專利名稱：藥物復(fù)合物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于多糖衍生物和抗腫瘤藥等的醫(yī)藥化合物結(jié)合形成的藥物復(fù)合物的制造方法。
背景技術(shù)：
在肺癌和消化道癌等的固型癌以及白血病等的血液癌的治療時(shí)使用的抗腫瘤藥，通過靜脈注射或口服等的給藥途徑全身性地給藥之后，分布到特定的腫瘤部位，通過阻礙或者抑制癌細(xì)胞的增殖而發(fā)揮治療效果。但是，經(jīng)全身給藥的抗腫瘤藥，因?yàn)榭梢詮难醒杆俚乇桓闻K·內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)攝取，或者迅速地被從尿中排泄，有血中濃度低，向腫瘤部位的分布不充分的情況。并且，對(duì)于通常的抗腫瘤藥自身來說，存在有以下問題因其向腫瘤部位分布的選擇性(腫瘤選擇性)低，故抗腫瘤藥廣泛分布于全身的各種細(xì)胞和組織等，對(duì)于正常的細(xì)胞和組織等也產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，致使嘔吐、發(fā)熱、或者脫發(fā)等的副作用發(fā)生率極高。因此，抗腫瘤藥在追求其效果的同時(shí)亦要追求能夠選擇性地分布到腫瘤部位的手段的開發(fā)。
作為象這樣的手段之一，提出了使用具有羧基的多糖衍生物作為藥物載體，在該多糖衍生物上結(jié)合抗腫瘤藥，延遲抗腫瘤藥從血中消除的同時(shí)，提高向癌組織分布的靶向性的方法。例如，在國(guó)際專利W094/19376號(hào)中，公開了一種藥物復(fù)合物，它是在具有羧基的多糖的羧基上結(jié)合上肽鏈(氨基酸數(shù)目1～8)，然后進(jìn)一步通過這個(gè)肽鏈再結(jié)合阿霉素、道諾紅霉素、絲裂霉素C、或者博來霉素等形成藥物復(fù)合物。另外，在日本特開平7-84481號(hào)中公開了在被羧甲基化的甘露醇葡聚糖衍生物上，通過席夫堿或酰胺鍵導(dǎo)入了上述抗腫瘤藥的藥物復(fù)合物。這些藥物復(fù)合物與不結(jié)合藥物傳遞載體的抗腫瘤藥自身相比，具有優(yōu)異的抗腫瘤效果，同時(shí)毒性和副作用減輕。
另外，對(duì)于與使用多元醇化多糖衍生物作為藥物傳遞載體的藥物復(fù)合物有關(guān)的技術(shù)來說，有“關(guān)于多糖-肽-阿霉素復(fù)合物的研究·多糖衍生物的血中穩(wěn)定性和抗腫瘤效果的關(guān)系”(第10次日本DDS學(xué)會(huì)講演要旨集，279,1994)；“關(guān)于多糖-肽-阿霉素復(fù)合物的研究·體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和抗腫瘤效果”(第9次日本藥物動(dòng)態(tài)學(xué)會(huì)年會(huì)講演要旨集，292,1994)；第19次研究開發(fā)動(dòng)向研討會(huì)(醫(yī)藥品機(jī)構(gòu)舉辦)要旨集，D-9,1995；以及“關(guān)于通過多糖載體向腫瘤傳遞藥物的研究”(第12次膠體·界面技術(shù)討論會(huì)，日本化學(xué)會(huì)，講演要旨集，51,1995)等。
以前，這些的藥物復(fù)合物，可以將羧甲基プルラン、羧甲基葡聚糖等的含有羧基的多糖衍生物制成鈉鹽后，讓該多糖衍生物的羧基和抗腫瘤藥的氨基(或者與抗腫瘤藥結(jié)合著的肽鏈的N末端氨基)通過酰胺鍵結(jié)合來制造。因?yàn)槎嗵茄苌锏拟c鹽在有機(jī)溶劑中幾乎不溶解，要進(jìn)行此反應(yīng)，可采用將多糖衍生物的鈉鹽配制成水或含水的水性有機(jī)溶劑的溶液之后，在此溶液中使縮合劑和鹽酸鹽等形式的抗腫瘤藥(或者具有肽鏈的抗腫瘤藥)溶解的方法。
但是，因?yàn)樵诖朔磻?yīng)中，脫水縮合反應(yīng)在含有水的溶劑中進(jìn)行，產(chǎn)物要得到高收率是不可能的。作為反應(yīng)原料使用的抗腫瘤藥等一般是高價(jià)格的物品，從制造成本的觀點(diǎn)應(yīng)尋求能高效率地制造上述藥物復(fù)合物的方法。另外，在日本特開平6-87746號(hào)記載的，作為抗腫瘤藥有效的化合物，因?yàn)樵诜肿又杏袃?nèi)酯環(huán)存在，對(duì)此將以肽式鍵合著的化合物進(jìn)行上述的反應(yīng)時(shí)，在堿及水的存在下內(nèi)酯環(huán)開環(huán)，生成的羧基同與抗腫瘤藥結(jié)合著的肽鏈的N末端氨基反應(yīng)，使產(chǎn)物的收率顯著地降低，并且得不到均一的藥物復(fù)合物。為此，應(yīng)尋求能夠避免內(nèi)酯環(huán)開環(huán)的化合物生成的反應(yīng)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的課題是提供高效率的，將抗腫瘤藥及抗炎藥等的有效成分，制造成對(duì)于腫瘤部位等能夠具有靶向性的藥物復(fù)合物的方法。更具體地說，是讓具有羧基的多糖衍生物和抗腫瘤藥等的醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的低聚肽等的間隔基進(jìn)行高效率的反應(yīng)，提供能夠大量并且廉價(jià)的制造藥物復(fù)合物的方法。
本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述的課題，進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物或者結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基進(jìn)行反應(yīng)，使用有機(jī)胺的鹽代替以前使用的多糖衍生物的鈉鹽時(shí)，多糖衍生物的鹽可基本上在非水溶劑中高濃度地溶解，使多糖衍生物同醫(yī)藥化合物或者結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基的反應(yīng)能夠以很高的收率進(jìn)行，并且能夠使副產(chǎn)物等降低。本發(fā)明是基于以上的發(fā)現(xiàn)而完成的。
即本發(fā)明是提供具有以下特征的方法具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基結(jié)合起來的藥物復(fù)合物；或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基而直接結(jié)合起來的藥物復(fù)合物的制造方法，具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了間隔基的醫(yī)藥化合物在非水系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。并且在該藥物復(fù)合物的制造方法中包括以下的工序(1)將具有羧基的多糖衍生物的堿金屬鹽轉(zhuǎn)換成有機(jī)胺的鹽的工序；以及(2)該有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了間隔基的醫(yī)藥化合物在非水系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)的工序。
通過本發(fā)明的優(yōu)選方式，能夠提供具有羧基的多糖衍生物是羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的上述方法；構(gòu)成羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，在實(shí)質(zhì)上可能完全多元醇化的條件下，處理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇為特征的上述方法；羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇的上述方法；羧基C1-4烷基葡聚糖多元醇分子量是在5,000～500,000的范圍，優(yōu)選在50,000～450,000的范圍，更優(yōu)選200,000～400,000的范圍的羧甲基葡聚糖多元醇，羧甲基化度相當(dāng)于每個(gè)糖殘基為0.01～2.0的范圍，優(yōu)選0.1～1.0的范圍，更優(yōu)選0.3～0.5的范圍的上述方法；并且醫(yī)藥化合物為抗腫瘤藥或者抗炎藥的上述方法。
進(jìn)一步來說，通過本發(fā)明的優(yōu)選方式能夠提供醫(yī)藥化合物是能夠形成內(nèi)酯環(huán)的化合物的上述方法；在有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基的反應(yīng)中，使用形成了內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物或結(jié)合了形成內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物的間隔基的上述方法；以及能夠形成內(nèi)酯環(huán)的上述醫(yī)藥化合物是(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮的上述方法。
附圖的簡(jiǎn)單的說明

圖1是表示用本發(fā)明的方法制造出的例8的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖2是表示用本發(fā)明的方法制造出的例8的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖3是表示用本發(fā)明的方法制造出的例9的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖4是表示用本發(fā)明的方法制造出的例9的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖5是表示用本發(fā)明的方法制造出的例10的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖6是表示用本發(fā)明的方法制造出的例15的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖7是表示用本發(fā)明的方法制造出的例15的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖8是表示用本發(fā)明的方法制造出的例28的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖9是表示用本發(fā)明的方法制造出的例28的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖10是表示用本發(fā)明的方法制造出的例29的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖11是表示用本發(fā)明的方法制造出的例29的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖12是表示用本發(fā)明的方法制造出的例34的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖13是表示用本發(fā)明的方法制造出的例34的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖14是表示用本發(fā)明的方法制造出的例39的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖15是表示用本發(fā)明的方法制造出的例39的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖16是表示用本發(fā)明的方法制造出的例41的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖17是表示用本發(fā)明的方法制造出的例41的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖18是表示用本發(fā)明的方法制造出的例44的藥物復(fù)合物的GPC圖。
圖19是表示用本發(fā)明的方法制造出的例44的藥物復(fù)合物的紫外吸收光譜圖。
圖20是表示用本發(fā)明的方法制造出的例15的藥物復(fù)合物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的圖。圖中的各點(diǎn)表示3例的平均值。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案由本發(fā)明的制造方法制造出的藥物復(fù)合物，其特征如下具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基為媒介結(jié)合起來、或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基直接結(jié)合起來。
包含在藥物復(fù)合物中的醫(yī)藥化合物的殘基，來源于例如抗腫瘤藥、抗炎藥、抗菌素等的、被應(yīng)用在包括人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物疾病的治療以及/或者預(yù)防的醫(yī)藥化合物，由它們的部分結(jié)構(gòu)構(gòu)成。但作為該殘基來源的醫(yī)藥化合物并不限定在上述的范圍。并且，作為醫(yī)藥化合物來說，可以使用能夠與多糖衍生物或者間隔基結(jié)合有關(guān)的、具有1或2個(gè)以上的反應(yīng)性官能團(tuán)(例如氨基、羧基、羥基、巰基、酯基等)的任何的物質(zhì)。對(duì)于在說明書中所謂的醫(yī)藥化合物的范圍，包括它本身是有醫(yī)藥作用的化合物的主要結(jié)構(gòu)形成的由其部分構(gòu)造組成的化合物，也包括在生物體內(nèi)能夠再生該化合物的前體化合物。
更具體的說，在本說明書內(nèi)的所謂醫(yī)藥化合物的殘基，假定多糖衍生物或者間隔基同醫(yī)藥化合物殘基的結(jié)合是通過醫(yī)藥化合物中的反應(yīng)性官能團(tuán)同多糖衍生物或者間隔基中的反應(yīng)性官能團(tuán)之間的反應(yīng)(例如脫水縮合等)形成的時(shí)候，是指在結(jié)合后的化合物中存在的源自原先醫(yī)藥化合物的部分結(jié)構(gòu)。例如，醫(yī)藥化合物用D-NH2,D-COOH,D-COOR,D-OH,D-SH,D-CONH2,D-NH-COOR(R是低級(jí)烷基等)表示的時(shí)候，醫(yī)藥化合物的殘基分別可以用D-NH-(D-NH-CO-Q等)，D-CO-(D-CO-NH-Q,D-CO-O-Q,D-CO-S-Q等)，D-CO-(D-CO-NH-Q,D-CO-O-Q,D-CO-S-Q等)，D-O-(D-O-CO-Q,D-O-Q等)，D-S-(D-S-CO-Q,D-S-Q等)，D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q等)，D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q,D-NH-CO-NH-Q等)表示(括弧內(nèi)表示間隔基或多糖衍生物同醫(yī)藥化合物殘基的結(jié)合，Q表示從間隔基或多糖衍生物中分別除去反應(yīng)性官能團(tuán)以及羧基后剩余的部分結(jié)構(gòu))。間隔基或多糖衍生物同醫(yī)藥化合物殘基的結(jié)合的種類并不僅限于上述的物質(zhì)。醫(yī)藥化合物的殘基可以與多糖衍生物的羧基、間隔基的N末端氨基或者C末端羧基、或者存在于組成間隔基的氨基酸中的反應(yīng)性官能團(tuán)結(jié)合。
作為醫(yī)藥化合物的殘基來說，可適宜使用例如阿霉素、道諾紅霉素、絲裂霉素C、博來霉素、環(huán)胞苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、甲氨蝶呤、鉑類抗腫瘤藥(順鉑或其衍生物)、紫杉醇或其衍生物、喜樹堿或其衍生物(日本特開平6-87746號(hào)公開的抗腫瘤藥，優(yōu)選權(quán)利要求2記載的(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3＇,4′:6,7]吲哚嗪基[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮等)等的抗腫瘤藥的殘基。另外也可適宜例如琥珀酸氫化可的松、琥珀酸潑尼松等的甾體類抗炎藥；或者甲滅酸、氟滅酸、雙氯芬酸、布洛芬、氨芐噻吡酯等的非甾體抗炎藥的殘基。
醫(yī)藥化合物的殘基可以同多糖衍生物直接結(jié)合，也可以通過間隔基結(jié)合。作為象這樣的間隔基來說，可以使用含有1個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基。更具體地說，對(duì)于醫(yī)藥化合物的殘基同多糖衍生物通過間隔基結(jié)合起來的情況，該間隔基有著1個(gè)氨基酸的殘基(其意義是從氨基酸的氨基以及羧基分別除去1個(gè)氫原子以及1個(gè)羥基的殘基)、或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的低聚肽的殘基(其意義是從N末端的氨基以及C末端的羧基分別除去1個(gè)的氫原子以及1個(gè)羥基的殘基)的形式。
優(yōu)選的間隔基是含有2～6個(gè)氨基酸的低聚肽的殘基。構(gòu)成間隔基的氨基酸的種類沒有特別的限定，可使用例如L-或D-氨基酸、優(yōu)選L-氨基酸，除α-氨基酸之外，也可以使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、y-氨基酪酸等。象這個(gè)樣的α-氨基酸以外的氨基酸，在間隔基中優(yōu)選配置與多糖衍生物接近的位置。
例如使用低聚肽間隔基的時(shí)候的結(jié)合方向，沒有特別的限制，但一般地可以將間隔基的N末端通過酰胺鍵結(jié)合在羧基C1-4的烷基葡聚糖多元醇的羧基上，而將間隔基的C末端結(jié)合在醫(yī)藥化合物的氨基上。另外，例如肽間隔基的構(gòu)成單元中包括著賴氨酸殘基，將賴氨酸殘基的α-氨基以及ε-氨基各自同其他氨基酸的羧基經(jīng)酰胺鍵結(jié)合時(shí)，因?yàn)殡拈g隔基的兩端均變?yōu)镹末端，結(jié)合醫(yī)藥化合物的羧基即成為可能的事情。進(jìn)一步說，在間隔基中其構(gòu)成單元包括著1個(gè)或1個(gè)以上的二氨基化合物或二羧酸化合物的殘基(例如乙二氨基等的二氨基的殘基和琥珀酸等的二羧酸的殘基等)，也可使用兩末端為N末端的間隔基以及兩末端為C末端的間隔基。
使用由低聚肽組成的間隔基時(shí)的氨基酸序列沒有特定地限定，但可優(yōu)選使用例如，間隔基是用-X-Z-表示的二肽的殘基(X表示疏水性氨基酸的殘基，Z表示親水性氨基酸的殘基，-X-Z-的意義是疏水性氨基酸(X)和親水性氨基酸(Z)分別以N末端側(cè)以及C末端側(cè)，通過肽式鍵合起來的二肽的N末端的氨基以及C末端的羧基各自除去1個(gè)氫原子以及1個(gè)羥基的殘基)、或者將該二肽的殘基作為部分肽序列適當(dāng)?shù)赜糜陂g隔基。作為疏水性氨基酸來說，可使用例如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等；作為親水性氨基酸來說，可使用例如甘氨酸、丙氨酸等。間隔基也可以有象這個(gè)樣的二肽殘基的重復(fù)序列(例如-X-Z-X-Z-,-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
使用包括象這個(gè)樣的二肽結(jié)構(gòu)的間隔基時(shí)，間隔基在被認(rèn)為肽酶豐富的腫瘤部位及炎癥部分加水分解，因?yàn)樵谠摬课荒苁贯t(yī)藥化合物高濃度地游離，所以包含上述二肽的間隔基和醫(yī)藥化合物結(jié)合而形成的結(jié)構(gòu)，是通過本發(fā)明的方法制造出來的藥物復(fù)合物的優(yōu)選的部分結(jié)構(gòu)。作為醫(yī)藥化合物的殘基，對(duì)于使用與濃度有依賴關(guān)系的具有抗腫瘤作用的抗腫瘤藥(隨濃度增加抗腫瘤作用增強(qiáng)的抗腫瘤藥濃度依賴型的抗腫瘤藥，例如阿霉素等)的殘基時(shí)，特別優(yōu)選使用用-X-Z-表示的上述由二肽殘基組成的間隔基或者包括該二肽的殘基在作為部分肽排列的間隔基。
另外，作為醫(yī)藥化合物的殘基，對(duì)于使用在一定的濃度的，以作用時(shí)間的持續(xù)作為必須的時(shí)間依賴型的抗腫瘤藥時(shí)，通過使用上述的間隔基有時(shí)也能夠達(dá)到高的抗腫瘤效果，例如在日本特開平6-87746號(hào)記載的抗腫瘤藥，能夠舉出優(yōu)選權(quán)利要求2記載的抗腫瘤藥。在一般情況，并不限定在上述的間隔基，有必要從抗腫瘤藥的作用機(jī)制、體內(nèi)動(dòng)力學(xué)及顯示毒性的特點(diǎn)、抗腫瘤藥在體內(nèi)的游離性等方面選擇優(yōu)選的間隔基。另外在一般情況下，對(duì)于增殖迅速的癌癥來說，優(yōu)選能夠在短時(shí)間內(nèi)游離出高濃度的醫(yī)藥化合物的上述的間隔基。
在以下表示間隔基的具體例子，但被用于本發(fā)明的醫(yī)藥復(fù)合物的制造方法的間隔基并不僅限定在以下的化合物，象能夠給予醫(yī)藥化合物最佳游離速度這樣的問題，本專業(yè)的人員當(dāng)然可以適宜地選擇。表中，肽序列左邊是N末端、在C末端一側(cè)結(jié)合醫(yī)藥化合物的殘基。D-phe表示D-苯丙氨酸殘基，其他的氨基酸表示L-氨基酸。另外游離速度的大小是通過結(jié)合了阿霉素的藥物復(fù)合物對(duì)感染W(wǎng)alker256癌大鼠的藥效的體現(xiàn)的程度、或者在感染W(wǎng)alker256癌大鼠的腫瘤部位的游離阿霉素的濃度來判定。這些的間隔基中，對(duì)于阿霉素來說，優(yōu)選使用(N末端)-Gly-Gly-Phe-Gly-等的在短時(shí)間內(nèi)能夠游離出高濃度的醫(yī)藥化合物的間隔基。
表1(a)游離速度大的間隔基-Leu-Gly--Tyr-Gly--Phe-Gly--Gly-Phe-Gly--Gly-Gly-Phe-Gly--Gly-Phe-Gly-Gly--Phe-Gly-Gly-Gly--Phe-Phe-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-(b)游離速度比較大的間隔基-Gly-Gly-Phe-Phe--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-(c)游離速度比較小的間隔基-Phe-Phe--Ala-Gly--Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-(d)游離速度小的間隔基-Gly--D-Phe-Gly--Gly-Phe--Ser-Gly--Gly-Gly--Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-
作為構(gòu)成藥物復(fù)合物的多糖衍生物部分的具有羧基的多糖衍生物來說，可以使用例如多糖類或者將其經(jīng)化學(xué)或生物學(xué)方面的修飾的在分子中具有羧基的任何化合物。例如，除了能夠使用透明質(zhì)酸、果膠、褐藻酸、軟骨素、肝素等的多糖類之外，還能夠使用プルラン、葡聚糖、甘露聚糖、殼聚糖、旋覆花素、果聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、マンノグルカン、脫乙酰殼聚糖等的、在多糖的部分或者全部的羥基上導(dǎo)入了具有羧基的官能團(tuán)的化合物等。例如，可以優(yōu)選使用將羥基進(jìn)行羧C1-4烷化后的化合物，及將多元酸的一個(gè)羧基與羥基經(jīng)酯鍵結(jié)合起來的化合物等。另外，也可以使用在將上述多糖類多元醇化之后，導(dǎo)入了具有羧基的官能團(tuán)的化合物。
在這樣的多糖衍生物中，優(yōu)選使用羧C1-4烷基葡聚糖多元醇。羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的多元醇化程度沒有特別的限定，但構(gòu)成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，優(yōu)選的是在實(shí)際上有可能完全地多元醇化的條件下處理葡聚糖得到的葡聚糖多元醇。
對(duì)于制造羧C1-4烷基葡聚糖多元醇來說，使用的葡聚糖的種類沒有特別地限定，可以包含任意比例的α-D-1,6-鍵。例如α-D-1,6-鍵的比例可以使用85％以上、90％以上、或者95％以上的葡聚糖等。葡聚糖的分子量沒有特別地限定，可使用例如從10,000左右到2,000,000左右的化合物，優(yōu)選50,000左右到800,000左右的化合物。作為構(gòu)成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的羧C1-4烷基的C1-4烷基來說，可使用直鏈或者支鏈的C1-4烷基，具體地說，有甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基等，其中可優(yōu)選使用甲基。
本發(fā)明的方法，在于制造上述的藥物復(fù)合物，其特征在于，具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物自身、或者具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽同結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基，在實(shí)質(zhì)上不含有水的有機(jī)溶劑中，即在非水體系下進(jìn)行反應(yīng)。以下作為本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案，對(duì)于使用羧C1-4烷基葡聚糖多元醇作為多糖衍生物的情況進(jìn)行具體地說明，但是本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施方案。
對(duì)于使用葡聚糖作為起始原料的時(shí)候，將遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的高碘酸鈉和硼氫化鈉依次與葡聚糖作用，能夠制造實(shí)質(zhì)上將葡聚糖完全地多元醇化的葡聚糖多元醇。然而葡聚糖的多元醇化的方法并不僅限定于上述的方法，研究人員可以采用可能利用的任何的方法。羧C1-4烷基化能夠通過例如將氯代醋酸、溴代醋酸、α-氯丙酸、α-甲基-α-氯丙酸、β-氯丙酸、α-甲基-β-氯丙酸、α-氯酪酸、β-氯酪酸、γ-氯酪酸等的鹵代C1-4烷基羧酸，優(yōu)選氯代醋酸與葡聚糖多元醇的羥基反應(yīng)，將羥基部分或者完全地羧C1-4烷基化。
例如，將葡聚糖多元醇溶解在與反應(yīng)無(wú)關(guān)的惰性溶劑中(例如水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等)，在堿(例如氫氧化鈉及氫氧化鉀等)的存在下，添加鹵代C1-4烷基羧酸或其鹽，在冰冷下至100℃左右的溫度范圍進(jìn)行數(shù)分鐘至數(shù)日的反應(yīng)。羧C1-4烷基的導(dǎo)入的程度，通過適宜地選擇例如羧C1-4烷基化的反應(yīng)溫度及作為試藥使用的鹵代C1-4烷基羧酸以及堿的量，能夠容易地得以調(diào)節(jié)，象這樣的手段對(duì)于研究人員是公知的。對(duì)于葡聚糖多元醇的羥基的羧C1-4烷基化的程度沒有特別的限定，但是例如相當(dāng)于構(gòu)成糖殘基的0.01～2.0的范圍，優(yōu)選是0.1～1.0、更優(yōu)選是0.3～0.5的范圍。羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的分子量，在用凝膠過濾法測(cè)定時(shí)，是從5,000～500,000左右，優(yōu)選50,000～450,000左右，更優(yōu)選200,000～400,000左右。
象這樣制造出的羧C1-4烷基葡聚糖多元醇，被調(diào)制成以鈉鹽或鉀鹽等的堿金屬鹽形式的水溶液存在。本發(fā)明的方法的特征是，對(duì)于象這樣的多糖衍生物的羧基來說，在與醫(yī)藥化合物或者同醫(yī)藥化合物的殘基結(jié)合后的間隔基結(jié)合時(shí)，用以有機(jī)胺的鹽的形式的多糖衍生物代替上述的堿金屬鹽的形式的多糖衍生物。象這種樣的以有機(jī)胺的鹽的形式的多糖衍生物，在不含水的有機(jī)溶劑中實(shí)際應(yīng)用時(shí)能夠以高濃度溶解，因?yàn)榉磻?yīng)可以在非水系統(tǒng)中進(jìn)行，所以反應(yīng)效率可以顯著地得到提高。
作為有機(jī)胺的鹽來說，例如除了能夠使用三乙基胺、三甲基胺、三乙醇胺等的脂肪族胺類的鹽之外，還能夠使用N-甲基吡咯烷、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二甲基氨基吡啶等的脂環(huán)式或者芳香族胺類的鹽、氯化四甲基銨、氯化四乙基銨等的季銨鹽等。由多糖衍生物的鈉鹽轉(zhuǎn)換成有機(jī)胺的鹽，可以使用離子交換樹脂來進(jìn)行。例如將羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽溶解于水，上到填充了Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)樹脂的柱中，用水洗脫后，添加三乙基胺等的有機(jī)胺，能夠經(jīng)冷凍干燥得到。另外，將羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽溶解于水，使其通過三乙基銨型的樹脂，也可以經(jīng)一步工藝進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
醫(yī)藥化合物自身同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的結(jié)合、或者結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的結(jié)合，通?？梢酝ㄟ^醫(yī)藥化合物具有的反應(yīng)性的氨基或間隔基的N末端氨基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基經(jīng)酰胺鍵結(jié)合。另外，醫(yī)藥化合物或者間隔基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基的結(jié)合并不限定于上述的方式，也可以用其它的化學(xué)鍵或利用1或1個(gè)以上的間隔基的鍵合。例如，可以通過間隔基C末端的羧基或者醫(yī)藥化合物的羧基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基形成酸酐，另外也可以使用亞乙基二氨基等的二氨基化合物作為間隔基，將各自的羧基與二氨基的各個(gè)氨基經(jīng)酰胺鍵結(jié)合。
通過醫(yī)藥化合物具有的反應(yīng)活性的氨基或間隔基的N末端氨基同羧甲基葡聚糖多元醇的羧基經(jīng)酰胺鍵結(jié)合的時(shí)候，能夠使用通常用于肽鏈的合成的脫水縮合劑，例如除象N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)那樣的N,N＇-二環(huán)烷基碳化二亞胺類、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDAPC)等的碳化二亞胺衍生物、象1-羥基苯并三唑(HOBT)那樣的苯并三唑衍生物之外，還有1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(EEDQ)等。并且也可以通過活性酯法及酰鹵化物法等進(jìn)行反應(yīng)。
反應(yīng)實(shí)際上是在不含有水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行，可以使用能夠溶解反應(yīng)物(羧甲基葡聚糖多元醇的有機(jī)胺鹽以及醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基)的任何溶劑。例如，優(yōu)選使用N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、環(huán)丁砜等。醫(yī)藥化合物或者結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基經(jīng)過反應(yīng)導(dǎo)入羧甲基葡聚糖多元醇的醫(yī)藥化合物殘基的量沒有特別的限定，但是應(yīng)該從醫(yī)藥化合物殘基的物理化學(xué)方面的性質(zhì)、藥物復(fù)合物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)、藥效、以及毒性等的方面適宜選擇。通常能夠選擇0.1～30重量％，優(yōu)選1～15重量％左右的范圍。被導(dǎo)入了羧甲基葡聚糖多元醇的醫(yī)藥化合物殘基的比例，可以通過例如吸光度分析等方法容易地測(cè)定。
作為本發(fā)明的制造方法的優(yōu)選實(shí)施方案，在日本特開平6-87746號(hào)的權(quán)利要求書第2項(xiàng)記載的抗腫瘤藥的醫(yī)藥化合物，其與低聚肽式鍵合后，再導(dǎo)入羧甲基葡聚糖多元醇的方法，可用以下的流程圖表示，但本發(fā)明的方法并不局限于在這個(gè)流程圖中被表示的方法。在下述流程圖中，醫(yī)藥化合物殘基的導(dǎo)入量，是例如1～15重量％，優(yōu)選4～8重量％左右。另外，在下述流程圖中，在例示中記載的多元醇的組成單元中只有導(dǎo)入了1個(gè)或2個(gè)的羧甲基的組成單元，藥物復(fù)合物的多糖衍生物部分沒有通過上述組成單元的反復(fù)組合來構(gòu)成之事，是應(yīng)該被理解的。


上述流程圖中的醫(yī)藥化合物，在酸性水性溶劑中(例如pH3左右)平衡偏向于形成內(nèi)酯環(huán)的化合物(閉環(huán)體)；另一方面，在堿性水性溶劑中(例如pH10左右)平衡偏向于形-成內(nèi)酯環(huán)開環(huán)的化合物(開環(huán)體)，這些是公知的常識(shí)，但是導(dǎo)入相應(yīng)于這樣的閉環(huán)體及開環(huán)體的殘基的藥物復(fù)合物，具有同等的抗腫瘤效果。然而，羧甲基葡聚糖多元醇在同結(jié)合了上述醫(yī)藥化合物的間隔基(例如低聚肽·間隔基)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，如果開環(huán)型的反應(yīng)種類存在于反應(yīng)系統(tǒng)，在來源于內(nèi)酯環(huán)的羧基同來源于間隔基的氨基之間進(jìn)行縮合反應(yīng)，不僅使反應(yīng)收率顯著地降低，而且有時(shí)得不到均一的目的藥物復(fù)合物。象這個(gè)樣的副反應(yīng)，在不能達(dá)到平衡的非水性系統(tǒng)中可以通過使用閉環(huán)體這種反應(yīng)種類得以避免。因此本發(fā)明的方法對(duì)包括上述的醫(yī)藥化合物的藥物復(fù)合物的制造特別地適合。
由本發(fā)明的方法制造出的上述藥物復(fù)合物，對(duì)應(yīng)于醫(yī)藥化合物的殘基種類(例如抗腫瘤藥或者抗炎藥等的醫(yī)藥化合物的殘基)，在腫瘤部位及炎癥部位等的局部能夠得到所希望的醫(yī)藥活性，并且還有能夠減低醫(yī)藥化合物自身所具有的毒性的特點(diǎn)。例如，是多糖衍生物部分的羧甲基葡聚糖多元醇作為藥物輸送的載體有著極其優(yōu)異的血中滯留性及向腫瘤·炎癥部位的積聚性，使上述的藥物復(fù)合物具有著腫瘤選擇性以及炎癥部位選擇性。另外，因?yàn)樵谀[瘤部位及炎癥部位被認(rèn)為發(fā)現(xiàn)了蛋白酶(肽酶)，具有由低聚肽組成的間隔基的藥物復(fù)合物在其肽鏈部分可容易地被加水分解，游離出的醫(yī)藥化合物發(fā)揮藥效。
包含通過本發(fā)明的方法制造出來的藥物復(fù)合物的藥物，通?？梢杂美鋬龈稍锲返鹊男问教畛淙氩Ａ康?，以使用時(shí)臨時(shí)溶解型的注射用或者點(diǎn)滴用制劑等的非口服給藥制劑應(yīng)用于臨床，但象這樣的藥物的制劑形式并不局限于上述的形式。對(duì)于上述制劑的制造，例如可以使用助溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑等在本行業(yè)可以使用的制劑用輔料，制造出醫(yī)藥組合物。上述藥物的劑量沒有特別的限定，但通常根據(jù)構(gòu)成醫(yī)藥化合物的殘基的醫(yī)藥化合物的給藥量，藥物復(fù)合物中被導(dǎo)入的藥物化合物的殘基量、患者的狀態(tài)及疾病的種類等來決定。例如，在日本特開平6-87746號(hào)權(quán)利要求2記載的抗腫瘤藥的殘基，在用約6重量％左右的比例導(dǎo)入的藥物復(fù)合物非口服給藥時(shí)，一般每天以體表面積每1m2約1～500mg左右，優(yōu)選約10～100mg的范圍一次給藥，優(yōu)選每周反復(fù)給藥3～4次。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不局限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例中，[A-NH-]表示在象日本特開平6-87746號(hào)權(quán)利要求2記載的醫(yī)藥化合物(在實(shí)施例中也叫做“DX-8951”)等的那樣的有內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物中，內(nèi)酯環(huán)是閉環(huán)的醫(yī)藥化合物用A-NH2表示的時(shí)候的醫(yī)藥化合物殘基，其中一例，是在上述的間隔基中用A-NH-表示的基團(tuán)(形成了內(nèi)酯環(huán)的化合物)。另外，A＇-NH-表示用A-NH-表示的醫(yī)藥化合物殘基中的內(nèi)酯環(huán)是以閉環(huán)型或開環(huán)型的任一種或者它們的混合型存在的物質(zhì)。
在實(shí)施例中，對(duì)于沒有特別說明的時(shí)候，羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化的取代度(相當(dāng)于每構(gòu)成糖殘基的羧甲基的取代度)，通過將羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽轉(zhuǎn)換成游離型后，溶解于0.1N氫氧化鈉水溶液，用0.1N鹽酸滴定求出。將羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽的水溶液上Bio-Rad AG50W-x2(H+型)柱，將洗脫液冷凍干燥后作為供試品使用。將此供試品溶解于定量過量的0.1N氫氧化鈉水溶液，以酚酞為指示劑，用0.1N鹽酸滴定。供試品的取樣量為s(mg)、0.1N氫氧化鈉水溶液的定量過量為a(ml)、0.1N鹽酸的滴定量為b(ml)，羧甲基取代度通過式13.4(a-b)/[s-5.8(a-b)]求出。另外藥物的導(dǎo)入量(重量％)，可利用藥物的特性吸收由分光光度法(362nm附近)求出。凝膠過濾法按下述的條件進(jìn)行(柱TSK gel G4000PWXL、洗脫液0.1MNaCl、流速0.8ml/min、柱溫40℃)。例1:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)

將Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(600mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(160mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷卻到4℃后，添加N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(280mg)。在此溶液中加入溶解了日本特開平6-87746號(hào)權(quán)利要求2記載的醫(yī)藥化合物的甲磺酸鹽(600mg在上述專利的實(shí)施例50記載的化合物)和三乙基胺(0.16ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光下在室溫邊攪拌16小時(shí)邊反應(yīng)。將此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液含0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(1.0g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-817(m,2H),7.91-801(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35).Mass(FAB)；m/e854(M+1)例2:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成將Boc-Gly-Gly-Gly-Phe(600mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(160mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷卻到4℃后，添加N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(280mg)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸鹽(600mg)和三乙基胺(0.16ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光下在室溫邊攪拌16小時(shí)邊反應(yīng)。將此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液含0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(700mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=7.8Hz),8.19(d,1H),8.05-8.07(m,2H),7.79(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=7.8Hz),6.93-7.03(m,4H),6.51(s,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.84(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).Mass(FAB)；m/e854(M+1)例3:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成將Boc-Gly-Gly-Gly-Gly(120mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(39mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)，冷卻到4℃后，添加N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(70mg)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸鹽(150mg)和三乙基胺(0.039ml)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液，遮光下在室溫邊攪拌16小時(shí)邊反應(yīng)。將此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.40(d,1H,J=8.3Hz),8.10-8.17(m,2H),7.91-8.01(m,1H),7.78(d,1H,J=10.75Hz),7.32(s,1H),6.94-6.96(m,1H),6.50(s,1H),5.57(t,1H,J=4.5Hz),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.77(dd,2H,J=5.85Hz,J=8.80Hz),3.70(d,2H,J=4.40Hz),3.65(d,2H,J=5.35Hz),3.56(d,2H,J=5.85Hz),3.15-3.25(m,2H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).Mass(FAB)；m/e764(M+1)例4:3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成

將3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，分別用甲醇(30ml)2次、乙醇(30ml)2次進(jìn)行共沸后，殘?jiān)靡颐严磧?，得到?biāo)題化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.59-8.61(m,1H),8.50(d,1H,J=8.3Hz),8.21-8.27(m,2H),7.91-8.01(br,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.32(s,1H),6.50-6.52(br,1H),5.57-5.59(m,1H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.80-3.82(m,3H),3.70-3.75(m,3H),3.15-3.25(m,2H),2.41(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.86-1.88(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例5羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成葡聚糖T2000(10g，法魯瑪西亞(フプルマミア)公司制造，平均分子量2,000,000)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,1000ml)，加入高碘酸鈉(33.0g)的水溶液(1000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(7.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(14g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰?。將反?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜(ミリポァ公司制造)，經(jīng)超濾法除去低分子組分。將高分子組分冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇。此葡聚糖多元醇在pH3.0處理1小時(shí)后，用バィオマックス-50膜除去低分子組分，然后用バィオマックス-100膜除去高分子組分，冷凍干燥，得到精制葡聚糖多元醇(2.0g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn))是220K。
此精制葡聚糖多元醇(1.8g)加入到在水(45ml)中溶解了氫氧化鈉(10.5g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(15g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)20小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-10膜經(jīng)超濾法除去低分子組分。高分子組分冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(1.8g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn))是330K，羧甲基化度是0.8。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(300mg)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(1.5×8.6cm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(0.5ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(380mg)。將羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(各300mg)進(jìn)行同上述同樣的柱處理，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(380mg,400mg)。例6羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽的合成在上述例5得到的葡聚糖多元醇的鈉鹽(0.15g)，加入到在水(4.5ml)中溶解了氫氧化鈉(1.05g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(1.5g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)18小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8，滴入到90ml的甲醇中之后，加入3M氯化鈉水溶液(0.15ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀用甲醇洗凈后，溶解在水(5ml)中，加入3M氯化鈉水溶液(0.15ml)。將此溶液用米利波阿過濾器(0.45μm)過濾，濾液滴入到35ml的乙醇中，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀用乙醇洗凈后，溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(0.18g)。此物質(zhì)相當(dāng)于每糖殘基的羧甲基化度(堿滴定法)是1.2。例7羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽的合成在上述例5得到的精制葡聚糖多元醇(0.2g)，加入到在水(6ml)中溶解了氫氧化鈉(0.84g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(1.2g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)18小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8，滴入到120ml的甲醇中之后，加入3M氯化鈉水溶液(0.2ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm，8分鐘)收集。此沉淀用甲醇洗凈后，溶解在水(5ml)中，加入3M氯化鈉水溶液(0.2ml)。將此水溶液用米利波阿過濾器(0.45μm)過濾，濾液滴入到35ml的乙醇中，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm，8分鐘)收集。此沉淀用乙醇洗凈后，溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(0.20g)。此物質(zhì)相當(dāng)于每糖殘基的羧甲基化度(堿滴定法)是0.4。例8羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(380mg，羧甲基化度是0.8)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30ml)。在此溶液中，順次加入3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(49mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.017ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(380mg)，在室溫邊攪拌一夜邊反應(yīng)。此反應(yīng)液用1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH10后，在25ml的乙醇中每5ml分別滴入。在這個(gè)混合物中加入3M氯化鈉水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。
此沉淀溶解在水中，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥。得到的粗品溶解于水(30ml)，用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，在37℃處理1小時(shí)。此處理液同上述同樣地進(jìn)行透析后，透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物289mg。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-株式會(huì)社制TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1M三醋酸緩沖液，pH9.0,0.25mg/ml)分別表示在圖1及圖2。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1M三醋酸緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.3％(W/W)。例9羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成由3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(50mg)用同例4同樣的方法經(jīng)脫Boc，得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸鹽，按同例8同樣的方法，導(dǎo)入在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(380mg)，合成出標(biāo)題化合物(300mg)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-株式會(huì)社制TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.19mg/ml)分別表示在圖3及圖4。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.3％(W/W)。例10羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成由3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(41mg)用同例4同樣的方法經(jīng)脫Boc化得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A的三氟醋酸鹽，按同例8同樣的方法，導(dǎo)入在例5得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(380mg)，合成出標(biāo)題化合物(190mg)。本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.34mg/ml)表示在圖5。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.3％(W/W)。例11本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用將小鼠纖維肉瘤Meth A細(xì)胞1×106個(gè)移植到BALB/c種的雄性小鼠(7周齡)的右鼠頸(蹊)部皮下，制成感染Meth A癌小鼠(1組7只)。在第7天將溶解于注射用蒸餾水的例9的藥物復(fù)合物經(jīng)Meth A癌小鼠的尾靜脈內(nèi)每4天給藥4次。在移植后第21天摘出腫瘤，測(cè)定重量，腫瘤增殖抑制率由下式算出腫瘤增殖抑制率(％)=[1-(受試品給藥組的平均腫瘤重量/對(duì)照組的平均腫瘤重量)]×100。其結(jié)果，在例9得到的本發(fā)明的藥物復(fù)合物沒有發(fā)現(xiàn)毒性(體重減輕)，與上述醫(yī)藥化合物自身(沒有間隔基以及多糖衍生物)進(jìn)行比較，抗腫瘤效果大幅度增強(qiáng)。多糖衍生物自身(例5)以及只導(dǎo)入了間隔基的醫(yī)藥化合物殘基(由例1的化合物按例4的方法脫BOC化得到的H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽)是無(wú)效的。
表2受試品化合物給藥量(mg/kg)抑制率(％)醫(yī)藥化合物自身 7.5×4 761.875×4 460.9375×436例9的化合物 1.41)× 4940.71)×4590.351)×4 411)醫(yī)藥化合物的換算量例12本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用按與例11同樣的方法作成感染Meth A癌小鼠(1組6只)，在第7天比較將例8以及例9的藥物復(fù)合物單次給藥時(shí)的抗腫瘤作用。其結(jié)果，抗腫瘤作用的強(qiáng)度為(多糖衍生物)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇＞(多糖衍生物)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇＞醫(yī)藥化合物自身。沒有導(dǎo)入間隔基的醫(yī)藥化合物殘基與例5的羧甲基葡聚糖多元醇的羧基直接結(jié)合的化合物(醫(yī)藥化合物殘基的導(dǎo)入量6.2重量％)是無(wú)效的。
表3受試品化合物給藥量(mg/kg)抑制率(％)醫(yī)藥化合物自身 60 7720 59例8的化合物101)8551)76例9的化合物51)982.51)871)醫(yī)藥化合物的換算量例13羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成葡聚糖T500(10g，法魯瑪西亞公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,1000ml)，加入高碘酸鈉(33g)的水溶液(1000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加入乙二醇(7.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(14g)溶解后，攪拌一夜。將反應(yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5得到溶液1。另外對(duì)于葡聚糖T500(10g，法魯瑪西亞公司制造，分子量500K)，進(jìn)行上述的連續(xù)操作，得到溶液2。進(jìn)一步對(duì)于葡聚糖T250(各10g，法魯瑪西亞公司制造，分子量250K)，進(jìn)行上述的連續(xù)操作，得到溶液3和溶液4。合并這些溶液1～4，用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法除去低分子組分。高分子組分冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇(25g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是163K。
此葡聚糖多元醇(11g)加入到在水(330ml)中溶解了氫氧化鈉(46.2g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(66g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)一夜。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH9后，用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(13g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是228K，羧甲基化度是0.4。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(600mg)溶解于水，上Bio-Rad AG5W-X2(200-400目，H+型)柱(直徑44mm，長(zhǎng)210mm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(0.93ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(690mg)。例14:3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成將在例1得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)分別進(jìn)行共沸2次之后，殘?jiān)靡掖枷磧?，得到?biāo)題化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.3Hz),8.40-8.48(m,2H),8.28(d,1H,J=8.3Hz),7.95-8.07(br,3H),7.81(d,1H,J=10.2Hz),7.30-7.37(m,2H),7.15-7.30(m,5H),6.50-6.55(br,1H),5.50-5.57(m,1H),5.41(d,2H,J=7.82Hz),5.25(s,2H),4.55-4.62(m,1H),3.55-3.92(m,6H),3.15-3.25(br,2H),2.98-3,03(m,1H),2.73-2.82(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.84-1.92(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例15羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(400mg)轉(zhuǎn)換成三乙基銨鹽(470mg)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(30ml)。在此溶液中，順次加入在例14得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(62mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.02ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(470mg)，遮光下在室溫邊攪拌一夜邊反應(yīng)。此反應(yīng)液每5ml在各10ml的乙醇中滴入。在此液中加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離收集。此沉淀溶解在0.5M氯化鈉水溶液中，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(600mg)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-株式會(huì)社制TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.1mg/ml)分別表示在圖6及圖7。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.8％(W/W)。例16:3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成將在例2得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(79mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)分別進(jìn)行共沸2次之后，殘?jiān)靡颐严磧簦玫綐?biāo)題化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.62-8.66(m,2H),8.23(d,1H,J=8.3Hz),8.18-8.20(m,1H),7.98-8.10(br,2H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.09(d,2H,J=7.3Hz),6.93-7.03(m,4H),6.50-6.60(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.44(s,2H),5.18(d,1H,J=18.5Hz),4.80(d,1H,J=18.5Hz),4.57-4.59(m,1H),3.57-3.71(m,6H),3.15-3.25(m,2H),3.00-3.02(m,1H),2.80-2.90(m,1H),2.50(s,3H),2.05-2 25(m,1H),1.86-2.00(m,2H),0.88(t,3H,J=7.35Hz).例17羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(1.0g)轉(zhuǎn)換成三乙基銨鹽(1.2g)，溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，順次加入在例16得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(158mg)的N,N-二甲基甲酰胺(15ml)溶液、三乙基胺(0.05ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.2g)，遮光下在室溫邊攪拌一夜邊反應(yīng)。此反應(yīng)液每5ml在各10ml的乙醇中滴入。在此液中加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離收集。此沉淀溶解在0.5M氯化鈉水溶液中，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.4g)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.2％(W/W)。例18:Boc-Gly-Phe-Leu-OH的合成在50％二噁烷水溶液(48ml)中加入H-Gly-Phe-Leu-OH(3.0g)，冰冷卻。在此溶液中加入含有1N氫氧化鈉水溶液(9.45ml)和(Boc)2O(2.27g)的二噁烷(24ml)溶液，攪拌一夜。在反應(yīng)液中加入1N鹽酸(9.45ml)，餾去溶劑。得到的殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=5∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(2.5g)。例19:Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl的合成將在例18得到的Boc-Gly-Phe-Leu-OH(2.4g)以及N-羥基琥珀酰亞胺(656mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(50ml)，在4℃冷卻后，添加N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.17g)，攪拌2小時(shí)。在此溶液中加入溶解了H-Gly-OBzl的甲苯磺酸鹽(1.9g)和三乙基胺(0.79ml)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液，在室溫邊攪拌16小時(shí)邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=50∶1)精制，得到標(biāo)題化合物(2.0g)。1H-NMR(DNSO-d6)δ:8.20-8.30(m,1H),8.12(d,1H,J=8.3Hz),7.83(d,1H,J=8.3Hz),7.32-7.37(m,5H),6.89-6.95(m,1H),5.12(s,1H),4.52-4.59(br,1H),4.34(dd,1H,J=7.3Hz,J=15.1Hz),3.93(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.84(dd,1H,J=5.5Hz,J=17.2Hz),3.54(dd,1H,J=5.9Hz,J=16.7Hz),3.42(dd,J=5.9Hz,J=16.7Hz)3.00(dd,1H,J=4.4Hz,13.7Hz),2.78(dd,1H,J=8.8Hz,J=13.2Hz),1.50-1.65 (m,1H).1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.36(s,9H),0.86(d.3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz)。例20:Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH的合成將在例19得到的Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl(1.7g)在醋酸乙酯(30ml)和甲醇(30ml)的混合溶劑中使其溶解后，加入5％Pd-C(1.5g)，進(jìn)行接觸還原。過濾反應(yīng)液，濾液減壓干燥成固體，得到標(biāo)題化合物(1.15g)。例21:3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的合成將在例20得到的Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH(200mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(58mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5ml)，在4℃冷卻后，添加N,N-二環(huán)己基碳化二亞胺(104mg)使其溶解。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲烷磺酸鹽(224mg)和三乙基胺(0.059ml)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液，在避光條件下室溫邊攪拌16小時(shí)邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液減壓干燥成固體，得到的殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(200mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(d,1H,J=7.8Hz),8.08-8.18(m,2H),7.75-7.85(m,2H),7.32(s,1H),7.10(d,2H,J=6.8Hz),7.08-7.13(m,3H),6.85-6.95(br,1H),6.40-6.65(br,1H),5.52-5.55(m,1H),5.46(d,1H,J=18.5Hz),5.37(d,1H,J=18.5Hz),5.24(s,2H),4.44-4.52(m,1H),4.15-4.25(m,1H),3.68-3.72(m,2H),3.40-3.52(m,2H),3.15-3.25(br,2H),2.85-2.95(m,1H),2.65-2.75(m,1H),2.40(s,3H),2.05-2.25(m,1H),1.80-1.91(m,2H),1.50-1.65(m,1H),1.45(t,2H,J=7.3Hz),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.86(d,3H,J=6.4Hz),0.82(d,3H,J=6.4Hz).例22:3＇-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成將在例21得到的3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(97mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次分別用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)各共沸2次后，殘?jiān)靡颐严磧?，得到?biāo)題化合物(95mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.57(d,1H,J=83Hz),8.47(d,1H,J=8.3Hz),8.32(d,1H,J=7.8Hz),8.17(t,1H,J=5.5Hz),7.81-7.91(br,3H),7.79(d,1H,J=10.7Hz),7.32(s,1H),7.21-7.23(m,5H),7.12-7.17(m,1H),6.45-6.55(br,1H),5.57(q,1H,J=4.4Hz),5.43(d,1H,J=16.1Hz),5.34(d,1H,J=16.1Hz),5.23(s,2H),4.67(dt,1H,J=4.0Hz,J=9.0Hz),4.31(dd,1H,J=8.5Hz,J=15.0Hz),4.0-4.4(br,1H),3.74-3.76(m,2H),3.56(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.41(dd,1H,J=6.0Hz,J=16.0Hz),3.17-3.19(br,2H),3.02(dd,1H,J=4.0Hz,J=14.0Hz),2.70(dd,1H,J=10.0Hz,J=14.0Hz),2.40(s,3H),2.05-2.15(m,1H),1.85(dt,2H,J=7.0Hz,J=14.0Hz),1.50-1.55(m,1H),1.45(t,2H.J-6.0Hz),1,35(s,9H),0.88(t,3H,J=7.4),0.85(d,3H,J=6.4Hz),(0.80(d,3H,J=6.4Hz)例23羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例13得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(690mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(50ml)。在此溶液中，順次加入在例22中得到的3＇-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(95mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(0.03ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(690mg)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離收集。此沉淀溶解在0.5M氯化鈉水溶液中，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，對(duì)純水透析。透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，濾液冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(600mg)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是4.8％(W/W)。例24羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成葡聚糖T500(50g，法魯瑪西亞公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸鈉(165.0g)的水溶液(5000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入氫化硼鈉(70g)溶解后，攪拌一夜。將反應(yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法除去低分子組分。高分子組分冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇(27.1g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是140K。
此葡聚糖多元醇(5g)加入到在水(150ml)中溶解了氫氧化鈉(21g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(30g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)一夜。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(5.6g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是263K，羧甲基化度是0.4。
上述的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.0g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直徑44mm，長(zhǎng)210mm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(4ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(2.2g)。例25羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成將在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(1.0g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，Me3NH+型)柱，用水洗脫。冷凍干燥此洗脫液，得到標(biāo)題化合物(950mg)。例26:3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)鹽酸鹽的合成用與例14同樣的方法從3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(400mg)得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A三氟醋酸鹽溶解于水-MeOH(1∶4)中，上Bio-Rad AG1-X8(200-400目、C1-型)柱(1.5cm×8.6cm)，用上述溶劑洗脫。濃縮此洗脫液后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(310mg)。1H-NMR(DMS0-d6)δ:8.53(d,1H,J=8.5Hz),8.46-8.48(m,1H),8.37-8.39(m,1H),7.95(d,1H,J=8.0Hz),7.80(s,3H),7.78(d,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.14-7.24(m,5H),6.50(s,1H),5.56-5.60(m,1H),5.35-5.40(m,2H),5.24(s,2H),4.51-4.56(m,1H),3.86(dd,J=4.8,13.5Hz,1H),3.68-3.79(m,3H),3.54(s,2H),3.15-3.22(m,2H),3.01(dd,J=5.6,13.5Hz,1H),2.78(dd,J=9.6,3.5Hz,1H),2.41(s,3H),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.89(m,2H),0.88(t,3H,J=72Hz).Mass(FAB)；m/e753(M+1)例27羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基銨鹽(0.1g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(6ml)。在此溶液中，順次加入在例26中得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)NH-A(A-NH2=DX-8951)的鹽酸鹽(24mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(5μl)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(0.1g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解在0.5M氯化鈉水溶液中，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，得到的水溶液用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(90mg)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是11％(W/W)。例28羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例25得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基銨鹽(0.1g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(6ml)。在此溶液中，順次加入在例26中得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的鹽酸鹽(36mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液、三乙基胺(8μl)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(0.1g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解在0.5M氯化鈉水溶液中，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH12。得到的水溶液用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(80mg)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,36μg/ml)分別表示在圖8及圖9。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是15％(W/W)。例29羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成葡聚糖T250(20g,EXTRASYNTHESE制，平均分子量為250K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,2000ml)，加入高碘酸鈉(66.0g)的水溶液(2000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(28g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰埂⒎磻?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法除去低分子組分，得到?jīng)]有通過膜的殘留溶液1。另外，葡聚糖T250(50g,EXTRASYNTHESE制，平均分子量為250K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸鈉(165g)的水溶液(5000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(70g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰埂⒎磻?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法除去低分子組分，得到?jīng)]有通過膜的殘留溶液2。合并殘留溶液1和殘留溶液2，經(jīng)限外過濾法將通過バィオマックス-50膜的組分用バィオマックス-30膜除去低分子組分，冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇(25.7g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是47K。
此葡聚糖多元醇(5g)加入到在水(150ml)中溶解了氫氧化鈉(35g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(50g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)18小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(7.2g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是127K，羧甲基化度是0.8。這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.2g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直徑44mm，長(zhǎng)210mm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(4ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(2.69g)。
將這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(2.67g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(200ml)。在此溶液中，順次加入在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了由和例2同樣的方法合成出的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(350mg)，經(jīng)用和例16同樣的方法脫Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸鹽和三乙基胺(0.116ml)得到的溶液、在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(2.67g)得到的溶液，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。在此反應(yīng)液中加入3M氯化鈉水溶液(100ml)，每8ml滴入到各30ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀用丙酮洗凈后，溶解于水，加入3M氯化鈉水溶液(10ml)后，用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，在37℃處理1小時(shí)。此處理液用バィオマックス-10膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(2.30g)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.20mg/ml)分別表示在圖10及圖11。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.8％(W/W)。例30羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成在葡聚糖T10(20g，法魯瑪西亞公司制造，分子量10K)的0.1M醋酸緩沖液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸鈉(66.0g)的水溶液(2000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(28g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰?。將反?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-5膜(ミリポァ公司制造)經(jīng)限外過濾法除去低分子組分，沒有通過膜的殘留溶液再通過バィオマックス-30膜。得到的濾液冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇(8.0g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是13K。
此葡聚糖多元醇(3.7g)加入到在水(111ml)中溶解了氫氧化鈉(25.9g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(37g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)20小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-5膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(6.2g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是37K，羧甲基化的取代度是0.9。
將此羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(6.0g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(9.3ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(7.2g)。例31羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成在例30得到的葡聚糖多元醇(3.9g)加入到在水(117ml)中溶解了氫氧化鈉(16.3g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(23.4g)使其溶解后，在室溫反應(yīng)18小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-5膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(5.0g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是28K，羧甲基化度是0.5。這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(4.8g)與例30同樣的轉(zhuǎn)換成三乙基銨鹽，得到標(biāo)題化合物(5.6g)。例32羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成在葡聚糖4(20g,フナコシ公司制造，平均分子量4K-6K)的0.1M醋酸緩沖液(pH5.5)溶液(2000ml)中，加入高碘酸鈉(66.0g)的水溶液(2000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(28g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰埂⒎磻?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)后，在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-3膜(ミリポァ公司制造)經(jīng)限外過濾法除去低分子組分。得到的濾液冷凍干燥后，得到葡聚糖多元醇(6.0g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是9K。此葡聚糖多元醇(2.7g)加入到在水(81ml)中溶解了氫氧化鈉(18.9g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(27g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)20小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-5膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(4.2g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是20K，羧甲基化度是0.9。
此羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(4.0g)與例30同樣轉(zhuǎn)換成三乙基銨鹽，得到標(biāo)題化合物(4.8g)。例33羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成在例32得到的葡聚糖多元醇(2.7g)加入到在水(81ml)中溶解了氫氧化鈉(11.3g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(16.2g)使其溶解后，在室溫反應(yīng)18小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-5膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.7g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是16K，羧甲基化度是0.5。這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.7g)與例30同樣的轉(zhuǎn)換成三乙基銨鹽，得到標(biāo)題化合物(3.1g)。例34羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例30得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(1.5g)溶解于N,N-z二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，順次加入三乙基胺(0.07ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(210mg)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.5g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化鈉水溶液，在冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.3g)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,65μg/ml)分別表示在圖12及圖13。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是6.4％(W/W)。例35羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例31得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(1.2g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，順次加入三乙基胺(0.056ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(168mg)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.2g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化鈉水溶液，在冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.0g)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是4.8％(W/W)。例36羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例32得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(1.2g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，順次加入三乙基胺(0.056ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(168mg)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.2g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化鈉水溶液，在冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.0g)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1M三醋酸緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.9％(W/W)。例37羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例33得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(1.5g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(90ml)。在此溶液中，順次加入三乙基胺(0.07ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(210mg)的N,N-二甲基甲酰胺(40ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.5g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化鈉水溶液，在冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-3膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.3g)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是4.6％(W/W)。例38:Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A(A-NH2=DW-8286)的合成Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(42mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(12mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2ml)，在4℃冷卻后，加入N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(22mg)。在此溶液中加入溶解了用下述式

表示的化合物[(1s,9s)-1-氨基-5-氯-9-乙基-2,3-二氫-9-羥基-1H,12H-苯并[de]吡喃[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮DW-8286]的鹽酸鹽(50mg)和三乙基胺(0.01ml)的N,N-二甲基甲酰胺(6ml)溶液，遮光，在室溫邊攪拌16小時(shí)邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=10∶1溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(27mg)。1H-NMR(CDCl3)δ:8.10-8.20(br,1H),7.95-8.05(br,1H),7.70-7.80(br,2H),7.50-7.60(br,1H),7.40-7.50(br,1H),7.10-7.25(m,5H),7.05-7.15(br,1H),5.85-5.95(br,1H),5.50-5.60(br,1H),5.40-5.50(m,1H),5.25-5.35(m,1H),5.05-5.15(m,1H),4.90-5.00(m,1H),4.70-4.80(br,1H),4.10-4.25(br,2H),3.60-3.90(m,4H),3.10-3.40(m,3H),2.95-3.05(br,1H),2.15-2.30(br,1H),1.75-1.90(br,2H),1.39(s,9H),0.80-1.00(m,3H).例39羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DW-8286)的合成將在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(175mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)。在此溶液中，順次加入在N,N-二甲基甲酰胺(5ml)中溶解了由例38得到的3＇-N-Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8286)(27mg)經(jīng)用和例4同樣的方法脫Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸鹽(29mg)和三乙基胺(9μl)得到的溶液、及1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(175mg)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(20ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M氯化鈉水溶液，在冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-30膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(135mg)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,99μg/ml)分別表示在圖14及圖15。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是6.1％(W/W)。例40:3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8089)的合成Boc-Gly-Gly-Phe-Gly(163mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(45mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)，在4℃冷卻后，加入N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(79mg)。在此溶液中加入溶解了用下述式

表示的化合物[(1s,9s)-1-氨基-9-乙基-2,3-二氫-9-羥基-1H,12H-苯并[de]吡喃[3＇,4＇:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮DW-8089]的甲苯磺酸鹽(170mg)和三乙基胺(0.054ml)的N,N-二甲基甲酰胺(30ml)溶液，遮光，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液含有0.5％醋酸的二氯甲烷∶甲醇=94∶6溶液)精制，得到標(biāo)題化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.51(d,1H,J=8.5Hz),8.41(t,1H,J=5.6Hz),8.29(s,1H),8.17(d,1H,J=8.0Hz),8.03(d,1H,J=8.0Hz),7.90(dd,1H,J=4.8,5.6Hz),7.79(t,1H,J=5.6Hz),7.53(d,1H,J=7.2Hz),7.36(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.94-6.95(m,1H),5 60-5.63(m,1H),5.36-5.47(m,2H),5.21-5.30(m,2H),4.42-4.47(m,1H),3.63-3.96(m,3H),3.51-3.59(m,3H),3.31-3.40(m,1H),3.09-3.21(m,1H),3.02(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.76-2.81(m,1H),2.13-2.17(m,2H),1.85-1.90(m,2H),1.37(s,9H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 822(M+1)例41羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DW-8089)的合成將在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(1.6g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(60ml)。在此溶液中，順次加入在N,N-二甲基甲酰胺(20ml)中溶解了由例40得到的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8089)(200mg)經(jīng)用和例4同樣的方法脫Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A的三氟醋酸鹽和三乙基胺(0.07ml)得到的溶液、及1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(1.6g)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.5ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(2500rpm,8分鐘)收集。此沉淀用乙醇洗凈后，溶解于水，加入3M氯化鈉水溶液(20ml)，用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9。得到的水溶液用バィオマックス-10膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(1.20g)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK GelPW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.26mg/ml)分別表示在圖16及圖17。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.0％(W/W)。例42羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽的合成將葡聚糖T150(20g，法魯瑪西亞公司制造，分子量150K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,2000ml)，加入高碘酸鈉(66.0g)的水溶液(2000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(14.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。加入硼氫化鈉(28g)溶解后，在室溫?cái)嚢枰灰?。將反?yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)。在冰冷下用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-5膜(ミリポァ公司制造)經(jīng)限外過濾法一直濃縮到500ml，得到溶液1。另外對(duì)于葡聚糖T110(20g)進(jìn)行上述的一連串的操作，得到溶液2。混合溶液1和溶液2，混合溶液的pH調(diào)節(jié)至3.0，在40℃置于恒溫箱4小時(shí)后，調(diào)節(jié)pH至7，得到含有被低分子化的葡聚糖多元醇的溶液。使其通過バィオマックス-30膜，接著用バィオマックス-5膜脫鹽后，冷凍干燥，得到葡聚糖多元醇(4.6g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是17K。
此葡聚糖多元醇(2.5g)加入到在水(75ml)中溶解了氫氧化鈉(17.5g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(25g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)20小時(shí)。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH9后，用バィオマックス-5膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(4.0g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是45K,CM化度是0.9。
這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(3.7g)溶解于水，上Bio-RadAG50W-X2(200-400目，H+型)柱，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(5.8ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(4.4g)。例43羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例42得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(4.4g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(300ml)。在此溶液中，順次加入含有三乙基胺(0.19ml)和3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(580mg)的N,N-二甲基甲酰胺(45ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(4.4g)，遮光，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液用lM氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH10后，每5ml滴入到各25ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于水，用透析膜(スペクトラポァ1，透過分子量6,000-8,000)，向純水透析，透析內(nèi)液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(3.4g)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是4.6％(W/W)。例44:α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例42得到的葡聚糖多元醇(2g)，加入到在水(60ml)中溶解了氫氧化鈉(14g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液內(nèi)冰冷下加入α-溴代丙酸(19ml)并使其溶解后，在室溫下反應(yīng)18小時(shí)。此反應(yīng)液在冰冷下用醋酸調(diào)節(jié)至pH8，用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.95g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是45K。相當(dāng)于糖殘基的α-甲基羧甲基化度，以羧甲基葡聚糖多元醇為標(biāo)準(zhǔn)，由下述的方法求出。將α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽的水溶液上Bio-Rad AG50W-X2(H+型)柱，洗脫液冷凍干燥后用作供試品。此供試品溶解于定量過量0.1N氫氧化鈉水溶液，以酚酞為指示劑用0.1N鹽酸滴定。供試品的取樣量為s(mg)、0.1N氫氧化鈉水溶液的準(zhǔn)確加入量為a(ml)、0.1N鹽酸的滴定量為b(ml)，α-甲基羧甲基化度通過式13.4(a-b)/[s-7.2(a-b)]求出。其結(jié)果α-甲基羧甲基化度是0.8。
將此α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.2g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直徑44mm，長(zhǎng)210mm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(4ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(2.69g)。
將這個(gè)α-甲基羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(2.68g)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(60ml)。在此溶液中，順次加入在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了由和例2同樣的方法合成出的3＇-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(350mg)經(jīng)用和例16同樣的方法脫Boc化后得到的3＇-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A的三氟醋酸鹽和三乙基胺(0.116ml)得到的溶液、及在N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中溶解了1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(2.68g)得到的溶液，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。在此反應(yīng)液中加入3M氯化鈉水溶液(40ml)，每6ml滴入到各30ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(1ml)、乙醚(5ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀用丙酮洗凈后，溶解于水，加入3M氯化鈉水溶液(10ml)后，用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH9，在37℃處理1小時(shí)。此處理液用バィオマックス-10膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(2.15g)。本化合物溶解于0.1M氯化鈉水溶液，用GPC(柱東ソ-TSK Gel PW-4000XL，溶劑0.1MNaCl，流速0.8ml/min)分析出的結(jié)果、以及本化合物的紫外吸收光譜(0.1Mトリス緩沖液，pH9.0,0.21mg/ml)分別表示在圖18及圖19。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是5.9％(W/W)。例45:3＇-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DW-8951)三氟醋酸鹽的合成將Phe-Gly-OBzl的p-甲苯磺酸鹽(3.06g)、Boc-Gly-OH(1.10g)、N-羥基琥珀酰亞胺(941mg)、N-甲基嗎啉(0.725ml)、N,N-二甲基甲酰胺(40ml)的混合物在4℃冷卻后，加入N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.56g)。在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液減壓干固。殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到 Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.93g)。1H-NMR(DMSO d6)δ:8.52(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),7.97(d,1H,J=8.8Hz),7.30-7.39(m,5H),7.15-7.26(m,5H),6.83(t,1H,J=5.6Hz),5.14(s,1H),4.52-4.57(m,1H),3.87-3.96(m,2H),3.57(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.01(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.77(dd,1H,J=5.6,14.3Hz),1.37(s,9H).
得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl(1.78g)溶解于醋酸乙酯(60ml)，在5％-Pd-C(1.8g)存在下，接觸還原24小時(shí)。濾除催化劑，濾液減壓濃縮，得到Boc-Gly-Phe-Gly-OH(1.41g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.35(t,1H,J=5.6Hz),7.94(d,1H,J=8.8Hz),7.15-7.26(m,5H),6.85(dd,1H,J=5.6,6.4Hz),4.52-4.58(m,1H),3.76(d,2H,J=5.6Hz),3.56(dd,1H,J=6.4,16.7Hz),3.43(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.03(dd,1H,J=5.0,13.5Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),1.37(s,9H).在上面得到的Boc-Gly-Phe-Gly-OH(500mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(161mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸鹽(530mg)和三乙基胺(0.146ml)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液，在4℃冷卻后，加入N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(268mg)。遮光下在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=96∶4溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.39(d,1H,J=8.0Hz),8.34(t,1H,J=5.6Hz),7.98(d,1H,J=7.2Hz),7.78(d,1H,J=10.3Hz),7.33(s,1H),7.13-7.24(m,5H),6.80(dd,1H,J=5.6,6 4Hz),5.55-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=16.0Hz),5.41(d,1H,J=16.0Hz),5.25(s,2H),4.43-4.46(m,1H),3.69-3.79(m,2H),3.50(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.41(dd,1H,J=5.6,16.7Hz),3.16-3.19(m,2H),2.98(dd,1H,J=4.8,14.3Hz),2.79(dd,1H,J=9.5,14.3Hz),2.41(s,3H),2.19-2.25(m,1H),2.10-2.15(m,1H),1.82-1.90(m,2H),1.35(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e797(M+1)得到的3＇-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(100mg)溶解于三氟醋酸(3ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次分別用甲醇(30ml)、乙醇(30ml)各共沸2次后，殘?jiān)靡颐严磧?，得到?biāo)題化合物(80mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.52-8.62(m,1H),7.94(s,3H),7.79(t,1H,J=11.1Hz),7.34(s,1H),7.15-7.27(m,5H),6.52(s,1H),5.57-5.61(m,1H),5.36-5.46(m,2H),5.24(s,2H),4.66-4.70(m,1H),3.69-3.81(m,2H),3.61-3.68(m,1H),3.40-3.47(m,1H),3.15-3.23(m,1H),3.01(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.77(dd,1H,J=9.5,13.5Hz),2.12-2.23(m,2H),1.81-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=7.2Hz).Mass(FAB)；m/e697(M+1)例46:3＇-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成Boc-Phe-Gly(771mg)以及N-羥基琥珀酰亞胺(300mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中加入溶解了DX-8951的甲磺酸鹽(1058mg)和三乙基胺(0.293ml)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液，在4℃冷卻后，加入N,N＇-二環(huán)己基碳化二亞胺(494mg)。遮光下在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(1.20g)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.29(d,1H,J=8.0Hz),8.21(t,1H,J=4.8Hz),7.76(d,1H,J=10.3Hz),7.32(s,1H),7.13-7.25(m,5H),6.92(d,1H,J=7.2Hz),6.49(s,1H),5.56-5.61(m,1H),5.44(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.25(s,2H),4.08-4.12(m,1H),3.78(d,1H,J=4.8Hz),3.16-3.25(m,2H),2.99(dd,1H,J=4.0,13.5Hz),2.72(dd,1H,J=10.3,13.5Hz),2.40(s,3H),2.09-2.35(m,2H),1.80-1.91(m,2H),1.16(s,9H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e741(M+1)在上面得到的3＇-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A(170mg)溶解于三氟醋酸(4ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次分別用甲醇(10ml)、乙醇(10ml)各共沸2次后，殘?jiān)靡颐严磧?，得到?biāo)題化合物(100mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(t,1H,J=4.8Hz),8.68(d,1H,J=8.7Hz),8.05-8.15(m,3H),7.79(d,1H,J=11.1Hz),7.26-7.36(m,5H),6.52(d,1H,J=7.2Hz),5.57-5.62(m,1H),5.43(d,1H,J=15.9Hz),5.38(d,1H,J=15.9Hz),5.19-5.28(m,1H),4.10-4.18(m,1H),3.93(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.82(dd,1H,J=4.8,16.7Hz),3.17-3.24(m,2H),3.14(dd,1H,J=4.8,13.5Hz),2.95(dd,1H,J=8.0,13.5Hz),2.42(s,3H),2.14-2.25(m,2H),1.83-1.91(m,2H),0.89(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e640(M+1)例47:3＇-N-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)三氟醋酸鹽的合成DX-8951的甲烷磺酸鹽(530mg)和三乙基胺(0.28ml)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)，在4℃冷卻后，加入Boc-Gly的N-羥基琥珀酰亞胺酯(327mg)。遮光下在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液減壓干固，殘?jiān)霉枘z柱色譜(洗脫液二氯甲烷∶甲醇=98∶2溶液)精制，得到3＇-N-(Boc-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)(500mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.38(d,1H,J=8.3Hz),7.77(d,1H,J=10.7Hz),7.31(s,1H),6.89-6.91(m,1H),6.49(s,1H),5.55-5.59(m,1H),5.45(d,1H,J=16.1Hz),5.38(d,1H,J=16.1Hz),5.27(d,1H,J=19.0Hz),5.18(d,1H,J=19.0Hz),3.50-3.62(m,2H),3.15-3.19(m,2H),2.41(s,3H),2.18-2.24(m,1H),2.08-2.12(m,1H),1.81-1.91(m,2H),1.31(s,9H),0.87(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 593(M+1)在上面得到的3＇-N-(Boc-Gly)-NH-A(100mg)溶解于三氟醋酸(2ml)，放置1小時(shí)。除去溶劑，依次分別用甲醇(10ml)、乙醇(10ml)各共沸2次后，殘?jiān)靡颐严磧?，得到?biāo)題化合物(70mg)。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.88(d,1H,J=8.8Hz),8.08(s,3H),7.81(d,1H,J=11.2Hz),7.34(s,1H),6.52(s,1H),5.63-5.67(m,1H),5.45(d,1H,J=16.7Hz),5.40(d,1H,J=16.7Hz),5.36(d,1H,J=19.1Hz),5.25(d,1H,J=19.1Hz),3.56(s,2H),3.11-3.19(m,2H),2.43(s,3H),2.23-2.28(m,1H),2.11-2.19(m,1H),1.81-1.91(m,2H),0.88(t,3H,J=8.0Hz).Mass(FAB)；m/e 493(M+1)例48羧甲基葡聚糖多元醇的三甲基銨鹽的合成將葡聚糖T500(50g，法魯瑪西亞公司制造，分子量500K)溶解于0.1M醋酸緩沖液(pH5.5,5000ml)，加入高碘酸鈉(165.0g)的水溶液(5000ml)。邊遮光邊在4℃下攪拌10天后，加乙二醇(35.0ml)，攪拌一夜。反應(yīng)液用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7。加入氫化硼鈉(70g)溶解后，攪拌一夜。將反應(yīng)液冰冷卻，用醋酸調(diào)節(jié)至pH5.5，在4℃攪拌1小時(shí)。用8M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.5。得到的水溶液用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法進(jìn)行脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥，得到葡聚糖多元醇(20.2g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾法，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是159K。
此葡聚糖多元醇(7.5g)加入到在水(225ml)中溶解了氫氧化鈉(31.5g)后得到的水溶液中，在室溫使其溶解。在此溶液中冰冷下加入一氯醋酸(45g)，使其溶解后，在室溫反應(yīng)一夜。將此反應(yīng)液用醋酸調(diào)節(jié)至pH8后，用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液冷凍干燥后，得到羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(8.5g)。此物質(zhì)的分子量(凝膠過濾，プルラン標(biāo)準(zhǔn))是274K，羧甲基化度是0.4。這個(gè)羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.0g)溶解于水，上Bio-Rad AG50W-X2(200-400目，H+型)柱(直徑44mm，長(zhǎng)度210mm)，用水洗脫。在此洗脫液中加入三乙基胺(4ml)后，進(jìn)行冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(2.2g)。例49羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例48得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(200mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(7ml)。在此溶液中，順次加入在例45得到的3＇-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(41mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、三乙基胺(0.014ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(100mg)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M食鹽水溶液，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至9。得到的水溶液用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(190mg)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是4.5％(W/W)。例50羧甲基葡聚糖多元醇-Phe-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成在例24得到的羧甲基葡聚糖多元醇的鈉鹽(2.5g)溶解于水，上Bio-Rad AG 50W-X2(200-400目，Et3NH+型)柱，用水洗脫。此洗脫液進(jìn)行冷凍干燥，得到羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(2.5g)。
將此羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(200mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(12ml)。在此溶液中，順次加入在例46得到的3＇-N-(Phe-Gly)-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(42mg)和三乙基胺(0.016ml)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(200mg)，遮光，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。在此反應(yīng)液中加入水(300ml)，用超濾膜10K(フィルトロン公司制造)進(jìn)行超濾。沒有通過膜的殘留溶液用0.1N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10，使其通過過濾膜(0.16μm,フィルトロン公司制造)。通過后的溶液用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽，接著用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(180mg)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是6.1％(W/W)。例51羧甲基葡聚糖多元醇-Gly-NH-A＇(A-NH2=DX-8951)的合成將在例48得到的羧甲基葡聚糖多元醇的三乙基銨鹽(370mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)。在此溶液中，順次加入在例47得到的3＇-N-Gly-NH-A(A-NH2=DX-8951)的三氟醋酸鹽(57mg)的N,N-二甲基甲酰胺(3ml)溶液、三乙基胺(0.027ml)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羥基喹啉(185mg)，在室溫邊攪拌一夜邊進(jìn)行反應(yīng)。將此反應(yīng)液的每5ml滴入到各10ml的乙醇中。在此液中分別加入3M氯化鈉水溶液(2.0ml)、乙醚(25ml)，析出的沉淀經(jīng)離心分離(3500rpm,8分鐘)收集。此沉淀溶解于0.5M食鹽水溶液，冰冷下用0.1M氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至9。得到的水溶液用バィオマックス-50膜經(jīng)限外過濾法脫鹽。沒有通過膜的殘留溶液用米利波阿過濾器(0.22μm)過濾后，冷凍干燥，得到標(biāo)題化合物(290mg)。本化合物的醫(yī)藥化合物殘基的含量根據(jù)在0.1Mトリス緩沖液(pH9.0)中的362nm處的吸收度進(jìn)行定量時(shí)是0.5％(W/W)。例52本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用按與例11同樣的方法作成感染Meth A癌小鼠(1組6只)，對(duì)于例15的藥物復(fù)合物用與例12同樣的方法考察其單次給藥時(shí)的抗腫瘤作用。其結(jié)果，例15的藥物復(fù)合物與例12的醫(yī)藥化合物自身相比，顯示出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤作用效果和有效用量范圍的擴(kuò)大。受試品化合物給藥量(mg/kg)1)抑制率(％)例15的化合物 10 1005 992.5 951.25831)醫(yī)藥化合物的換算量例53本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用將人胃癌SC-6的腫瘤塊移植到裸鼠(BALB/c-nu/nu，雄性)的右鼠膝(徑)部皮下，制成感染SC-6癌裸鼠(1組5只)。在移植后第24天將溶解于注射用蒸餾水的例15的藥物復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi)單次給藥，與醫(yī)藥化合物自身比較抗腫瘤作用。其結(jié)果，例15的藥物復(fù)合物與醫(yī)藥化合物自身相比，沒有出現(xiàn)中毒死亡，發(fā)揮出了高效的抗腫瘤效果。受試品化合物 給藥量(mg/kg) 抑制率(%) 死亡小鼠數(shù)/使用小鼠數(shù)醫(yī)藥化合物自身 60 982/515 610/5例15的化合物 81)100 0/521)710/51)醫(yī)藥化合物的換算量例54本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用按與例53同樣的方法制成感染人肺癌QG-90癌裸鼠(1組5只)。在移植后第16天將溶解于注射用蒸餾水的例15的藥物復(fù)合物經(jīng)靜脈內(nèi)單次給藥，與醫(yī)藥化合物自身比較抗腫瘤作用。其結(jié)果，例15的藥物復(fù)合物與醫(yī)藥化合物自身相比，顯示出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤作用效果和有效用量范圍的擴(kuò)大。被測(cè)化合物給藥量(mg/kg) 抑制率(％)死亡小鼠數(shù)/使用小鼠數(shù)醫(yī)藥化合物自身 50 60 0/512.5 51 0/5例15的化合物 71)98 0/51.751)97 0/51)醫(yī)藥化合物的換算量例55本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用按與例11同樣的方法制成感染Meth A癌小鼠(1組6只)。用和例12同樣的方法，將例41的藥物復(fù)合物單次給藥時(shí)的抗腫瘤作用與醫(yī)藥化合物自身進(jìn)行比較。其結(jié)果，例41的藥物復(fù)合物與醫(yī)藥化合物自身相比，顯示出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤作用效果和有效用量范圍的擴(kuò)大。
被測(cè)化合物給藥量(mg/kg)抑制率(％)醫(yī)藥化合物自身 100 6450 5625 34例41的化合物 251)9912.51)956.251)813.1251)611)醫(yī)藥化合物的換算量例56本發(fā)明的藥物復(fù)合物的抗腫瘤作用按與例11同樣的方法制成感染Meth A癌小鼠(1組6只)。用和例12同樣的方法，考察例29、例43以及例44的各藥物復(fù)合物分別單次給藥時(shí)的抗腫瘤作用。
其結(jié)果，任一的藥物復(fù)合物均顯示出高效的抗腫瘤作用效果和寬廣的有效用量范圍。
被測(cè)化合物給藥量(mg/kg)1)抑制率(％)例29的化合物3099209910895 79例43的化合物100 94809240822075例44的化合物100 968094409720751)醫(yī)藥化合物的換算量例57本發(fā)明的藥物復(fù)合物的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)按與例11同樣的方法制成感染Meth A癌小鼠，對(duì)于例15的藥物復(fù)合物，用和例12同樣的方法單次給藥(10mg/Kg醫(yī)藥化合物換算量)，考察藥物復(fù)合物在各組織內(nèi)的濃度分布。其結(jié)果，例15的藥物復(fù)合物顯示出高的血中滯留性、對(duì)腫瘤組織的高度靶向性以及對(duì)于肝臟和小腸的高度選擇性。結(jié)果見圖20。
工業(yè)應(yīng)用可能性具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了間隔基的醫(yī)藥化合物之間的反應(yīng)能夠以高收率地進(jìn)行，而且在同具有內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物等進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)候，因?yàn)槟軌蛞种聘狈磻?yīng)，所以作為藥物復(fù)合物的制造方法是極其有用的。
權(quán)利要求
1．藥物復(fù)合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基結(jié)合起來的藥物復(fù)合物、或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基直接結(jié)合起來的藥物復(fù)合物的制造方法，其特征在于，具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基在非水系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。
2．藥物復(fù)合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基結(jié)合起來的藥物復(fù)合物、或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基直接結(jié)合起來的藥物復(fù)合物的制造方法，其包括以下工序(1)將具有羧基的多糖衍生物的堿金屬鹽轉(zhuǎn)換成有機(jī)胺的鹽的工序；以及(2)該有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基在非水系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)的工序。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的方法，其中具有羧基的多糖衍生物是羧C1-4烷基葡聚糖多元醇。
4．根據(jù)權(quán)利要求3記載的方法，其特征在于構(gòu)成羧C1-4烷基葡聚糖多元醇的葡聚糖多元醇，是在實(shí)質(zhì)上可能完全多元醇化的條件下，處理葡聚糖后得到的葡聚糖多元醇。
5．根據(jù)權(quán)利要求3或4記載的方法，其中羧C1-4烷基葡聚糖多元醇是羧甲基葡聚糖多元醇。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)記載的方法，其中醫(yī)藥化合物是抗腫瘤藥或者抗炎藥。
7．根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項(xiàng)記載的方法，其中醫(yī)藥化合物是能形成內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物。
8．根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)記載的方法，其中在有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基的反應(yīng)中，使用形成了內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物或結(jié)合了形成內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物的間隔基。
9．根據(jù)權(quán)利要求8記載的方法，其中能形成內(nèi)酯環(huán)的權(quán)利要求7記載的醫(yī)藥化合物是(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3′,4′:6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮。
10．具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽，用于具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基結(jié)合起來的藥物復(fù)合物、或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基直接結(jié)合起來的藥物復(fù)合物的制造中。
全文摘要
一種藥物復(fù)合物的制造方法，是具有羧基的多糖衍生物和醫(yī)藥化合物的殘基，通過含有一個(gè)氨基酸的間隔基或者肽式鍵合的含有2～8個(gè)氨基酸的間隔基結(jié)合起來的藥物復(fù)合物、或者具有羧基的多糖衍生物同醫(yī)藥化合物的殘基不通過導(dǎo)入該間隔基直接結(jié)合起來的藥物復(fù)合物的制造方法，其特征是，具有羧基的多糖衍生物的有機(jī)胺的鹽同醫(yī)藥化合物或結(jié)合了醫(yī)藥化合物的間隔基在非水系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。具有羧基的多糖衍生物同結(jié)合了間隔基的醫(yī)藥化合物等之間的反應(yīng)可以獲得較高的收率，而且在同具有內(nèi)酯環(huán)的醫(yī)藥化合物等進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)候，可以抑制副反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1227500SQ97197115
公開日1999年9月1日 申請(qǐng)日期1997年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月6日
發(fā)明者井上和泓, 洲崎浩, 池田政浩 申請(qǐng)人:第一制藥株式會(huì)社