、陽(yáng)離子型高分子、陽(yáng)離子型脂類(lèi)、及月桂酰肌氨酸的配比為1:2:2:1-1:2:2:4 ;且具有對(duì)肺的趨向性。
6.權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子是甘草皂苷；抗原或藥物、陽(yáng)離子型分子、及甘草皂苷的配比為1:2:8-1:8:16;且具有對(duì)肝的趨向性。
7.權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子是Y-聚谷氨酸，且具有對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞或脾的趨向性。
8.權(quán)利要求7所述的復(fù)合物，其中，抗原或藥物、陽(yáng)離子型分子、及Y-聚谷氨酸的配比為1:2:8-1:8:16 ;且具有對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞或脾的趨向性。
9.權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合物，其中，所述陰離子型分子選自適體、miRNA和抗體。
10.權(quán)利要求9所述的復(fù)合物，其中，所述抗原或藥物、陽(yáng)離子型分子、及陰離子型分子的配比為 1:2:8-1:8:16。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物由 抗原或藥物 '及 選自聚賴氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸、聚こ烯亞胺和陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物的陽(yáng)離子型高分子，或選自DOTMA、DOTAP、DC-Chol和苯扎氯銨的陽(yáng)離子型脂類(lèi)組成。
12.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物，其中，所述復(fù)合物由抗原或藥物；及脂質(zhì)體或膠束組成， 所述脂質(zhì)體或膠束由選自DOTMA、DOTAP和DC-Chol的陽(yáng)離子型脂類(lèi)與選自DOPE和膽固醇的脂類(lèi)制成。
13.成像用核素的載體，包含用于成像的權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的復(fù)合物。
14.權(quán)利要求14所述的載體，其中，抗原或藥物是由成像用核素、陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物和螯合劑組成的復(fù)合物；陽(yáng)離子型分子是聚こ烯亞胺；陰離子型分子是Y-聚谷氨酸；且具有對(duì)淋巴結(jié)的趨向性。
15.前哨淋巴結(jié)的成像方法，其特征是使用由藥物復(fù)合物、聚こ烯亞胺和Y-聚谷氨酸組成的復(fù)合物，其中所述藥物組合物由成像用核素、陽(yáng)離子型樹(shù)形化合物和螯合劑組成。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供抗原遞送復(fù)合物或藥物遞送復(fù)合物，其特征是安全性和效價(jià)高，可以大規(guī)模生產(chǎn)和保存，并具有細(xì)胞或器官趨向性。本發(fā)明提供了抗原或藥物遞送復(fù)合物，其特征是含有抗原或藥物與陽(yáng)離子型分子的復(fù)合物以及包合所述復(fù)合物的陰離子型分子，并具有細(xì)胞或器官趨向性。本發(fā)明的抗原或藥物遞送復(fù)合物可用作向特定細(xì)胞或器官遞送各種抗原或藥物的藥物遞送系統(tǒng)的主要組分。
文檔編號(hào)A61K39/002GK102858367SQ201180021210
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者佐佐木均, 黑崎友亮, 北原隆志, 藤秀人, 由井克之, 平山謙二, 森田公一, 向高弘, 間賀田泰寬, 小川美香子, 佐野纮平 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人長(zhǎng)崎大學(xué), 國(guó)立大學(xué)法人九州大學(xué), 國(guó)立大學(xué)法人浜松醫(yī)科大學(xué)