專利名稱：長效藥物及含有該長效藥物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的能夠在體內(nèi)經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化作用由失活型成為生物活化型的長效前藥以及含有它們的藥物組合物，所述前藥具有對弱堿條件敏感的官能團，更優(yōu)選該前藥被芴基甲氧基羰基(Fmoc-)和芴甲基(Fm-)取代。
背景技術(shù)：
根據(jù)不同的標(biāo)準可將在人體和動物治療中都適用的常規(guī)治療性藥物分成不同類型。例如，可根據(jù)藥物的分子將其類分為蛋白質(zhì)-肽型(即由氨基酸結(jié)構(gòu)單元組成)或非肽型；或根據(jù)與結(jié)構(gòu)不相關(guān)的標(biāo)準來分類，例如按照藥物進入血循環(huán)內(nèi)的方式來分類，即口服吸收或其他方式的給藥(即注射、鼻內(nèi)或局部)。
通常，口服吸收的藥物具有低分子量、相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、親脂性(“油性”)以及非肽特性。事實上，所有肽類和蛋白質(zhì)藥物都不符合上述要求，并由此幾乎必需通過注射給藥，這應(yīng)歸因于它們的親水本質(zhì)(非親脂性)、極性特征以及代謝不穩(wěn)定性。此外，由于這些分子在體內(nèi)以不同的機制(尤其是蛋白水解作用)快速降解，因此它們通常為短效類型的藥物。
非肽型藥物通常極其疏水并可以能夠經(jīng)胃腸道途徑進入血循環(huán)中。鑒于它們相對的化學(xué)穩(wěn)定性，非肽型藥物常常為長效類型的藥物。
蛋白質(zhì)和肽類藥物已有大量并重要的臨床應(yīng)用，例如，胰島素在糖尿病治療中、促性腺激素釋放激素(GnRH)類似物在前列腺癌癥治療中、降鈣素在骨骼疾病治療中的應(yīng)用。雖然此類極其重要的分子的潛在性能是巨大的，但上述開發(fā)也僅僅是部分的。從廣義上講，這是由上述藥物較短的體內(nèi)存活期以及不方便的給藥方式造成的。非肽類藥物(例如抗生素)雖然相對長效，但若要維持所需的血藥濃度，它們也不得不在一天給藥數(shù)次并且持續(xù)一周或更長的時期。
口服吸收的藥物在治療人體疾病中極為需要，尤其是在長期治療中。結(jié)構(gòu)改進的藥物可使口服和局部的吸收、生物穩(wěn)定性及生物利用度得到提高。許多努力都是以上述效果為目的。多數(shù)的包括對藥物天然結(jié)構(gòu)(即生物活性結(jié)構(gòu))進行修飾在內(nèi)的方法還在被繼續(xù)采用。這種天然結(jié)構(gòu)能被藥物靶位特異性識別并且是藥物效能的必備特征。然而不幸的是，在眾多情況下，天然結(jié)構(gòu)還會被“清除機械體系”識別，這種體系能夠結(jié)合、降解或代謝藥物，從而加速了藥物的處理過程。因此，生物活性結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性應(yīng)該伴隨有較高的代謝穩(wěn)定性?？梢越档腿芙庑缘姆椒盎钚愿男詷I(yè)已用來達到上述目標(biāo)。
事實上，許多但不是所有市場上現(xiàn)存的肽類藥物及非肽類藥物都非常需要延長它們的半衰期或者被進一步開發(fā)，這些藥物包括抗生素、抗病毒藥、抗過敏藥、抗炎藥、鎮(zhèn)痛藥、抗膽固醇血藥、抗癌藥、抗糖尿病藥、生長刺激劑以及其他藥物。開發(fā)那些在某些濃度閾值以上即產(chǎn)生毒性的藥物的前藥尤其有益。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供新的前藥，其特征在于，所述前藥具有對弱堿條件的高度敏感性以及在體內(nèi)生理條件下經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用、由失活形式變?yōu)樯锘钚孕问降哪芰Α?br> 本發(fā)明的另一個目的是提供從具有游離氨基、羧基、羥基和/或巰基基團的藥物衍生得到的前藥，所述前藥基本上是無生物活性的，但在給藥后能夠自發(fā)并緩慢地在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為原始活性藥物的分子。
本發(fā)明的一個目的還在于提供具有較高代謝穩(wěn)定性以及增強的生物利用度的前藥。
本發(fā)明的還一個目的在于提供具有可供選擇的給藥可行性的前藥，例如，口服和經(jīng)皮給藥，以及其他能夠穿過生理屏障(例如血腦屏障)的給藥。
本發(fā)明的又一個目的是提供使特異性藥物靶向作用于體內(nèi)患病部位的前藥。
因此，本發(fā)明涉及新的衍生自一種藥物并被對堿敏感并在弱堿條件下(例如生理條件下)可脫除的官能團取代的前藥，所述藥物的分子上帶有一個或多個選自游離氨基、羧基、羥基和/或巰基的基團。
本發(fā)明所述緩釋藥物的新意在于它們衍生成為新的通常是更加疏水的藥物衍生物。在此方法中，優(yōu)選失去而不是保留藥物的天然構(gòu)象、生物功效及被降解體系識別藥物的標(biāo)記。這種方式的一個優(yōu)越性是實際中，改性的衍生物在體內(nèi)條件下可緩慢并自發(fā)地水解并恢復(fù)成為天然活性藥物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述前藥如下式所示X-Y其中，Y為藥物的組成部分，該部分至少帶有一個選自游離氨基、羧基、羥基和/或巰基的官能團，和X是選自式(ⅰ)-(ⅳ)的基團
其中，R1和R2相同或不同，它們分別為氫、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、鹵素、硝基、磺基(硫代)、氨基、銨、羧基、PO3H2或OPO3H2；R3和R4相同或不同并且分別為氫、烷基或芳基；同時，當(dāng)X基團與藥物Y的羧基或巰基連接時A為共價鍵，或當(dāng)X與藥物Y的氨基或羥基連接時A為OCO-。
在本發(fā)明中，Y為任何適用于人體和動物的藥物組成部分，該部分至少包含一個官能團并且所述官能團選自游離氨基、羧基、羥基和/或巰基；Y是例如但不僅僅是胰島素；生長激素，例如人生長激素、牛生長激素；抗生素，例如氨基苷類抗生素，具體如慶大霉素、新霉素、鏈霉素、β-內(nèi)酰胺；例如青霉素類類抗生素，具體如羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、氧哌嗪青霉素；頭孢菌素類抗生素，具體如頭孢克洛、和頭孢氨芐；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具體如碳霉素和紅霉素；多肽類抗生素，具體如桿菌肽、短桿菌肽和多粘菌素；合成抗菌素，例如甲氧芐啶、吡咯嘧啶酸和磺胺二甲嘧啶；鎮(zhèn)痛藥和抗炎藥，例如對乙酰氨基酚、阿斯匹林、異丁芬酸、消炎痛；抗變態(tài)反應(yīng)藥和平喘藥，例如氨來占司和色甘酸；抗高膽固醇藥，例如氯貝酸、氧煙酸和曲帕拉醇；β-腎上腺素能阻斷劑和抗高血壓藥，例如布拉洛爾、卡托普利、茚諾洛爾、普萘洛爾和4-氨基丁酸；抗腫瘤藥，例如柔紅霉素、阿扎胞苷、6-巰基嘌呤、干擾素、白介素-2、甲氨蝶呤、紫杉醇和長春花鹼；抗病毒藥，例如無環(huán)鳥苷、丙氧鳥苷、金剛烷胺、干擾素、AZT和利巴韋林等。本發(fā)明所述藥物還包括信息素。
R1、R2、R3和R4定義中的術(shù)語“烷基”、“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“芳基”、“烷芳基”和“芳烷基”是指含有1-8個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基基團(例如甲基、乙基、丙基、異丙基和丁基)以及含有6-10個碳原子的芳基(例如苯基和萘基)。術(shù)語“鹵素”包括溴、氟、氯和碘。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案之一中，官能團為基團(ⅰ)，其中R1、R2、R3和R4為氫并且A為OCO-，即是常見的9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)基團，該基團廣泛地應(yīng)用于肽類合成中氨基的臨時性可逆保護(參見L.A.Carpino,Acc.Chem.Res.(1987)20,401-407)。Fmoc基團特別適宜肽類的合成，這應(yīng)歸因于該基團的引入和脫除易于操作及其作為肽類合成和常規(guī)純化先決條件的選擇穩(wěn)定性。此外，相關(guān)的9-芴甲基(Fm)也適合羧基官能團(例如氨基酸)的可逆性保護。所得的9-芴甲基酯(Fm-酯)用弱堿處理并經(jīng)過β-消除方式生成母體的游離羧基，因此這種酯同樣適于可逆性地掩蔽藥物的羧基官能團。Fmoc-基團還適宜用來可逆性保護酪氨酸絲氨酸及蘇氨酸中的羥基。
鹵代的Fmoc基(ⅰ)中，其中R1和R2至少之一是位于2或7位的鹵素，優(yōu)選是氯和溴；2-氯-1-茚基甲氧基羰基(CLIMOC)(ⅱ)、1-苯并〔f〕茚基甲氧基羰基尿烷(BIMOC)(ⅲ)、尿烷砜基(ⅳ)以及A為共價鍵的相應(yīng)(ⅰ)-(ⅳ)基團皆與Fmoc和Fm類似，適用于取代藥物的游離氨基、羧基、羥基和巰基官能團，由此為上述基團堿性條件下(例如生理條件下)的脫除提供了更寬的敏感范圍。事實上，上述基團(ⅰ)-(ⅳ)屬于普通類型中不常見的化學(xué)基團系列，它們可以在中性或弱堿性pH及溫和條件下進行水解，因此可用于α-和ε-氨基的臨時性可逆保護，例如在肽類合成中，并且這些基團在弱堿條件下通過β-消除反應(yīng)從氨基官能團上脫除掉。
本發(fā)明的基團(ⅰ)-(ⅳ)中，優(yōu)選與氨基和/或羥基部分共價連接的Fmoc或與羧基和/巰基部分共價連接的Fm在體液的生理條件下，換言之在pH7.4和37℃下，可以水解(通過β-消除反應(yīng))出游離氨基、羥基、巰基或羧基官能團。
本發(fā)明所述前藥可以通過藥物分子與含有(ⅰ)-(ⅳ)基團的適當(dāng)反應(yīng)物之間的反應(yīng)制得。若干9-芴甲基(Fm)的衍生物較適用，例如9-芴甲基-N-羥基琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)，該物質(zhì)是一種極特異的氨基官能團反應(yīng)物；與氨基和羥基反應(yīng)并共價連接的9-芴基甲氧基羰基氯(Fmoc-Cl)；與巰基反應(yīng)并生成S-Fm-衍生物的9-氯代甲基芴(Fm-Cl)(Bodanszky&Bednarek,1982)；以及與羧基官能團反應(yīng)并酯化的9-芴基甲醇(Fm-OH)。
堿性條件下敏感并由不同于β-消除的途徑從氨基、羧基、羥基或巰基官能團脫除的基團也可以被采用，但是，它們通常需要繁瑣的操作，這不適合用來保護藥物。而一個已知的例外是三氟乙酰基(TFA)，該基團與Fmoc相當(dāng)類似并十分易于從氨基脫除，但它具有潛在的毒性，因此由TFA衍生的藥物不被推薦為藥用。另一方面，F(xiàn)moc-氨基酸(例如Fmoc-亮氨酸)在動物試驗?zāi)Ｐ椭酗@示出較低的毒性指數(shù)。
附圖簡述

圖1表示LysB29-N-(Fmoc)1-胰島素(實心方形)、PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素(空心方形)和GlyA1、PheB1、LysB29-N-(Fmoc)3-胰島素(所有三各氨基酸位都被取代，空心圓)在無細胞生物試驗(用胰島素受體酪氨酸激酶的濃縮制劑磷酸化〔聚(Glu4Tyr)〕)中的活化(pH7.4,37℃)時間過程。
圖2表示(Fmoc)2-胰島素(3mg/只大鼠，以2ml 10％DMSO為溶劑)和NPH-胰島素(3mg/只大鼠)的單劑量腹膜內(nèi)給藥對正常大鼠血液葡萄糖濃度的影響。
圖3表示(SulFmoc)2-胰島素和天然胰島素(都為3mg/只大鼠，以1ml水為溶劑)的單劑量腹膜內(nèi)給藥對正常大鼠血液葡萄糖濃度的影響。
圖4表示胰島素(空心方形)和GlyA1、PheB1、LysB29-N-(Fmoc)3-胰島素(實心方形)在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下的降解。
圖5表示單劑量給藥的GlyA1、PheB1、LysB29-N-(Fmoc)3-胰島素(實心圓)對鏈脲霉素(STZ)治療的糖尿病大鼠血液葡萄糖濃度的影響，以天然胰島素給藥為參照(空心方形)。
圖6表示PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素單劑量STZ治療的高血糖大鼠給藥后在將血液葡萄糖濃度方面引起的延遲作用。
圖7表示通過溫育下生成活化的β-普萘洛爾，N-Fmoc-普萘洛爾所表現(xiàn)出的腎上腺素能拮抗作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的前藥，該前藥可用于開拓更好的給藥途徑并由此提高藥物的穩(wěn)定性和生物活性。在本發(fā)明新方案中，優(yōu)選失去而不是保留藥物的天然結(jié)構(gòu)、生物性能及靶向識別能力，但一經(jīng)施用，這種改性的藥物將自發(fā)并緩慢地轉(zhuǎn)化并恢復(fù)為原始的活性藥物分子。
在本發(fā)明中，許多常用藥物可以被轉(zhuǎn)化為非活性前藥，這些前藥成為長效型藥物，由此避免了由機體內(nèi)受體介導(dǎo)的普通降解作用。本發(fā)明所述前藥是根據(jù)在體內(nèi)生理條件下以同源方式可以自發(fā)并再生為原始藥物的目的來設(shè)計的。可提供多種產(chǎn)生前藥的化學(xué)方法，以便根據(jù)需要得到快的或慢的再活化速率。此外，改進前藥的疏水指數(shù)并賦予前藥在血循環(huán)中自發(fā)再生的特征都可以將非口服吸收藥物轉(zhuǎn)化為可胃腸滲透的前藥。
本發(fā)明所述前藥包括適合人和動物使用的改性藥物以及改性的昆蟲信息素。
就本發(fā)明的一個方面而言，所述前藥為改性胰島素。目前，胰島素是治療糖尿病的優(yōu)勢藥物，所謂糖尿病是以血糖過多、類脂、碳水化合物及蛋白代謝改變以及心血管疾病并發(fā)風(fēng)險增高為特征的系列綜合征。臨床上可以將多數(shù)患者類分成胰島素依賴型糖尿病(IDDM,Ⅰ型)或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM,Ⅱ型)。在西方國家，約90％的糖尿患者為Ⅱ型糖尿病，余者中的多數(shù)為Ⅰ型糖尿病。美國約70％的Ⅱ型糖尿病患者十分肥胖，肥胖是產(chǎn)生胰島素耐受性的一個重要因素。在Ⅰ型糖尿病患者中出現(xiàn)胰腺β-細胞大量并選擇性的損失以及胰島素過低的狀態(tài)。相反，Ⅱ型糖尿病患者中沒有出現(xiàn)顯著的胰島β-細胞缺失，這些患者的平均血漿胰島素濃度在24小時內(nèi)基本正常甚至更高，這應(yīng)歸因于外周阻力的激素作用。然而，Ⅱ型糖尿病個體的胰島素相對缺失。這應(yīng)歸因于正常胰島β-細胞能夠分泌一定量的胰島素，但在對抗高血糖時這種分泌會比正常時的更高，由此使個體在適當(dāng)?shù)囊葝u素耐受性時保持正常的血糖。
事實上，所有類型的糖尿病皆應(yīng)歸咎于循環(huán)內(nèi)胰島素濃度的減少(胰島素缺失)、周圍組織對胰島素應(yīng)答的降低(胰島素耐受性)、抗胰島素作用的激素過量(高血糖素、生長激素、皮質(zhì)醇和兒茶酚胺)。這些激素的異常造成碳水化合物、類脂、酮類及氨基酸代謝的改變。這些綜合癥的核心特征為高血糖。
胰島素在血漿內(nèi)的半衰期約為5-6小時。胰島素的降解主要在肝臟內(nèi)進行并且在腎臟和肌肉內(nèi)達到更低程度。約50％的到達肝臟門靜脈中的胰島素被破壞，從而無法進入體循環(huán)。胰島素通過腎小球過濾并經(jīng)腎小管再吸收及降解。
在肝臟內(nèi)胰島素的蛋白水解性降解主要是由受體介導(dǎo)的，其次，胰島素受體結(jié)合型復(fù)合物被內(nèi)化至被稱為核內(nèi)體的囊泡中并且在囊泡中開始降解。一些胰島素還被轉(zhuǎn)運到溶酶體內(nèi)降解。在肝細胞內(nèi)，約50％的內(nèi)化胰島素發(fā)生降解。
胰島素不適于處置糖尿病酮酸中毒，但在非酮昏迷高血糖的治療中以及在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者的近有效(perioperative)治療中十分重要。胰島素的皮下給藥(s.c.)是所有Ⅰ型糖尿病患者以及多數(shù)無法通過飲食和/或口服降血糖劑來充分控制的Ⅱ型糖尿病患者的初級療法。在所有病例中，不僅血糖而且其它造成胰島素過低和高血糖的失衡代謝都可以被正?；?。
主要基于胰島素皮下給藥的長期治療無法模擬應(yīng)答注射營養(yǎng)素時正常胰島素分泌的快速升高和減退，并且表現(xiàn)出選擇性的胰島素外周效應(yīng)而不是胰島素肝效應(yīng)，但是這種治療獲得了極大的成功。
傳統(tǒng)的胰島素皮下給藥制劑按照它們的作用時間類分為短效(速效)、中效和長效胰島素，還可以按照胰島素的種類來源分類。人胰島素目前被廣泛利用，理論上來說，人胰島素比豬胰島素和牛胰島素更不易致免疫，后兩者與人胰島素的區(qū)別之處分別在于一個和三個氨基酸。然而，當(dāng)被高度純化時，三種胰島素都具有較低的但仍可測出的刺激免疫應(yīng)答的能力。通常，上述制劑在中性pH值下穩(wěn)定并能夠在室溫下儲存較長時間。出于習(xí)慣和治療的目的，胰島素的劑量和濃度都以單位(U)表示，這是基于誘發(fā)禁食兔正常血糖量所需的量。胰島素同源制劑含有約25U/mg胰島素。幾乎所有市售的胰島素制劑都以濃度為100U/mg的溶液方式來供給。
短效或速效胰島素是溶解在中性pH緩沖液中的胰島素鋅溶液，通常飯前30-45分鐘時注射。這些制劑作用啟動得極快并且持續(xù)時間最短。
在穩(wěn)定的新陳代謝條件下，通常，正常胰島素是以中效或長效制劑給藥。中效胰島素在水溶液中溶解度略低，因此它們在皮下給藥后逐漸溶解，并且它們的作用持續(xù)時間較長。最常用的兩種制劑是NPH胰島素(NPH是指中性魚精蛋白hagedom)和慢胰島素，所述NPH胰島素是一種介于磷酸鹽緩沖液中并由加入的魚精蛋白硫酸鹽改性的結(jié)晶胰島素鋅緩沖液，所述慢胰島素是介于乙酸鹽緩沖液中并通過加入的氯化鋅改性的使胰島素溶解度減小的胰島素懸浮液。
由于短效胰島素的作用時間為0.4-7小時，中效胰島素的作用持續(xù)時間為1.5-20小時，所以當(dāng)抗調(diào)節(jié)激素(抗胰島素)增加時，兩種胰島素合用的正確時間和劑量必需將已變化參數(shù)考慮在內(nèi)，例如營養(yǎng)行為、夜間(禁食)低血糖和晨間的高血糖。若同時施用速效胰島素和長效或中效胰島素制劑時，這種藥物合用的常見缺陷是由于混用，短效胰島素可以與長效或中效制劑的過量鋅離子和魚精蛋白復(fù)合，由此轉(zhuǎn)化為中效甚至長效胰島素。
長效胰島素(例如特慢胰島素)或擴展的胰島素鋅或胰島素鋅魚精蛋白懸浮液都是鋅、鋅及魚精蛋白過量加入的胰島素制劑，目的在于得到不溶性的胰島素制劑。它們是胰島素鋅微粒的懸浮液并且它們之間的區(qū)別僅在于決定作用持續(xù)時間的顆粒大小有所不同。與正常胰島素不同的是，特慢效胰島素啟動十分緩慢并且具有延遲(“平坦的”)的作用峰。它們能夠在全天內(nèi)提供較低的基礎(chǔ)胰島素濃度，但它們的較長半衰期致使難以測出它們的最佳劑量，并且在達到穩(wěn)態(tài)濃度前需要數(shù)天的治療。牛和豬的特慢效胰島素比人特慢效胰島素具有更延遲的作用過程。據(jù)推薦，以正常日劑量作為給藥劑量并每日共三次給藥來開始治療，隨后采用每日一次或兩次的注射。
具有三個氨基酸和六個羧基的胰島素適合被修飾。本發(fā)明的胰島素衍生物是胰島素A和B鏈被一個或多個上述(ⅰ)-(ⅳ)取代基取代的胰島素，取代位于GlyA1、PheB1基團的一個或多個末端氨基、LysB29的ε-氨基、AsnA21和ThrB30和/或GluA4、GluA17、GluB13、GluB21。此外，如此取代的羧基和/或氨基胰島素衍生物還可以進一步被一個或多個(ⅰ)-(ⅳ)官能團在殘基ThrA8、SerA9、SerA12、TyrA14、TryA19、SerB9、TyrB16、TyrB16、TyrB26、Tyrb27、he ThrB30上的游離羥基位取代。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，胰島素衍生物是GlyA1和PheB1基團的游離末端氨基和/或LysB29的ε-氨基被一個或多個Fmoc取代，由此得到在胰島素分子的A1、B1和/或B29位置帶有1-3個Fmoc取代基的胰島素衍生物，尤其是GlyA1-N-(Fmoc)1-、PheB1-N-(Fmoc)1-和LysB29-N-(Fmoc)1-胰島素，GlyA1,PheB1-N-(Fmoc)2-、GlyA1,LysB29-N-(Fmoc)2-和PheB1,LysB29-N-(Fmoc)2-以及GlyA1,PheB1,LysB29-N-(Fmoc)3-胰島素。
胰島素與活化的Fmoc，例如與9-芴甲基-N-羥基琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)的反應(yīng)生成了單-、二-和三-N-Fmoc-胰島素，這些產(chǎn)物用HPLC方法很容易拆分開，可以分別得到它們的純化形式。為得到產(chǎn)物單一的二-N-Fmoc胰島素，首先應(yīng)將一個游離氨基例如用t-Boc基團保護起來，再將保護的胰島素衍生物與過量Fmoc-OSu反應(yīng)，隨后脫除保護基制得所需的二-N-Fmoc胰島素。當(dāng)向糖尿病患者給藥時，單-、二-和三-N-Fmoc-胰島素在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為原始胰島素并以不同的(包括延遲的)持續(xù)時間發(fā)揮抗糖尿功效。
為僅使胰島素(C-Fm)的羧基被取代，即AsnA21和ThrB30的末端以及GluA4、GluA17、GluB13和GluB21殘基中的羧基被取代，應(yīng)首先保護胰島素分子中的游離氨基，例如用t-Boc保護，隨后進行一個三步反應(yīng)，其中(1)游離羧基與例如鄰硝基苯酚或N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為活潑的酯基團；(2)在咪唑的存在下，活化的酯基團與9-芴甲醇反應(yīng)；和(3)脫除t-Boc。另一種方法是將羧基與N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺、9-芴甲醇和4-二甲基氨基吡啶直接酯化的一步反應(yīng)，此后脫除t-Boc。
當(dāng)希望得到氨基和羧基同時被取代的Fmoc-胰島素衍生物(N-Fmoc,C-Fm)時，首先與Fmoc-OSu反應(yīng)得到N-Fmoc衍生物，隨后將N-Fmoc與9-芴甲醇反應(yīng)以轉(zhuǎn)化為活潑的酯，如上所述。
為了制備羧基和羥基官能團取代的Fm,Fmoc-胰島素衍生物(C-Fm,O-Fmoc)，首先應(yīng)用t-Boc保護氨基，再按照上述方法制備C-Fm胰島素衍生物，此后與9-芴甲氧基碳酰氯反應(yīng)并脫除N-t-Boc保護基。
為制備在氨基、羧基和羥基官能團位取代的Fm,Fmoc-胰島素衍生物(N,O-Fmoc,C-Fm)，按照上述方法制備N-Fmoc、C-Fm胰島素，隨后與9-芴基甲氧基碳酰氯反應(yīng)。
本發(fā)明的改性胰島素可以從任何適用于人體的胰島素制得，例如天然、重組或突變的人胰島素、豬或牛胰島素。突變型胰島素的例子有B16-Tyr→His人胰島素類似物(Kaarsholm&Ludvigen,1995)和LysB28proB29人胰島素類似物(胰島素lispro)，這些胰島素中的天然氨基酸序列中的B28和B29位發(fā)生反轉(zhuǎn)。胰島素lispro與人胰島素等效，但它在皮下注射位的吸收更快(Campbell等人，1996)。在一個優(yōu)選實施方案中，胰島素既可以是天然的也可以是重組的人胰島素。
本發(fā)明的單-N-Fmoc-胰島素衍生物經(jīng)〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化試驗測定發(fā)現(xiàn)，其生物功效為天然胰島素生物的40-80％。同樣根據(jù)〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化試驗的測定，二-和三-N-Fmoc-胰島素衍生物分別為天然胰島素功效的2-9％和＜1％。當(dāng)以正確的比例適當(dāng)使用時，這三種原型可以替代現(xiàn)有的用于糖尿病皮下治療的短效、中效和長效胰島素的傳統(tǒng)混合物。對于胰島素，本發(fā)明提供了含有一種或多種本發(fā)明胰島素衍生物及可藥用載體的藥物組合物。為達到長效作用，該組合物應(yīng)優(yōu)選包含單用的或兩者合用的N-(Fmoc)3-胰島素或N-(Fmoc)2-胰島素衍生物。藥物組合物可以是任意的適當(dāng)形式，例如口服制劑或皮下注射制劑。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及用于治療糖尿病的方法，該方法包括給予糖尿病患者有效量的一種或多種本發(fā)明胰島素衍生物。在優(yōu)選實施方案中，所用衍生物為天然的或重組的N-(Fmoc)3-胰島素或N-(Fmoc)2-胰島素或兩者的混合物，它們以5-8天的間隔期給藥。若需要，采用Fmoc-胰島素衍生物的治療由速效胰島素的每天給藥來完成。
在長效治療中，胰島素主要經(jīng)皮下注射給藥?，F(xiàn)有的利用長效胰島素皮下給藥的治療方法存在糖尿病患者個體吸收差異的缺陷，這應(yīng)歸因于所施用的物質(zhì)在皮下注射位置可能發(fā)生的擴散。本發(fā)明提供的胰島素衍生物在胰島素分子自身中具有“內(nèi)置”減小的溶解度。這樣可消除較大的人體內(nèi)皮下吸收的差異，同時還減小甚至消除由類似物混合造成的干擾。三種N-(Fmoc)-胰島素原型的適當(dāng)混合物可以歷經(jīng)延長了的作用持續(xù)時間，這歸功于混合物將速效胰島素的需要與N-(Fmoc)2-胰島素和N-(Fmoc)3-胰島素的緩釋作用相結(jié)合，而這樣的結(jié)合沒有任何干擾作用。
本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明組合物含有單-、二-和三-N-Fmoc胰島素衍生物的混合物。N-(Fmoc)3-胰島素主要是長效胰島素；N-(Fmoc)1-胰島素根據(jù)〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化試驗的測定具有40-80％的生物活性，并且在水溶液中顯示出較高的溶解度；N-(Fmoc)2-胰島素根據(jù)〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化試驗的測定具有2-9％的生物活性并且在水溶液中不易溶。三種類似物都在37℃的溫度下和生理pH值下完全轉(zhuǎn)化為活性胰島素。因此，這三種類似物的適當(dāng)混合物可以提供短效、中效和長效的作用，目前此類功效需通過正常胰島素與含鋅和魚精蛋白的制劑的多劑量注射劑來獲得。
本發(fā)明的其他方面是，適合人或動物使用的前藥衍生自藥物，所述藥物包括但不限于是抗糖尿病藥、抗炎劑、殺菌劑、抗病毒劑、抗腫瘤藥、抗高血壓藥以及治療免疫疾病、皮膚病和神經(jīng)病的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物包括前藥或其抗炎藥鹽以及可藥用載體。本發(fā)明涉及了適當(dāng)?shù)慕o藥途徑，例如通過常規(guī)的注射、植入、口服、直腸或局部給藥。這些制劑可以利用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的常規(guī)方法來制備，例如“Remington氏藥物科學(xué)”，A.R.Gennaro編輯，17版，1985,Mack出版公司，Easton,PA，美國。
本發(fā)明將由下述非限制性的實施例進行闡述。
實施例生物方法(ⅰ)鏈脲霉素(STZ)-處理大鼠的準備雄性Wistar大鼠(180-200g)由Weizmann科學(xué)院，激素研究部提供。按照Meyerovitch等人，1987公開的方法，通過單劑量靜脈內(nèi)注射鏈脲霉素介于0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.5)中的新配溶液來誘發(fā)糖尿病。(ⅱ)胰島素受體酪氨酸激酶的濃縮制劑根據(jù)Meyerovitich等人，1990公開的方法，從大鼠肝臟獲得胰島素受體酪氨酸激酶的濃縮制劑。簡單而言，在蛋白酶抑制劑存在的條件下將肝臟勻化，用1％Triton X-100溶解并離心。令上清液穿過小麥胚凝集素(WGA)-瓊脂糖柱(Sigma)。用0.3M N-乙?；?D-葡萄糖胺在50mMHEPES緩沖液(pH7.4)中的溶液洗脫出被吸收的胰島素受體部分，該溶液還含有0.1％Triton X-100、10％甘油和0.15M氯化鈉。利用(ⅲ)和(ⅳ)所述試驗來評估胰島素和胰島素衍生物的生物功效。(ⅲ)脂肪形成(將標(biāo)記的葡萄糖摻入到完整脂肪細胞的脂中)基本采用Rodbell,1964所述的方法來準備大鼠脂肪細胞。將雄性Wistar大鼠的脂肪墊用剪刀剪切成小塊并懸浮在3ml KRB的緩沖液中，該緩沖液含有110mM氯化鈉、25mM碳酸氫鈉、5mM氯化鉀、1.2mM磷酸二氫鉀、1.3mM氯化鈣、1.3mM硫酸鎂和0.7％BSA(pH 7.4)。在25ml變形塑料瓶中，利用膠原酶并在卡波金(含5％二氧化碳的氧)的氣氛、37℃及劇烈攪拌的條件下進行消化。隨后加入5ml緩沖液，將細胞過篩。此后再將細胞在15ml塑料試管內(nèi)室溫下靜置數(shù)分鐘，使其漂浮，再將下層的緩沖液除去。該過程(懸浮、飄浮、除去下層緩沖液)重復(fù)三次。
將脂肪細胞懸浮液(3×105細胞/ml)分裝到塑料瓶中(每瓶0.5ml)并在37℃和卡波金的條件下與0.2mM〔U-14C〕葡萄糖共同保溫60分鐘，塑料瓶內(nèi)含有或不含胰島素。加入含甲苯的閃爍液(1.0ml每瓶)來終止脂肪形成，對經(jīng)提取的脂類內(nèi)的放射性進行計數(shù)(Moody等人1974)。在常規(guī)試驗中，胰島素刺激的脂肪形成比基礎(chǔ)值高4-5倍(基礎(chǔ)值為2000cpm/3×105細胞/小時；vinsulin 8000-10000cpm/3×105細胞/小時)。在該試驗中，胰島素刺激脂肪形成，其ED50值=0.15±0.03ng/ml(Shechter&Ron 1986)。具有ED50=15ng/ml的胰島素類似物的生物功效為天然胰島素的～1％。(ⅳ)受體酪氨酸激酶活性的測定在本試驗中，胰島素將其自身受體活化為磷酸化物，一種含有摩爾比為4∶1的L-谷氨酸和L-酪氨酸的無規(guī)共聚物〔聚(Glu4Tyr)〕。標(biāo)準酶試驗混合物(終體積60μl，以Hepes為溶劑，pH7.4,0.1％Triton X-100)含有WGA純化胰島素受體(5μg蛋白)、20mM氯化鎂、2mM二氯化錳、100μMATP以及不同濃度(1ng/ml-10ng/ml)的胰島素或胰島素衍生物。在22℃下預(yù)保溫30分鐘，加入聚(Glu4Tyr)(終濃度0.7mg/ml)引發(fā)反應(yīng)，反應(yīng)在22℃進行20分鐘并加入EDTA(20mM)終止反應(yīng)。通過放射免疫測定法并利用磷酸酪氨酸的特異性單克隆抗體(最終稀釋度1∶100,000)和125I-BSA-磷酸酪氨酸偶聯(lián)物來定量分析聚(Glu4Tyr)中的磷酸酪氨酸。在此特定試驗中，胰島素在20±3ng/ml的濃度時表現(xiàn)半數(shù)最高效能。具有ED50=2ng/ml的胰島素類似物的生物功效為胰島素的～1％。實施例1:N-Fmoc胰島素衍生物的準備(a)合成將人胰島素(100mg,17.2μmol)(由Biotechnology-General,Rehovot,Israel捐贈)懸浮在4ml含有17.mg(172μmole)三乙胺的分析純二甲基甲酰胺(DMF)溶液中。加入Fmoc-Osu(58mg,172μmole)。將均勻的反應(yīng)混合物在25℃下攪拌20小時，隨后加入乙酸乙酯直至溶液混濁，再加入乙醚使其沉淀完全。離心，除去溶劑，沉淀物分別用乙醚和水洗滌兩次。由此得到單-、二-和三-N-Fmoc胰島素衍生物的混合物，該混合物通過制備HPLC分離并純化。用異丙醇洗滌固體粗產(chǎn)物可以將單修飾的N-Fmoc-胰島素衍生物從雙-、三-修飾的衍生物中分離出來。(b)N-Fmoc-胰島素衍生物的分離和純化將固體粗產(chǎn)物上樣到帶有HPLC預(yù)裝柱(Merck,LichrosCART250-10mm，含有LICHrosob RP-18〔7μm〕)的反相HPLC中。線性梯度液從0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液(溶液A)和0.1％TFA的乙腈水(75∶25)溶液(溶液B)開始。流速為1m1/min。N-(Fmoc)1-胰島素自柱中出現(xiàn)的保留時間為21.1、21.9和22.8分鐘。N-(Fmoc)2-胰島素衍生物的保留時間為26.3、27.1和27.7分鐘，N-(Fmoc)3-胰島素的保留時間為31.5分鐘。合并21-23分鐘、26-28分鐘和31.5分鐘時的餾分，凍干并化學(xué)定性。將21-23分鐘的相應(yīng)餾分(單修飾的胰島素)和26-28分鐘的相應(yīng)餾分(雙修飾的胰島素)進一步分別純化為各個單-Fmoc和二-Fmoc胰島素衍生物。連接在胰島素分子上的Fmoc基團的量可利用分光光度法在301nm下測定，隨后用含50％哌啶的二氯甲烷溶液處理已知量的N-Fmoc胰島素衍生物。(c)N-Fmoc胰島素衍生物的化學(xué)定性經(jīng)HPLC法制備性分離后，得到7種N-Fmoc-胰島素衍生物。其中分別包括三種單修飾的、三種雙修飾的和一種三修飾的衍生物(表1)。每種化合物個體的保留時間和收率皆列于表Ⅰ中。不同N-Fmoc-胰島素之間很容易被拆分，在試驗條件下可得到純化的形式。PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素(保留時間=27.7分鐘)、GlyA1、PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素可以通過若干方法(包括質(zhì)譜)進行定性(表I)。(d)PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素的合成由于生物測定揭示了PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素特別適合用作長效胰島素，我們又設(shè)計了另一種合成它的方法。在預(yù)設(shè)的試驗條件下，用t-Boc基團將GlyA1部分特異性保護，其中采用了1當(dāng)量的碳酸二叔丁酯和DMSO/三乙胺(20∶1)作為溶劑。隨后用HPLC法分離。利用DMF作為溶劑并以DIEA作為堿，將GlyA1-N-Boc-胰島素與過量的Fmoc-OSu(10當(dāng)量)反應(yīng)。用TFA處理并在HPLC上純化，得到收率良好(～50％)的PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素。(e)N-Fmoc-胰島素衍生物的生物特性本發(fā)明N-Fmoc-胰島素的若干特征在表Ⅱ和表Ⅲ中列出。衍生物在水溶液中的溶解度隨修飾度的增高而降低。N-(Fmoc)1-胰島素僅僅是略低于天然胰島素的溶解度，而N-(Fmoc)3-胰島素約比天然胰島素的溶解度低20倍。衍生物的生物功效也隨衍生度的增高而降低。因此，利用〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化分析法測定，單-、雙-和三-N-Fmoc胰島素的生物功效分別為天然胰島素的40-80％、2-9％和＜1％。根據(jù)更敏感的并用完整大鼠脂肪細胞來完成的脂肪形式生物試驗，F(xiàn)moc-胰島素衍生物都表現(xiàn)出較低的生物功效。在脂肪形成試驗中，GlyA1-N-Fmoc-胰島素和二-N-Fmoc-胰島素分別為天然胰島素生物活性的4.7％和0.4-1.4％。所有七種衍生物在pH8.5下保溫放置2天后都可以反轉(zhuǎn)為天然激素。這是通過全部生物功效的恢復(fù)(表Ⅱ和Ⅲ)、衍生物峰的消失以及天然胰島素峰(保留時間=15分鐘)的出現(xiàn)來證實的，其中天然胰島素峰是利用分析HPLC法分離的。
表Ⅰ:N-Fmoc衍生物的化學(xué)特性
附注氨基酸分析法常用于檢證所有Fmoc-衍生物的正確組成。
a由Merk制造，LiChrospher 100 RP-8(5μm)柱，在40分鐘內(nèi)使用由60％溶液A(0.1％TFA的水溶液)和40％溶液B(0.1％TFA的乙腈水，75∶25溶液)至100％溶液B的線性洗脫(流速1m/分鐘)。
b基于由HPLC得到的純原料。
表Ⅱ:Fmoc-胰島素衍生物的若干代表性特征
附注按照試驗部分所述的兩種生物分析法測定胰島素樣的功效表Ⅳ脂肪形成試驗(利用完整大鼠的脂肪細胞)中數(shù)種N-Fmoc胰島素的生物功效及活化時間進程
實施例2.N-Fmoc-胰島素的生物活性(a)N-Fmoc-胰島素在pH7.4下活化的時間進程在研究N-Fmoc-胰島素在糖尿病大鼠體內(nèi)的抗糖尿病功效前，首先在試管內(nèi)測定它們的反應(yīng)速率(代表它們成為天然激素的轉(zhuǎn)化作用)將衍生物溶于含有10％二甲基亞砜(DMSO)的Hepes-緩沖液(50mM,pH7.4)中并在37℃下保溫放置(即在生理pH條件和體溫下)。在預(yù)定的時間點取樣，測定出它們相對于天然胰島素的生物功效。根據(jù)胰島素受體酪氨酸激酶的活化試驗(在生物方法，(ⅳ)部分中描述的無細胞試驗)以及上文的生物方法中第(ⅱ)部分所述的在完整大鼠脂肪細胞內(nèi)進行的脂肪形成刺激試驗來評估衍生物的生物活性。圖1表明所得結(jié)果。N-(Fmoc)3-胰島素的半數(shù)最大活性是在t 1/2=14天時出現(xiàn)并且在溫育后21天時幾乎達到完全活化。
通常，N-(Fmoc)2-胰島素在pH7.4時活化最快。由N-(Fmoc)3-胰島素觀測到的六天遲滯期在N-(Fmoc)2-胰島素中并未出現(xiàn)。因此N-(Fmoc)3-胰島素可能帶有限制其反應(yīng)的并且緩慢水解的Fmoc部分。水解后活化速率加快。從實際角度來看，這意味著兩種類似物的混合物通過覆蓋較早的和較后的時間階段使該混合物以延遲的時間周期釋放出活性胰島素。較活潑的單修飾Fmoc-胰島素在pH7.4下和t1/2=5天時再生得到全部生物活性。
一旦在循環(huán)中活化，N-(Fmoc)2-和N-(Fmoc)3-胰島素在延遲周期內(nèi)提供預(yù)期較低的激素基礎(chǔ)濃度。這主要由失活衍生物轉(zhuǎn)化為短效活性天然胰島素的速率來決定。同時，N-(Fmoc)2,3-胰島素具有較緩慢的活化速率(如圖1所示)。較快(突然)的速率(即以分鐘而不是小時計)會導(dǎo)致低血糖發(fā)作。
通過〔聚(Glu4Tyr)〕磷酸化法，PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素顯示出9％的生物活性并且表現(xiàn)出介于天然和N-(Fmoc)3-胰島素之間的中等程度的溶解度。與N-(Fmoc)3-胰島素不同的是，(N-Fmoc)2-胰島素在保溫放置后的很短時間內(nèi)就開始轉(zhuǎn)化為天然激素，如圖1所示。因此N-(Fmoc)2-胰島素(預(yù)期更活潑)在給藥后表現(xiàn)為作用啟動得較快。N-(Fmoc)2-和N-(Fmoc)3-胰島素的適當(dāng)結(jié)合可以成為通過單劑量給藥來釋放基礎(chǔ)胰島素的理想配方，其特征在于作用的快速啟動以及較長的持續(xù)時間，這構(gòu)成了本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。
表Ⅳ:PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素單劑量給藥對于STZ大鼠日體重增益的影響
(b)PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素的單劑量腹膜內(nèi)給藥對正常大鼠的作用為進一步證實(Fmoc)2-胰島素的長效性能是由生理條件下其向天然激素轉(zhuǎn)化減緩所造成，我們又設(shè)計了另外的體內(nèi)試驗。該試驗反映了胰島素(或胰島素衍生物)皮下給藥后在循環(huán)內(nèi)的長效特征。令正常大鼠接受天然胰島素、NPH-胰島素和(Fmoc)2-胰島素(3mg/只)的單劑量腹膜內(nèi)注射，并且在三天的周期內(nèi)監(jiān)測它們的血液葡萄糖水平。結(jié)果在圖2中表示。天然胰島素(圖3)和NPH-胰島素(圖2)分別在約12小時和15小時內(nèi)誘發(fā)過低的血糖。低血糖復(fù)原所需的t 1/2分別為8小時和10小時。(Fmoc)2-胰島素在約48小時的時間內(nèi)降低血液葡萄糖濃度，并且低血糖復(fù)原的t 1/2為26小時。這樣的結(jié)果支持了我們的下列想法實際上，(Fmoc)2-胰島素的延遲作用是鑒于其內(nèi)在特性而并不基于NPH-胰島素的常規(guī)機理，即在注射位置沉積并緩慢溶解-進入循環(huán)中。在本試驗中，天然胰島素和NPH-胰島素之間降血糖濃度的性能差異與它們經(jīng)皮下方式給藥時的差異要小。該事實應(yīng)歸因于腹腔內(nèi)存在較大體積的液體并由此造成鋅結(jié)晶胰島素的快速轉(zhuǎn)化，從而生成單體形式。其他兩種(Fmoc)2-胰島素衍生物，即〔GlyA1、LysB29〕和〔GlyA1、PheB1〕也被合成并在本試驗中受到評估。結(jié)果表明，兩種衍生物具有與PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素相類似的長效作用并且t1/2為22-24小時。(c)N-(Fmoc)3-胰島素對蛋白水解作用的的耐受性將天然胰島素或N-(Fmoc)3-胰島素(分別為1mg/ml，介于50mMHepes中，pH7.4,10％DMSO)在37℃下保溫放置。隨后加入糜蛋白酶和胰蛋白酶(分別為0.5％w/w)。在預(yù)定時間取樣并利用分析型HPLC法測定。通過測定天然胰島素峰(保留時間=15分鐘)和N-(Fmoc)3-胰島素峰(保留時間=31.5分鐘)峰面積的減少來得到降解百分比。結(jié)果如圖4所示。
N-(Fmoc)3-胰島素在pH7.4下對糜蛋白酶和胰蛋白酶混合物具有較高的耐受性。天然胰島素和N-(Fmoc)3-胰島素的蛋白水解過程分別為t1/2=0.5和7.5。實施例3:PheB1,LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素和N-(Fmoc)3-胰島素的單劑量皮下給藥對STZ-糖尿病大鼠的影響STZ大鼠是評估胰島素體內(nèi)治療的良好模型。在該模型中，由組織學(xué)研究(Pederson等人，1989)證明了β-細胞功能的約90％被鏈脲霉素破壞。大鼠出現(xiàn)胰島素分泌過少(為正常胰島素水平的10-30％)、高血糖(＞300mg/dl；參照大鼠的正常血液葡萄糖水平為90-100mg/dl)及分解代謝態(tài)?？捎^察到的外部癥狀是“病’態(tài)并且液體攝取和排泄尿量增加了3-4倍。日體重增益比參照大鼠的正常體重增益減少10-20％(0.3-0.8g/天/只大鼠)。組織內(nèi)的病理學(xué)變化極其顯著。一些更顯著的生化改變?yōu)樘窃x關(guān)鍵酶的活性減弱、肝臟內(nèi)糖原的缺失、葡萄糖轉(zhuǎn)運數(shù)量及周圍組織的減少，以及胰島素結(jié)合性能雖然增高但未伴隨胰島素應(yīng)答的增強。
在這種糖尿病大鼠模型中，常規(guī)的胰島素療法是在一周內(nèi)連續(xù)給予胰島素(5單位/天/大鼠)。此類療法使糖尿病大鼠的血液葡萄糖水平正?；⒒謴?fù)到合成代謝的狀態(tài)，它改善了多種由高血糖和低胰島素分泌誘發(fā)的病理效應(yīng)。速效(正常)胰島素的單劑量給藥僅在數(shù)小時內(nèi)有效。在為期7天的治療方案結(jié)束后，24-30小時內(nèi)就會反彈出現(xiàn)高血糖癥。
為評估N-(Fmoc)3-胰島素是否具有出現(xiàn)抗糖尿病功效，給糖尿病誘發(fā)后兩周的STZ大鼠單劑量皮下注射天然胰島素(A組，25單位，溶于1.0ml水-10％DMSO,n=4)或N-(Fmoc)3-胰島素(B組，1mg，溶于1.0ml水-10％DMSO,n=4)。在隨后1天中測定血液葡萄糖水平和日體重增益。
所得結(jié)果如圖5所示。各點代表4只大鼠血漿葡萄糖的算術(shù)均值±SEM。B組的血循環(huán)葡萄糖水平明顯較低。B組自給藥第2天始，葡萄糖水平降低了90-110mg/dl，并且這種較低的葡萄糖水平維持到第6天。在第7天，兩組的血液葡萄糖水平?jīng)]有顯著差異。接受N-(Fmoc)3-胰島素的大鼠表現(xiàn)出“康復(fù)”的征兆。B組中的日體重增益約高出3倍，A組和B組分別等于0.57±0.08,1.43±0.14g/只/天。因此，N-(Fmoc)3-胰島素的單劑量給藥具有延遲且滿意的抗糖尿病作用，這種作用可持續(xù)4天(延緩開始近兩天)。這樣的體內(nèi)長效作用可以用衍生物逃避受體介導(dǎo)的胞吞以及耐蛋白水解來來解釋。此外，N-(Fmoc)3-胰島素在水溶液中極易溶。因此，在人體中，全面的持續(xù)作用可以通過皮下給藥后原型治療物質(zhì)(即緩慢溶解的“內(nèi)置”不溶性胰島素)被新物質(zhì)取代來達到，換言之，血液中的長效、共價改性的并失活的胰島素衍生物緩慢轉(zhuǎn)化為天然激素。鑒于此類胰島素衍生物是失活的，所以可采用大劑量給藥而不必擔(dān)心低血糖發(fā)作。
為測定PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素在降低糖尿病試驗大鼠的血液葡萄糖水平中的作用，STZ處理的大鼠在糖尿病誘發(fā)第9天接受N-(Fmoc)2-胰島素的單劑量皮下注射(A組，3mg/只，在2.0ml20％DMSO,n=5)或長效胰島素的單劑量皮下注射(NPH-人胰島素，Humulin,HI-310)(B組，0.75ml(3mg)每只鼠，n=5)。C組僅接受賦形劑(2.0mld 20％DMSO)。每天測定血液葡萄糖水平。
結(jié)果如圖6所示。其中，水平虛線表示參照大鼠血漿葡萄糖的算術(shù)均值。如圖6所示，HPLC純化的PheB1、LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素在單劑量皮下給藥的4天內(nèi)誘發(fā)血糖正?；?，并且增加了這些分解代謝的STZ大鼠模型的日體重增益(表Ⅲ)。N-(Fmoc)2-胰島素與市售(不溶性)長效制劑一樣有效。速效(可溶)胰島素在該試驗體系中的血液葡萄糖水平降低增益僅能持續(xù)數(shù)小時(未圖示)。這種制劑在水溶液中相對易溶(pH7.4)，在這方面比不溶性N-(Fmoc)2-胰島素更具有優(yōu)越性，這是由于懸浮液不能精確皮下注射給藥。實施例4(2-磺基)Fmoc-胰島素的制備和生物活性(a)(2-磺基)Fmoc-胰島素(sulfmoc-胰島素)的合成Fmoc本身的引入是為降低Fmoc-胰島素的疏水性，由此增加它在緩沖水溶液中的溶解度并改變再生為胰島素的速率。這可以通過將極性的或優(yōu)選荷電的基團引入到芴環(huán)內(nèi)來實現(xiàn)，例如引入鹵素、硝基、羧基、氨基、銨和磺基。親電性取代反應(yīng)首先在芴的2位發(fā)生取代，通常9位上取代基(例如CH2OCO-OSu)的特性并不影響取代的取向。因此，0℃下，用0.9當(dāng)量氯磺酸在二氯甲烷(DCM)中處理Fmoc-OSu，高收率地得到(2-磺基)Fmoc-OSu(式(ⅰ)，2位的R1=SO3H,R2=R3=R4=H,A=OCO-OSu)。用超過1當(dāng)量的氯磺酸處理將會導(dǎo)致取代發(fā)生在芴環(huán)7位上。
通過將活潑的(2-磺基)Fmoc-OSu酯與胰島素氨基的偶聯(lián)來引入(2-磺基)Fmoc基團。該反應(yīng)是在緩沖水溶液(pH7.4)中和反應(yīng)物過量(～20當(dāng)量)的條件下進行。滲析和冷凍干燥后，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)。HPLC分析試驗表明一種占優(yōu)勢的主要產(chǎn)物顯然為(Sulfmoc)2-胰島素，與質(zhì)譜的測定相符(m/z 6411)。當(dāng)該反應(yīng)在乙腈/水，1∶1中進行時，主產(chǎn)物為(Sulfmoc)3-胰島素，與質(zhì)譜的測定相符(m/z 6713)。(b)(2-磺基)Fmoc-胰島素活化的時間進程(Sulfmoc)2-胰島素在37℃和pH8.5(0.1M碳酸氫鈉)的條件下保溫放置36小時或在37℃和pH7.4(50mM Hepes緩沖液)的條件下保溫放置10天后可以全部再生為天然激素，兩種條件下的t 1/2值分別為12-15天和6天。上述結(jié)果可根據(jù)分析型HPLC測定時胰島素衍生物峰的消失以及天然激素峰的出現(xiàn)來得到證實。(Sulfmoc)2-胰島素成為天然激素的水解作用比(Fmoc)2-胰島素(21天，pH7.4,37℃)的水解作用快。
(Sulfmoc)2-胰島素具有0.5％生物活性并且在水中顯示出良好的溶解度。在pH8.5、37℃下保溫后，(Sulfmoc)2-胰島素再生為完全活性的天然胰島素并且t 1/2值為4-6小時，這是根據(jù)生物功效隨時間的增高來判斷(大鼠脂肪細胞內(nèi)脂肪形成的試驗)。(c)(2-磺基)Fmoc-胰島素單劑量腹膜內(nèi)給藥對正常大鼠的作用為評估(Sulfmoc)2-胰島素皮下吸收的長效性能，令大鼠接受天然胰島素、NPH-胰島素或(Sulfmoc)2-胰島素的單劑量腹膜內(nèi)給藥。測定隨后兩天內(nèi)的血液葡萄糖濃度。圖3圖示了由(Sulfmoc)2-胰島素在24小時內(nèi)誘發(fā)的低血糖。低血糖復(fù)原的t 1/2值=14小時。對于速效胰島素和NPH-胰島素，它們的t 1/2分別等于8(圖3)和10小時(圖2)。因此，(Sulfmoc)2-胰島素的單劑量給藥提供了中效抗糖尿病作用，即比速效和NPH-胰島素延遲了1.5-2倍。如此結(jié)果與由上述體外試驗發(fā)現(xiàn)的Sulfmoc-胰島素水解速率的加快相吻合。位于芴環(huán)2位的磺酸基團加快了9位質(zhì)子脫除速率并由此使sulfmoc部分的水解增快2-3倍。有關(guān)Sulfmoc基團在不同堿條件下的不穩(wěn)定性的研究表明，它們的堿敏感性比母體要高。此外，例如，Sulfmoc自甘氨酸釋放的速率常數(shù)比Fmoc基團的更高(約30的因子)。因此，為增加溶解度而向胰島素引入Sulfmoc反過來會降低衍生物的長效作用。因此，長效抗糖尿病作用的原理，(即通過避免受體介導(dǎo)的胞吞和降解)同樣適用于Sulfmoc-胰島素衍生物。
Sulfmoc從胰島素上脫除速率的加快有利于某些胰島素(中效制劑)的給藥。這種制劑顯然更易于完全溶解在緩沖水溶液中，這與現(xiàn)有市售制劑形成對照。并且，也可以在芴環(huán)中引入其他具有不同酸度和極性的基團。所以，通過控制引入到Fmoc上的基團的類型和數(shù)量可以決定改性胰島素的溶解度和反應(yīng)速率。實施例5氨基末端和羧基末端修飾的胰島素衍生物(N-Fmoc-和C-Fm-胰島素)的制備將N-(Fmoc)3-胰島素(64.5mg；10μmol；60μmol羧基，即屬于鏈內(nèi)Glu和兩個C-末端殘基的羧基)溶于含有鄰硝基苯酚(250μmol；35mg)或N-羥基琥珀酰亞胺(250μmol；28mg)的8ml二甲基甲酰胺(DMF)中(Lab.Scan.,Dublin,Ireland)，將該溶液冷卻至4℃。加入N,N-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC；250mmol,53mg)介于0.5ml DMF中的溶液并將反應(yīng)混合物在4℃下保持1小時，隨后室溫下保持6小時。通過離心除去N,N-二環(huán)己基脲沉淀，用干燥的、經(jīng)冰浴冷卻的乙醚分別沉淀出N-(Fmoc)3-胰島素的鄰硝基苯酚或N-羥基琥珀酰亞胺酯。將固體用無水乙醚洗滌兩次，干燥，溶于8ml DMF中，加入9-芴基甲醇(250μmol；50mg)和咪唑(250μmol；17mg)的1ml DMF溶液。反應(yīng)混合物在室溫下放置過夜。用無水乙醚沉淀，得到62mg N-(Fmoc)3、C-(Fm)-胰島素。反應(yīng)主產(chǎn)物為N-(Fmoc)3-胰島素的六-9-芴甲基酯(n=6)。實施例6羧基末端Fm-胰島素(C-Fm-胰島素)的制備為了制備叔丁氧基羰基(t-Boc)3-胰島素，在攪拌下，將碳酸二叔丁酯(56mg,259μmol)加入到用冰浴冷卻的含有胰島素(100mg,17.2μmole)和三乙胺(174mg,172μmole)的DMF(4mL)懸浮液中，將反應(yīng)混合物升至室溫并攪拌5小時(逐漸變?yōu)槌吻?。隨后加入乙酸乙酯直至溶液混濁，隨即加入乙醚，離心出沉淀，用乙醚洗滌兩次。進一步純化所得的固體粗產(chǎn)物(95mg)。分析HPLC表明，主產(chǎn)物在27.5分鐘時洗脫出來。
將該產(chǎn)物溶解在10ml DMF中并用鄰硝基苯酚或N-羥基琥珀酰亞胺處理(如上所述)，生成相應(yīng)的活化酯。將該酯與9-芴基甲醇在咪唑的存在下反應(yīng)，用無水乙醚沉淀后，得到N-(t-Boc)3,C-(Fm)n-胰島素的粉末(87mg)。將粉末在真空和五氧化二磷下干燥并在室溫下用5ml三氟乙酸處理1小時，以有效脫除N-末端的t-Boc保護基。在此過程中，絕大多數(shù)胰島素衍生物溶解。加入冰浴冷卻的無水乙醚可以得到粉末，離心分離，用無水乙醚徹底洗滌。生成基本為C-(Fm)6-胰島素的產(chǎn)物79mg。實施例7(Fmoc)1-人生長激素(Fmoc1-hGH)的制備在正常生理條件下，健康對象中的hGH水平每天以脈動方式增高數(shù)次(晝夜)。hGH為短效物質(zhì)?，F(xiàn)有治療方案包括hGH的每日單劑量給藥并且可能僅在數(shù)小時內(nèi)有效。能夠在晝夜24小時內(nèi)提供閾值水平的hGH的長效(緩釋)hGH制劑極其需要。
將天然hGF(Biotechnology General,Rehovot,Israel；9.2mg)溶解在0.1M碳酸氫鈉(2.0ml；pH8.5)中，加入DMSO(0.1ml)(DMSO的終濃度～5％)，將該溶液冷卻至0℃。隨后加入10μl的1當(dāng)量Fmoc-OSu(取自18.5mg/ml的DMSO儲備液)，在0℃和適當(dāng)攪拌的條件下使反應(yīng)進行30分鐘。此后再加入另一個10μl(含有1當(dāng)量的Fmoc-OSu)，30分鐘后，將反應(yīng)混合物在7℃及無水條件下透析，過夜。利用半制備型HPLC，得到與天然hGH(總量的～20％，保留時間30分鐘，PR-8柱；250×10mm,Merk)和改性Fmoc-hGH(總量的～20％，保留時間32分鐘)相應(yīng)的兩個蛋白質(zhì)主峰。
表Ⅴ列出了Fmoc-hGH在37℃下和0.1M碳酸氫鈉(pH8.5)中產(chǎn)物hGH的轉(zhuǎn)化作用。在預(yù)定時間點，取等份樣品并利用分析HPLC(RP-9柱)。以天然hGH峰面積的增益來評估Fmoc-hGH向天然hGH的轉(zhuǎn)化作用。
如表Ⅴ所示，F(xiàn)moc-hGH的受體結(jié)合功效為天然激素的15％。通過HPLC分析法及受體結(jié)合試驗，可判斷出Fmoc-受體結(jié)合功效在pH8.5(37℃)下保溫約6天或在pH10.5(37℃)下保溫4天后可以生成完全活性的天然hGH。
表Ⅴ由Fmoc-hGH經(jīng)37℃保溫生成hGH
(1)按照Gertler等人，1984公開的方法進行碘代hGH的置換，天然hGH在適用于Fmoc-hGH的條件下完全穩(wěn)定(pH10.5,37℃,4天)(2)在37℃和0.1M碳酸氫鈉(pH8.5)下保溫Fmoc-hGH。在預(yù)定時間點，取樣并用分析型HPLC鑒定。根據(jù)與天然hGH相應(yīng)的峰面積的增益評估Fmoc-hGH向天然hGH的轉(zhuǎn)化作用。實施例8:N-Fmoc-頭孢氨芐和頭孢氨芐-O-Fm酯的制備頭孢氨芐〔7-(D-α-氨基苯基乙酰胺)脫乙酰氧基頭孢菌酸〕是具有廣譜抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌活性的β內(nèi)酰胺抗生素。經(jīng)酯化反應(yīng)制得兩種單取代的頭孢氨芐，它們分別是頭孢氨芐的氨基(N-Fmoc-頭孢氨芐)或羧基(頭孢氨芐-O-Fm)與芴甲基(Fm)部分共價連接的產(chǎn)物。
(i)(a)N-Fmoc-頭孢氨芐的制備將Fmoc-OSu(145mg,0.432mmole)的DCM(2.5ml)溶液在5分鐘內(nèi)加入到攪拌中的頭孢氨芐水合物(Sigma,USA；50mg,0.144mmole)和三乙胺(29mg,0.288mmole)在二氯甲烷(DCM；2.5ml)中的懸浮液中。反應(yīng)混合物1小時后變澄清，將其在室溫下攪拌過夜，在此期間溶液變混濁。真空下濃縮后，在混合物中加入乙醚，濾出生成的沉淀并用乙醚洗滌兩次。將濾液溶于DCM中并用酸化的水(pH2)、水和鹽水提取，無水硫酸鎂干燥。將該溶液過濾并濃縮后加入乙醚。濾出沉淀產(chǎn)物并用乙醚洗滌，生成Fmoc-頭孢氨芐的純產(chǎn)物，通過TLC(1-丁醇∶乙酸∶水，8∶1∶1)和分析HPLC法(在33分鐘時洗脫，同樣條件下天然頭孢氨芐在6.5分鐘洗脫)的測定。質(zhì)譜分析測出預(yù)期的N-Fmoc-頭孢氨芐分子量(M/Z 570.1〔M+H〕+)。(ⅰ)(b)Fmoc-頭孢氨芐的抗菌性能為了測定天然頭孢氨芐和Fmoc-頭孢氨芐的抗菌效能，在處理前和處理后，將含有金黃色葡萄球菌稀釋懸浮液(0.5ml/玻璃試管)的試管在37℃下以及不含或含有濃度遞增的天然頭孢氨芐或Fmoc-頭孢氨芐的條件下保溫6小時，如表Ⅵ所示。在預(yù)定時間點取樣并分析它們抑制金黃色葡萄球菌生長的性能。隨后通過700nm下光譜測出的混濁度增加來評估細菌的生長。
表Ⅵ天然頭孢氨芐和N-Fmoc頭孢氨芐的抗菌活性
(1)數(shù)值是指在試驗中用作參照物的頭孢氨芐的功效保溫是將天然頭孢氨芐或N-Fmoc頭孢氨芐(100μg/mL)在pH7.4下和50mM Hepes緩沖液(含20％DMSO)中進行。
如表Ⅵ所示，N-Fmoc-頭孢氨芐失活(～6％)。將其在6天的周期內(nèi)預(yù)保溫(pH7.4,37℃)可以生成天然頭孢氨芐，這是根據(jù)HPLC的監(jiān)測并通過約50％母體化合物抗菌功效的再生來判斷的。天然頭孢氨芐在保溫下基本上隨時間同時失活，但N-Fmoc-頭孢氨芐在同樣條件下顯然更穩(wěn)定。因此，N-Fmoc-頭孢氨芐在體內(nèi)所具有的預(yù)期延遲作用可能歸因于其在生理pH和溫度下的高度化學(xué)穩(wěn)定性以及不被降解的原因。與母體化合物相比，N-Fmoc-頭孢氨芐對于青霉素酶引發(fā)的水解也更穩(wěn)定(未表示)。(ⅱ)頭孢氨芐-O-Fm酯的制備(頭孢氨芐芴甲酯)(a)N-Boc-頭孢氨芐向冰浴冷卻且攪拌中的含有頭孢氨芐水合物(50mg,0.144mmol)和三乙胺(29mg,0.288mmole)的DCM(3ml)的懸浮液中加入碳酸二叔丁酯(94.2mg,0.432mmole)的DCM(2ml)溶液。將反應(yīng)混合物升至室溫并攪拌過夜，直至由TLC(1-丁醇∶乙酸∶水，8∶1∶1)觀測到的茚三酮陽性起始物質(zhì)不再存在。用DCM(2.5ml)稀釋該反應(yīng)混合物，用酸化的水(pH～2)、水和鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥。濃縮后，產(chǎn)物用石油醚(沸點40-60℃)沉淀，過濾并用石油醚洗滌兩次。通過TLC和HPLC法證實產(chǎn)物是單純的。(b)頭孢氨芐-0-Fm酯在20分鐘內(nèi)，將DCC(23.1mg,0.112mmole)在DCM(1ml)中的溶液滴加到冰浴冷卻且攪拌中的含有N-Boc-頭孢氨芐(25mg,0.056mmole)、9-芴甲醇(22mg,0.112mmole)和4-二甲基氨基吡啶(13.7mg,0.112mmole)的DCM(2ml)溶液中。所得混合物在室溫下攪拌過夜，過濾溶液以除去二環(huán)己基脲。濾液用DCM(2.5ml)稀釋，隨后以1M碳酸氫鈉溶液、10％檸檬酸、水和鹽水提取兩次。無水硫酸鎂干燥。蒸發(fā)該溶液，得到油性固體，將該固體用石油醚研制，得到產(chǎn)物Boc-頭孢氨芐-OFm(由TLC和HPLC驗證)。通過將固體粗產(chǎn)物(25mg)溶于1mlTFA∶DCM(1∶1 v/v)溶液中來脫除Boc基團。室溫下放置20分鐘后，蒸除TFA，將固體殘余物溶解在異丙醇中，隨后將其蒸發(fā)。該過程反復(fù)進行兩次。固體粗產(chǎn)物用石油醚研制，形成最終的純化酯，由TLC和HPLC證實。實施例9二-9-(芴基甲氧基羰基)多粘菌素B〔(Fmoc)2-PMXB〕的制備作為環(huán)肽抗生素類代表物的多粘菌素B可有效抗革蘭氏陰性菌。PMXB含有5個二氨基丁酸殘基，采用反應(yīng)物甲基硫酸4-(9-芴基甲氧基羧基)苯基-二甲基锍(Fmoc-DSP)可以使Fmoc基團插入從而將這些殘基改性。Fmoc-DSP與肽之間的摩爾比例將隨PMXB分子的修飾程度而定。
為了制備(Fmoc)2-PMXB，將碳酸氫鈉(0.1M,0.15ml)溶液滴加到攪拌中的含有PMXB(Sigma,USA,10mg,7.2μmol)和Fmoc-DSP(7.1mg,14.4μmol)的水(1ml)溶液中。逐漸混濁的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。將所得沉淀物離心，用水洗滌，溶于小體積的DMSO中，用乙醚沉淀出白色固體粗產(chǎn)物。
1)數(shù)值是指在試驗中用作參照物的PMXB的功效(2)在pH8.5下和含1％DMSO的0.1M碳酸氫鈉中將PMXB、(Fmoc)2-PMXB(100μg/ml)保溫。(3)在pH7.4下和含1％DMSO的50mM Hepes-緩沖液中將PMXB、(Fmoc)2-PMXB(100μg/ml)保溫。
由采用線性梯度液的分析HPLC(RP-18,250×4mm；Merk)測出，主產(chǎn)物在39分鐘洗脫(PMXB在同樣條件下的保留時間為13.5分鐘)，所述線性梯度液是指在40分鐘內(nèi)從70％溶液A(0.1TFA的水溶液)和30％溶液B(0.1％TFA的乙腈水，75∶25溶液)開始至100％溶液B。將固體粗產(chǎn)物上樣到制備HPLC，得到純產(chǎn)物。用質(zhì)譜分析(Fmoc)2-PMXB(FAB)，得到該化合物預(yù)期的分子量(M/Z,1647〔M-H〕+)。
(Fmoc)2-PMXB和天然PMXB的抗菌功效和在不同試驗條件下進行測定將不含或含有濃度增加的(Fmoc)2-PMXB和天然PMKB的大腸桿菌(E.coli)稀釋懸浮液在37℃下保溫。在預(yù)定時間點時取樣并分析它們阻止大腸桿菌生長的性能。隨后通過700nm下光譜測出的混濁度增加來評估細菌的生長。
如表Ⅶ所示，(Fmoc)2-PMXB失活(～1％)并極易水解回到活性PMXB，在pH8.5和7.4下的t 1/2分別為～3天和～1天。實施例10哌拉西林-芴甲酯(哌拉西林-O-Fm)的制備哌拉西林(4-乙基-2,3-二氧哌嗪羰基氨芐西林)是由青霉素衍生的半合成光譜抗生素，該化合物口服給藥無效。
哌拉西林(游離羧基)是由哌拉西林鈉鹽(Sigma,USA)通過乙酸乙酯的酸性提取來制備。按照上述實施例8所述的頭孢氨芐-OFm酯的制備方法，用1當(dāng)量的羧基與分別為2當(dāng)量的9-芴基甲醇、4-二甲基氨基吡啶和DCC來反應(yīng)，可制得哌拉西林-OFm。固體粗產(chǎn)物在DCM-乙醚中重結(jié)晶，生成純的產(chǎn)物，用TLC和HPLC鑒定。實施例11:Fmoc-普萘洛爾的制備作為β-阻斷劑類型典型成員的普萘洛爾〔1-(異丙基氨基)-3-(萘基氧基)-2-丙醇〕是用作抗高血壓藥、抗心絞痛藥抗心律失常藥的β-腎上腺能拮抗劑。普萘洛爾與β-腎上腺能受體結(jié)合但不失活。與腎上腺能拮抗劑在此類位點上的競爭可以減輕病理性的高血壓狀態(tài)?；颊呖诜邮苋栈A(chǔ)量的普萘洛爾。但是，眾多β腎上腺能拮抗劑本質(zhì)上具有相當(dāng)?shù)挠H水性，因此口服給藥時不能被有效吸收，例如乙酰丁洛爾(acetylbutolol)、athenolol、倍他洛爾、喹酮心安、納多洛爾和索他洛爾。
為制備Fmoc-普萘洛爾，將Fmoc-OSu(170mg,0.50mmol)在DCM(2.5ml)中的溶液在5分鐘內(nèi)滴加到攪拌中的(±)鹽酸普萘洛爾中(50mg,0.17mmol)和三乙胺(34mg,0.34mmol)的二氯甲烷(DCM,2.5ml)溶液中。
室溫攪拌過夜后，反應(yīng)混合物用酸化的水(pH～2)、水和鹽水提取，以無水硫酸鎂干燥。蒸發(fā)溶液，得到固體粗產(chǎn)物，隨后用己烷研制，得到Fmoc-普萘洛爾。產(chǎn)物用TLC(1-丁醇∶乙酸∶水，8∶1∶1)和HPLC檢驗，得到純品(在同樣條件下，普萘洛爾和Fmoc-普萘洛爾的保留時間分別為16分鐘和51分鐘)。質(zhì)譜得到正確的結(jié)果M/Z:482.2[M+H]+。
分析Fmoc-普萘洛爾的β-腎上腺能功效。結(jié)果如圖7所示。在37℃下將新制的大鼠脂肪細胞與異丙腎上腺素(終濃度1μh/ml,4μM)以及指定濃度的普萘洛爾(圓環(huán))、Fmoc-普萘洛爾(實心圓)一起保溫2小時，或?qū)moc-普萘洛爾在37℃和pH8.5*(方形)下保溫7天。隨后按照Shechter,1982公開的方法測定釋放到介質(zhì)內(nèi)的甘油量。IC50是抑制半數(shù)由異丙腎上腺素介導(dǎo)的最大甘油釋放量時的普萘洛爾或N-Fmoc-普萘洛爾衍生物(以μM計)量。
如圖7所示，F(xiàn)moc-普萘洛爾是天然普萘洛爾功效的～7％。Fmoc-普萘洛爾在pH8.5(37℃)下保溫7天后達到天然藥物β-腎上腺能功效的50-70％。該衍生物本質(zhì)上是疏水的，這有助于在胃腸道內(nèi)的吸收。
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權(quán)利要求
1．在生理條件下緩慢水解成為原始活性藥物分子的前藥或其可藥用鹽，其特征在于該前藥中至少一個原始藥物分子的游離氨基、羥基、巰基和/羧基被官能團取代，所述官能團對弱堿敏感并可在弱堿條件脫除。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的前藥，該前藥如下式所示X-Y其中，Y為藥物的組成部分，該部分至少帶有一個選自游離氨基、羧基、羥基和/或巰基的官能團，和X是選自式(ⅰ)-(ⅳ)的基團
其中，R1和R2相同或不同，它們分別為氫、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、鹵素、硝基、磺基、氨基、銨、羧基、PO3H2或OPO3H2；R3和R4相同或不同并且分別為氫、烷基或芳基；同時，當(dāng)X基團與藥物Y的羧基或巰基連接時A為共價鍵，或當(dāng)X與藥物Y的氨基或羥基連接時A為OCO-；以及其可藥用鹽。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的前藥，其中，Y為適用于人體或動物的藥物的組成部分，所述藥物包括抗糖尿病藥、抗生素、合成殺菌劑、鎮(zhèn)痛藥、抗炎藥、抗變態(tài)反應(yīng)藥、抗哮喘藥、抗高膽甾醇藥、β-腎上腺能阻斷劑、抗高血壓藥、抗腫瘤藥以及抗病毒藥。
4．根據(jù)權(quán)利要求2的前藥，其中，Y部分至少被一個由基(ⅰ)組成的X基團取代，基團(ⅰ)中的R1為氫或磺基同時R2、R3和R4為氫。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的前藥，其中Y為胰島素的一部分，其胰島素分子中的游離氨基和/或羧基以及任選的游離羥基至少被一個所述(ⅰ)基團取代。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中一個或多個氨基被9-芴基甲氧基羰基(ⅰ)取代，并且基團(ⅰ)中的R1-R4為氫并且A為OCO-(此后為N-(Fmoc)-胰島素)。
7．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中一個或多個羧基被9-芴甲基羰基(ⅰ)取代，并且基團(ⅰ)中的R1-R4為氫并且A為共價鍵(此后為C-(Fm)-胰島素)。
8．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中的一個或多個氨基被Fmoc基取代，同時，一個或多個羧基被Fm基取代(此后為N-(Fmoc)、C-(Fm)-胰島素)。
9．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中的一個或多個羧基被Fm基取代，同時，一個或多個羥基被Fmoc基取代(此后為C-(Fm)、O-(Fmoc)-胰島素)。
10．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，其中的一個或多個氨基和羥基被Fmoc基取代，同時，一個或多個羧基被Fm基取代(此后為N,O-(Fmoc)、C-(Fm)-胰島素)。
11．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，該衍生物在其GlyA1、PheB1或LysB29上的游離氨基帶有1-3個取代基，其中A和B是胰島素分子鏈，該衍生物選游離GlyA1-N-(Fmoc)-胰島素、PheB1-N-(Fmoc)-胰島素、LysB29-N-(Fmoc)-胰島素、GlyA1,PheB1-N-(Fmoc)2-胰島素、GlyA1,LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素、PheB1,LysB29-N-(Fmoc)2-胰島素、GlyA1,PheB1,LysB29-N-(Fmoc)3-胰島素。
12．根據(jù)權(quán)利要求5的胰島素衍生物，該衍生物在其GlyA1、PheB1或LysB29上的游離氨基帶有1-3個2-磺基-Fmoc取代基(此后為Sulfmoc)，其中A和B是胰島素分子鏈，該衍生物選游離GlyA1-N-(Sulfmoc)-胰島素、PheB1-N-(Sulfmoc)-胰島素、LysB29-N-(Sulfmoc)-胰島素、GlyA1,PheB1-N-(Sulfmoc)2-胰島素、GlyA1,LysB29-N-(Sulfmoc)2-胰島素、PheB1,LysB29-N-(Sulfmoc)2-胰島素、GlyA1,PheB1,LysB29-N-(Sulfmoc)3-胰島素。
13．根據(jù)權(quán)利要求5-12任一項所述的(Fmoc、Sulfmoc或Fm)-胰島素衍生物，其中的胰島素為天然、重組或突變的人、?；蜇i胰島素。
14．一種Fmoc-生長激素，它選自人和牛生長激素。
15．一種Fmoc頭孢氨芐，它選自N-Fmoc-頭孢氨芐和頭孢氨芐芴甲酯。
16．二-(芴基甲氧基羰基)-多粘菌素B。
17．哌拉西林芴甲酯。
18．Fmoc-普萘洛爾。
19．一種藥物組合物，該組合物包括權(quán)利要求1-18任一項所述的前藥或其可藥用鹽和可藥用載體。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求5-13任一項所述的N-(Fmoc)-胰島素。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物，該組合物包含天然或重組的人N-(Fmoc)3-胰島素和/或天然和/或重組的人N-(Fmoc)2-胰島素。
22．根據(jù)權(quán)利要求19-21任一項所述的藥物組合物，該組合物用于皮下注射、經(jīng)皮或口服給藥。
23．根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項所述組合物在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
24．一種治療糖尿病的方法，該方法包括給糖尿病患者施用有效量的一種或多種如權(quán)利要求5-13任一項所述的胰島素衍生物。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中以5-8天的間隔期給患者施用有效劑量的N-(Fmoc)2-胰島素和N-(Fmoc)3-胰島素。
26．根據(jù)權(quán)利要求24或25的方法，其中的N-(Fmoc)-胰島素通過皮下注射給藥。
27．根據(jù)權(quán)利要求24-26特任一項所述的方法，該方法進一步包括胰島素的每日注射給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及帶有弱堿敏感官能團并且可在生理條件下緩慢水解為原始活性藥物分子的前藥及其可藥用鹽。所述前藥優(yōu)選為式X－Y，其中Y為藥物的組成部分，該部分至少帶有一個選自游離氨基、羧基、羥基和/或巰基的官能團；同時，X是選自式(i)－(iv)的基團，其中R
文檔編號A61P37/00GK1227501SQ97197122
公開日1999年9月1日 申請日期1997年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月7日
發(fā)明者M·弗里德金, Y·謝赫特, E·格肖努韋 申請人:耶達研究及發(fā)展有限公司