專(zhuān)利名稱(chēng)：一種vegf165類(lèi)似物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165突變體與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域涉及DNA重組技術(shù)，藥物蛋白與HSA的融合使得藥物成為長(zhǎng)效藥物。
背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異絲裂原，1989年由!^errara等在牛垂體濾泡星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化出來(lái)的，具有細(xì)胞質(zhì)的鈣聚集作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透性，血管保護(hù)等生物學(xué)作用。人的VEGF基因位于染色體的6p21. 3，編碼VEGF的基因長(zhǎng)141Λ，由8個(gè)外顯子和 7個(gè)內(nèi)含子交替組成，分子量35 45kD。VEGF根據(jù)VEGFmRNA剪接方式不同分為多個(gè)變構(gòu)體，有 VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚體的形式存在，糖基化的VEGF165 二聚體相對(duì)分子質(zhì)量約為45000，非糖基化的相對(duì)分子質(zhì)量約為43000。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF16Q是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的腫瘤血管形成促進(jìn)劑之一，具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能，在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。VEGF165在體內(nèi)的半衰期比較短，大約為90分鐘。容易受到體內(nèi)纖溶酶和其他蛋白酶的作用而降解。VEGF165在血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、相關(guān)科學(xué)研究有著廣泛的應(yīng)用，并且在傷口愈合及冠心病的治療上顯示了廣闊的前景。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血漿中的主要蛋白成分，它除了具有維持血漿滲透壓功能以外，還能擔(dān)當(dāng)許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，從而調(diào)節(jié)激素活性，所載物質(zhì)的毒性，以及藥物的利用度。成熟的HSA有585個(gè)氨基酸殘基組成，含有17對(duì)二硫鍵，分子量約為66. 5KDa，如此大的分子量減小了它在內(nèi)循環(huán)時(shí)經(jīng)腎排泄的量，再正常情況下，不易被腎小球慮過(guò)，血漿半衰期在20天左右。同時(shí)，HSA在人體內(nèi)沒(méi)有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是一種理想的生物活性蛋白載體。針對(duì)VEGF165的缺陷和HSA的優(yōu)點(diǎn)，我們通過(guò)對(duì)VEGF165的結(jié)構(gòu)特征分析，設(shè)計(jì)了高活性且穩(wěn)定的VEGF165類(lèi)似物，實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達(dá)和制備。結(jié)合白蛋白融合技術(shù)，獲得高度穩(wěn)定的VEGF165類(lèi)似物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)內(nèi)容是提供hVEGF165突變體與HSA生理特性于一體的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，該融合蛋白在保持了人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165 生理特性的基礎(chǔ)上，增加了作用位點(diǎn)，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，改善了溶解度，具有優(yōu)良的藥學(xué)特性。本發(fā)明的技術(shù)方案在前期的研究中本實(shí)驗(yàn)室保藏了重組質(zhì)粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質(zhì)粒。我們對(duì)VEGF165的纖溶酶位點(diǎn)進(jìn)行突變，這樣使得VEGF165的體內(nèi)的穩(wěn)定性大大增加。再利用HSA高度穩(wěn)定的特性，將突變的VEGF165與白蛋白進(jìn)行融合，得到的VEGF165與白蛋白的融合分子在保持VEGF165生物學(xué)活性的同時(shí)具有高度的穩(wěn)定性。這將使得該產(chǎn)品在細(xì)胞培養(yǎng)以及冠心病藥物的開(kāi)發(fā)上具有目前市場(chǎng)產(chǎn)品不可比擬的優(yōu)越性。本發(fā)明hVEGF165和HSA之間不加任何連接肽，可以避免因連接肽的加入而帶來(lái)的融合蛋白穩(wěn)定性和免疫源性方面的問(wèn)題。本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供表達(dá)該融合蛋白編碼區(qū)的宿主和攜帶該融合蛋白編碼區(qū)的重組表達(dá)載體。表達(dá)融合蛋白的宿主可以是細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。表達(dá)出來(lái)的融合蛋白可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)；分泌所用的信號(hào)肽可以是大然的人血清白蛋白的信號(hào)肽，也可以是釀酒酵母阿爾法交配因子的信號(hào)肽，或者這兩種信號(hào)肽的類(lèi)似物；目的基因可以被整合到宿主的染色體中，也可以插入到質(zhì)粒中。本發(fā)明優(yōu)選的宿主系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是GS115和X33。這種表達(dá)系統(tǒng)除了具備原核表達(dá)系統(tǒng)的易操作、生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、易工業(yè)放大的特點(diǎn)外，還具有真核細(xì)胞的蛋白后修飾系統(tǒng)，有利于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組蛋白。與宿主對(duì)應(yīng)的表達(dá)載體大多可以購(gòu)買(mǎi)商品化的，如畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的載體，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞內(nèi)型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。優(yōu)選的是畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有纖氨酸缺陷型的選擇性標(biāo)記基因HIS4、AOXl啟動(dòng)子、MFa分泌信號(hào)肽和G418抗性基因等元件。AOXl (醇氧化酶操縱子)5’序列、3’序列用于方便編碼基因整合至酵母基因組和控制編碼基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化帶有融合cDNA的表達(dá)載體到宿主細(xì)胞中，可以用鋰鹽法、PEG法、原生質(zhì)體法、電穿孔法或化學(xué)轉(zhuǎn)化等方法。轉(zhuǎn)化之后，可以用多種方法鑒定是否成功，如提取基因組 DNA進(jìn)行PCR鑒定，或者對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白進(jìn)行HSA抗體和hVEGF165多抗檢測(cè)。生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白可以通過(guò)培養(yǎng)帶有本發(fā)明構(gòu)件的DNA的宿主系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行， 具體的培養(yǎng)方法可以用搖瓶或生物反應(yīng)器。培養(yǎng)分為兩個(gè)階段宿主系統(tǒng)生長(zhǎng)階段和融合蛋白合成階段。之后可以用各種蛋白分離的方法自含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離純化融合蛋白，包括鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。


圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-HSA-hVEGF165物理圖譜圖2 重疊PCR獲得VEGF165的突變體1 重疊PCR獲得的VEGF165突變片段圖3 :融合蛋白的SDS-PAGE分析M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1-12為GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165的發(fā)酵液上清具體實(shí)施方法一、實(shí)驗(yàn)材料JM109 空菌、DH5a/pPIC9K、畢赤酵母 GS115(his4Mut+)、PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pyrobest DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、DNA Ladder Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司代為合成；所有測(cè)序服務(wù)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。二、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1 :pPIC9K-HSA-VEGF165mut畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。以PIC9K-hVEGF165為模板，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增出hVEGF165突變體基因(圖2)，用 2.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，回收500bp左右的片斷，用Bsu361I、NotI對(duì)回收片斷和pBluescript-HSA質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接再轉(zhuǎn)化到新鮮制作的JM109感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證。陽(yáng)性重組子提取質(zhì)粒再通過(guò)EcoRI/NotI雙酶切獲得片斷插入到pPIC9K對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，獲得正確的pPIC9K-HSA-VEGF165mut畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒(圖 1)，并通過(guò)EcoRI/NotI雙酶切及測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)施例2 重組酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及融合蛋白的表達(dá)；活化并過(guò)夜培養(yǎng)JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut，提取的質(zhì)粒，經(jīng)Mil線(xiàn)性化， 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，轉(zhuǎn)化物涂布與含0. 25mg/ml G418的MD平板上，30°C培養(yǎng)72小時(shí)，挑取所有的長(zhǎng)出的菌落到含0. 5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2_3大。挑取長(zhǎng)勢(shì)好的菌落到20ml液體YPD培養(yǎng)基中，30°C過(guò)夜培養(yǎng)，提取GSl 15全基因組DNA，PCR 鑒定出陽(yáng)性重組子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，凍存于-80°C，命名為GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165。將GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut 接種到裝有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生物素；3%甘油)的 250ml 三角瓶中，215rpm，30C培養(yǎng) 24-36 小時(shí)，冷凍沉降菌體，棄去上清，加入25ml BMMY(1 OOmM磷酸鉀，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4X10_5% 生物素；2. 5%甲醇)。每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，誘導(dǎo)3天。SDS-PAGE檢測(cè)重組融合蛋白的表達(dá)情況采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色 (圖幻。挑選表達(dá)量較高的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集離心得上清，上清液經(jīng)IOkDa分子截留量的膜超濾濃縮，再經(jīng)Blue-S印harose層析分離，IM精氨酸洗脫獲得較純的HSA_hVEGF165融合蛋白。
權(quán)利要求
1.hVEGF165纖溶酶酶切位點(diǎn)突變體與人血清白蛋白的融合蛋白。
2.人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165突變體與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是hVEGF165與人血清白蛋白融合基因，中間不加任何連接肽對(duì)應(yīng)的核苷酸序列；得到的 HSA-hVEGF165mut融合基因插入到克隆載體，轉(zhuǎn)化到宿主系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，融合基因被整合到宿主的染色體中。
3.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165至少95%序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少95%序列同源的第二區(qū)。
4.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是所述的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165氨基酸殘基序列相同的第一區(qū)和與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第二區(qū)，或上述兩區(qū)的功能等同物。
5.權(quán)力要求4所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是 所述的功能等同物是在不改變所述的融合蛋白特性的前提下，對(duì)融合蛋白的個(gè)別氨基酸的殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
6.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是提供攜帶編碼融合蛋白的基因序列的重組表達(dá)載體，pPIC9K-HSA-hVEGF165。
7.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是表達(dá)融合蛋白的宿主優(yōu)選是酵母，酵母中優(yōu)選畢赤酵母，畢赤酵母中優(yōu)選是GS115， X-33。
8.權(quán)力要求1、2和3所述的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165與人血清白蛋白的融合蛋白在替代hVEGF165的應(yīng)用。
全文摘要
人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(hVEGF165)突變體與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制備技術(shù)的發(fā)明屬于長(zhǎng)效重組融合蛋白技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的融合蛋白包括與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165至少85％序列同源的第一區(qū)和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區(qū)。利用重疊PCR的方法獲得VEGF165的突變體，利用限制性酶切連接的方法將hVEGF165與HSA拼接，中間不加入任何連接肽。該融合蛋白可以在不改變?nèi)诤系鞍滋匦缘那疤嵯?，進(jìn)行個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或加入，它們?cè)诒Ａ袅薶VEGF165活性的基礎(chǔ)上，可望顯著延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期，是藥學(xué)領(lǐng)域中，能夠替代hVEGF165的，有良好前景的藥用融合蛋白。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102212140SQ20111008130
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者儲(chǔ)敏, 周曉晶, 朱瑞宇, 李琪, 臧嫻, 辛鑫, 金堅(jiān), 陳蓉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)