專利名稱：得自微藻的強免疫剌激劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從食品級微藻(microalgae)提取免疫刺激性多糖制品的方法。其還涉及由食品級微藻分離的結構復雜的免疫激活性水溶性多糖制品的鑒定，該制品中含有表觀分子量約2百萬道爾頓的活性多糖。其還涉及用本發(fā)明的制品治療和/或預防多種病癥的方法。
背景技術：
在過去的30多年中，通過使用調節(jié)免疫反應的治療方案，免疫治療已成為治療人類疾病和病癥的重要手段。在免疫系統(tǒng)受到危害的病癥中，這是特別重要的。在疾病模型和臨床試驗中進行的研究表明增強宿主防御機理在治療和預防微生物感染、免疫缺陷、癌癥和自身免疫性疾病(1-5)中是有利的。免疫提高方案還可以用來促進傷口愈合。在傷口愈合過程中，巨噬細胞通過調節(jié)細胞增殖和新組織形成/再生而發(fā)揮主要作用。它們還作為吞噬細胞、清創(chuàng)劑，并產生生長因子，影響傷口修復的血管生成階段(6)。
從歷史方面來看，開發(fā)的第一種免疫刺激劑是細菌產物(溶菌產物和粗餾分)、減毒微生物或熱滅活的細菌。其中包括試劑如卡介苗(BCG)、粉刺丙酸菌和脂多糖(1，2)。雖然，由于其毒性和副作用，這些制品取得了有限的成功，但是其中很多已被USDA批準用于獸醫(yī)中的免疫調節(jié)(3)。由多種來源研發(fā)出其它物質，包括天然來源的、化學合成的或者用重組技術合成的。天然來源的大多數(shù)免疫刺激劑是高分子量多糖、糖蛋白或復合肽(1)。例如，由群交裂褶菌(Schizophyllum commune)(schizophyllan)、埃杜香菇(Lentinus edodes)(lentinan)和雜色革蓋菌(Coriolus versicolor)(krestin)得到的三種真菌多糖目前在日本作為生物反應調節(jié)劑用于臨床(4)。另外一種多糖acemannan(分離自庫拉索蘆薈)被美國農業(yè)部批準用于治療狗和貓的纖維肉瘤(7)。得自天然產物的小分子量免疫刺激劑很少，如鞘糖脂KRN-7000。用KRN-7000作為免疫刺激劑治療實體瘤的臨床試驗目前正在進行中(8)。合成來源的若干免疫刺激劑也得以開發(fā)，包括異丙肌苷和胞壁酰肽等化合物(2)。最近用重組技術已開發(fā)了一些內源性的其它免疫調節(jié)劑，它們已獲得FDA批準。這些制品包括集落刺激因子、干擾素和重組蛋白(5)。但是，這些化合物常常是半衰期短，且難以確定最佳劑量和適當?shù)穆?lián)合用藥。
雖然目前的免疫刺激劑很有前景，但是仍需要開發(fā)更強的制品并增加免疫治療用藥物的供應?？梢杂糜趯ふ颐庖叽碳┧幬锏牟煌瘜W性質的化合物的一個來源，是天然產物。幾個世紀以來，天然產物已用作治療用制品，其中很多還用于今天的臨床中。天然產物作為開發(fā)藥物的一種途徑，是基于它們空前的分子多樣性和廣泛的生物活性(9)。
在古代，微藻已被用做營養(yǎng)品。據歷史記載，在非洲Lake Chad附近的部落以及墨西哥Lake Texcoco周圍生活的阿茲特克人食用微藻如鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)(10)。在最近的幾十年中，人們對于人用和作為家畜飼料的食品級微藻的商業(yè)生產越來越感興趣。因其商業(yè)潛力已被開發(fā)的多種微藻中，螺旋藻(Spirulina)類、小球藻(Chlorella)類和水華束絲藻(Aphanizomenon flos-aquae)(AFA)是三種主要的類型，它們已被成功開發(fā)，并廣泛應用。
對于食品級微藻的消費的一般性報告和最近的研究，表明其提高了動物和人的免疫功能。已證明口服蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)與感染單核細胞增生利斯特氏菌的小鼠中天然殺傷細胞活性增強(11)和粒細胞-巨噬細胞祖細胞增多(12)相關。食用的鈍頂螺旋藻增加了小雞中巨噬細胞吞噬活性(13)，而螺旋藻屬梭形菌屬(fusiformis)給人帶來了化學保護作用(14)。已報告人食用AFA后使免疫細胞運輸產生變化，并使免疫監(jiān)視功能提高(15)。所有這些作用中的活性成分還沒有明確。
本文中研究了從微藻中分離出的多種化合物。確定得自小球藻和鈍頂螺旋藻的一些多糖和糖蛋白的抗腫瘤、抗病毒和免疫刺激活性。相反，從AFA中沒有分離出顯示出任何生物活性的化合物。
從小球藻中已分離出多種具有生物活性的化合物。在美國專利No.4,533,548中從蛋白核小球藻分離出具有抗腫瘤和抗病毒活性的酸性多糖(16)。此多糖的糖基組成大部分是鼠李糖，其中帶有少量的半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸。在美國專利4831020中報告的從海洋小球藻minutissima中分離的另一種多糖，似乎具有抑制腫瘤生長的作用。但是，其中沒有有關分子量或糖基組分的報告(17)。
在美國專利4,786,496中，海洋小球藻類的脂餾分(糖脂部分)顯示了抗腫瘤性質(18)。從小球藻中也分離出了若干糖蛋白。例如，美國專利4,822,612報告了45,000道爾頓的糖蛋白，其具有抗癌作用(19)。在科學文獻中還已報告了多種其它糖蛋白(20-23)和甘油基糖脂(24)，它們可能具有提高免疫力和抗腫瘤性質。這些化合物都不是多糖。
從鈍頂螺旋藻類中已分離出若干不同類型的具有生物活性的多糖。例如，硫酸化多糖鈣spirulan抑制腫瘤侵入和轉移(25)。鈣spirulan(分子量74,600道爾頓)由鼠李糖(52.3％)、3-O-甲基鼠李糖(32.5％)、2，3-二-O-甲基鼠李糖(4.4％)、3-O-甲基木糖(4.8％)、糖醛酸(16.5％)和硫酸鹽組成(26)。
美國專利5,585,365公開了分子量250,000至300,000道爾頓的抗病毒多糖，其是用熱水提取自鈍頂螺旋藻類(27)。此多糖由鼠李糖，葡萄糖，果糖，核糖，半乳糖，木糖，甘露糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸組成。最近從鈍頂螺旋藻類中分離出了一些其它低分子量多糖，它們的分子量為12,600至60,000道爾頓(28-30)。
確定免疫刺激活性的一個途經是使用巨噬細胞參與的生物試驗。單核細胞/巨噬細胞發(fā)現(xiàn)于體內的各種組織中，它們在協(xié)調免疫反應和一些生物過程中是非常重要的(31)。在吞噬作用、免疫監(jiān)視、傷口愈合、殺死微生物和腫瘤細胞以及將抗原呈遞給T淋巴細胞中扮演重要角色(32)。在癌癥中，巨噬細胞通過產生細胞因子和其它免疫因子介導腫瘤細胞毒性功能(33)。為了巨噬細胞在后天和先天免疫性中扮演重要角色，它們必須對環(huán)境試劑產生有效的反應，首先被激活(34)。巨噬細胞活化是通過促炎性轉錄因子如核因子κB(NF-κB)。此類轉錄因子再控制和調節(jié)介導多種免疫反應的基因組的活化/抑制。
在沒有接受刺激的巨噬細胞中，NF-κB以失活的異二聚體的形式存在，其被胞質溶膠中的抑制性-κB(I-κB)蛋白封閉。引起I-κB蛋白分離并降解的試劑，使NF-κB二聚體轉運至細胞核，在此它們可以激活下游基因的轉錄(35)。NF-κB調節(jié)的靶基因包括促炎性細胞因子、趨化因子、炎性酶、粘附分子和報告分子(36)。
在本發(fā)明中，用基于轉錄因子的試驗檢測人單核細胞中的NF-κB，來指導得自食品級微藻的免疫刺激性多糖制品的提取、分離、定性和開發(fā)。本發(fā)明的多糖與目前提供的幾乎所有的其它多糖不同，它們是水溶性的，且在含水乙醇溶液中也是可溶的。
發(fā)明概述從水華束絲藻(AFA)、蛋白核小球藻和鈍頂螺旋藻中分離出了具有巨噬細胞免疫刺激活性并含有具有表觀分子量約2百萬道爾頓的活性多糖的新的水溶性多糖制品。本發(fā)明的多糖制品與目前用于臨床進行癌癥患者的免疫治療的多糖制品相比，對于單核細胞的激活來說活性至少高出1000倍。
按照本發(fā)明的一個實施方案，從微藻中分離含有多糖的免疫刺激制品，其中所述多糖可以用含有水或者含有水和至少一種低級烷基醇的混合物的溶劑提取，其中所述低級烷基醇的烷基部分具有1至4個碳原子，且其中所述活性多糖表觀分子量約2百萬道爾頓以上。按照另一實施方案，免疫刺激制品的免疫刺激活性表現(xiàn)為單核細胞/巨噬細胞的活化。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品由微藻水華束絲藻提取。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品由微藻蛋白核小球藻提取。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品由微藻鈍頂螺旋藻提取。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基組分基本上由甘露糖，葡萄糖，鼠李糖，半乳糖，巖藻糖，甲基化的糖和N-乙?；被墙M成。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基組分基本上由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖，葡萄糖和甲基化的糖組成。按照另一個實施方案，所述免疫刺激制品的活性多糖的糖基組分基本上由鼠李糖，葡萄糖醛酸，巖藻糖，半乳糖和甲基化的糖組成。按照另一個實施方案，一種藥物組合物含有任何一種上述免疫刺激制品和藥用載體或賦形劑。按照另一個實施方案，一種食品增補劑含有任何一種上述免疫刺激制品和食品增補劑可接受的載體或賦形劑。
按照另一個實施方案，一種給需要治療的個體提高免疫功能的方法，包括給所述個體使用有效量的藥物組合物或食品增補劑。按照另一個實施方案，所述個體患有病毒，細菌或真菌感染。按照另一個實施方案，所述個體患有癌癥。按照另一個實施方案，所述個體患有免疫缺陷。按照另一個實施方案，所述個體是人。按照另一個實施方案，所述個體是動物。
按照另一個實施方案，一種從富含免疫刺激多糖的食品級微藻獲得制品的方法，該方法包括以下步驟(a)用含有水或水和至少一種低級烷基醇的混合物的溶劑提取此微藻制備提取物，所述烷基醇的烷基部分含1至4個碳原子，其中所述混合物的醇濃度為0-100％(體積)，提取溫度為約4℃至100℃；(b)任選地將此提取物濃縮至較小的體積，其中體積大時才需要濃縮步驟；(c)通過沉淀手段將多糖制品從該提取物中沉淀出來；(d)通過分離手段分離沉淀的多糖制品；及(e)用95％乙醇洗滌(d)的沉淀物。按照另一個實施方案，為從富含免疫刺激多糖的食品級微藻中獲得制品，在提取過程中所用的醇是乙醇。按照另一個實施方案，為從富含免疫刺激多糖的食品級微藻中獲得制品，在提取過程中所用的醇是甲醇。按照另一個實施方案，為從富含免疫刺激多糖的食品級微藻中獲得制品，在提取過程中所用的醇是異丙醇或丙醇。按照另一個實施方案，在步驟(a)中優(yōu)選的醇濃度是20-80％。按照另一個實施方案，提取的優(yōu)選溫度是40至80℃。按照另一個實施方案，該方法用來從水華束絲藻中獲得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一個實施方案，該方法用來從蛋白核小球藻中獲得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一個實施方案，該方法用來從鈍頂螺旋藻中獲得富含免疫刺激多糖的制品。按照另一個實施方案，濃縮步驟(b)通過蒸發(fā)溶劑進行(當需要時)，優(yōu)選在減壓下濃縮。按照另一個實施方案，濃縮步驟(b)通過凍干進行(當需要時)。按照另一個實施方案，濃縮步驟(b)通過透析進行(當需要時)。按照另一個實施方案，該多糖制品步驟(c)中的沉淀通過加入乙醇至最終濃度約80％乙醇來進行。按照另一個實施方案，該多糖制品步驟(c)中的沉淀通過冷卻此提取物進行。按照另一個實施方案，該多糖制品步驟(c)中的沉淀通過加入某種鹽進行。按照另一個實施方案，此鹽是硫酸銨。按照另一個實施方案，在步驟(d)中沉淀的多糖制品的分離通過過濾進行。按照另一個實施方案，在步驟(d)中沉淀的多糖制品的分離通過離心進行。按照另一個實施方案，在步驟(e)中沉淀的多糖制品的洗滌用95％乙醇進行。按照另一個實施方案，該方法進一步包括通過將此沉淀溶解于水中并通過超濾基本上除去分子量小于約100,000道爾頓的所有組分，進行純化。按照另一個實施方案，該方法進一步包括通過將此沉淀溶解于水中并通過大小排阻層析基本上除去分子量小于約2百萬道爾頓的所有組分，進行純化。
按照另一個實施方案，為刺激個體的單核細胞/巨噬細胞的活性用免疫刺激多糖制品治療個體的方法，該方法包括給該個體使用有效量的提取自食品級微藻的多糖制品以及可接受的載體。按照另一個實施方案，使用該免疫刺激多糖制品以促進傷口愈合。按照另一個實施方案，使用該免疫刺激多糖制品以治療癌癥。按照另一個實施方案，使用該免疫刺激多糖制品以治療免疫缺陷。按照另一個實施方案，使用該免疫刺激多糖制品以治療病毒、細菌或真菌感染。按照另一個實施方案，所述個體是人。按照另一個實施方案，所述個體是動物。按照另一個實施方案，為刺激個體的單核細胞/巨噬細胞的活性用免疫刺激多糖制品治療個體的方法，該方法包括給該個體使用有效量的提取自水華束絲藻的多糖制品以及可接受的載體。按照另一個實施方案，為刺激個體的單核細胞/巨噬細胞的活性用免疫刺激多糖制品治療個體的方法，該方法包括給該個體使用有效量的提取自蛋白核小球藻的多糖制品。按照另一個實施方案，為刺激個體的單核細胞/巨噬細胞的活性用免疫刺激多糖制品治療個體的方法，該方法包括給該個體使用有效量的提取自鈍頂螺旋藻的多糖制品。
附圖簡述

圖1.多糖制品NP16847(實施例1)的大小排阻HPLC層析圖，注射量為75μL，濃度為500μg/mL。
圖2.多糖制品NP16848(實施例2)的大小排阻HPLC層析圖，注射量為200μL，濃度為125μg/mL。
圖3.多糖制品NP16846(實施例3)的大小排阻HPLC層析圖，注射量為200μL，濃度為35μg/mL。
圖4.微藻多糖制品NP16847、NP16848和NP16846促進促炎性細胞因子mRNA的產生。在THP-1細胞中在2小時時，得到IL-1mRNA、TNF-αmRNA和GAPDH mRNA的RT-PCR的結果對照，細菌LPS，10μg/mL，(1)多糖制品NP16847，0.5μg/mL，(2)多糖制品NP16846，0.5μg/mL，及(3)多糖制品NP16848，0.5μg/mL。
圖5.流程圖，其顯示在40℃熱水提取，接著用70％乙醇沉淀除去藻藍蛋白物質的方案(實施例4)。
圖6.流程圖，其顯示在40℃熱水提取，接著用硫酸銨沉淀除去藻藍蛋白物質的方案(實施例5)。
圖7.流程圖，其顯示在70℃用熱水提取的方案(實施例6)。
圖8.流程圖，其顯示在40℃用70％乙醇提取，不用丁醇萃取的方案(實施例7)。
圖9.流程圖，其顯示在40℃用70％乙醇提取，接著直接用乙醇沉淀的方案(實施例8)。
圖10.流程圖，其顯示在40℃用70％乙醇提取，接著直接用80％乙醇沉淀的方案(實施例9)。
圖11.用50％乙醇/60℃的最佳提取條件獲得的NP16847制品，在超濾前后的SEC HPLC分析(實施例24)。
發(fā)明詳述用檢測THP-1人單核細胞/巨噬細胞中NF-κB活化的基于轉錄因子的生物試驗，指導免疫刺激多糖的純化以及它們提取的最佳方法。此試驗檢測的免疫刺激活性，以NF-κB導致的熒光素酶報告分子表達的增加來表示。在37℃，5％二氧化碳和95％空氣下，將THP-1人單核細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，其中添加了小牛血清(10％v/v)和丁胺卡那霉素(60mg/L)。將活躍生長的細胞用DEAE-葡聚糖(10μg/1×106細胞)和pBIIXLUC報告分子質粒(1μg/1×106細胞)進行短暫的轉染。此質粒得自Dr.Riccardo Dalla-Favera，其中含有得自HIV/IgK的兩個拷貝的NF-κB基元(37)。將含有THP-1細胞的轉染溶液在37℃水浴中孵育7分鐘。然后，將轉染后的細胞再懸浮于10％FBS、RPMI 1640培養(yǎng)基中并以每孔2×105的密度置于96孔板中。24小時后，將微藻提取物、餾分和多糖制品加入到轉染細胞中。收集細胞，并在加入樣品后4小時檢測熒光素酶活性。用Packard過濾板收集細胞并用30μL的熒光素酶混合物(1∶1，LucLiteTM熒光素酶1×PBS，1mM Ca和Mg)。LucLiteTM熒光素酶報告分子基因檢測試劑盒購自Packard(Downers Grove，IL)。用Packard微量板閃爍計數(shù)器以單光子方式檢測光發(fā)射。以相對于用作陽性對照的10μg/mL LPS(E.coli，血清型026B6，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)產生的對NF-κB的最大激活的百分率報告激活作用。
由The University of Georgia，Complex Carbohydrate Research Center進行糖基組分和糖基鍵分析。用TMS-甲基糖苷的GC-質譜分析測定糖基組成。為了確定在TMS-甲基糖苷方法中檢測的O-甲基化的糖，還用糖醇乙酸酯方法測定糖基組分(38)。用Hakomori方法進行糖基鍵分析(39)，同時進行羧基-還原以檢測糖醛酸連接(40)。
實施例1-表現(xiàn)出強單核細胞激活性質的得自AFA的高分子量多糖制品(NP16847)的粗分離得自AFA的粗提物(Lot No.0110FA，得自Cell Tech，Klaath Falls，OR)，通過用70％乙醇在40℃提取凍干物(125g)三次(各4小時)來制備。此粗提物EC50值為10μg/mL。將含水乙醇提取物蒸發(fā)至干，然后在水和氯仿(1∶1)之間進行溶劑分配。只在水層中發(fā)現(xiàn)活性，將其進一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。將活性更強的水層(EC50＝0.5μg/mL)在-80℃進行24小時的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。將此沉淀物質稱為超濾前制品，其EC50值為0.2μg/mL，且就AFA干重而言回收率為3％。再將此物質通過超濾裝置，該裝置具有截留分子量為100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。將滲余物依次用3％KCl(w/v)洗滌幾次以除去粘附(也許是通過離子相互作用)至大分子量物質上的不純物。此滲余物，稱為超濾后物質，EC50值為0.1μg/mL，回收率為0.6％。
用比色檢測法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，評估超濾后NP16847制品的糖類含量為90％至100％。以此推斷此物質是多糖制品。由Galbraith Laboratories，Inc.(Knoxville，TN)進行元素分析，表明該物質含有下列元素49.1％C，40.8％O，7.62％H，2.46％N以及痕量的S。超濾后物質的糖基組分和連接分析見表1。NP16847主要由甘露糖，葡萄糖，4-甲基甘露糖，鼠李糖和甲基化的糖殘基以及其它單糖和乙酰基化氨基糖組成。這第一次報告了從AFA中分離的表現(xiàn)出任何類型的生物活性的多糖。
超濾后物質NP16847用大小排阻層析(SEC)進行分析。該套裝置由Model 600E系統(tǒng)控制器、UK6注射器、Model 600溶劑傳輸系統(tǒng)、Model401示差折射計和Model 3396A Hewlett-Packard積分儀組成。以流速1mL/分鐘，用HPLC級水和Shodex Ohpak KB-805 SEC柱(300mm長×8mm ID)，保持30℃，進行分析。此柱能夠分離估計分子量至4百萬道爾頓的分子。對超濾后的NP16847進行分析顯示了在外水體積中洗脫的一個峰(圖1)，與葡聚糖標準物比較，其滯留時間與表觀分子量超過2百萬道爾頓一致。
實施例1描述的分離純化AFA多糖的方法是新的，因為其初步提取用70％乙醇，而現(xiàn)有技術的方法用熱水。為了確定該方法是否可以用作從其它食品級微藻中提取免疫刺激多糖的一般方法，將實施例1描述的方法用于其它兩種微藻，它們常作為食品增補劑，即蛋白核小球藻和鈍頂螺旋藻。
實施例2-表現(xiàn)出強單核細胞激活性質的得自蛋白核小球藻的高分子量多糖制品(NP16848)的粗分離得自蛋白核小球藻的粗提物(Lot No.VP0978得自Sun Chlorella，Torrance，CA)，通過用70％乙醇在40℃提取凍干物(35g)三次(各4小時)來制備。此粗提物EC50值為25μg/mL。將含水乙醇提取物蒸發(fā)至干，然后在水和氯仿(1∶1)之間進行溶劑分配。只在水層中發(fā)現(xiàn)活性，將其進一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。將活性更強的水層在-80℃進行24小時的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。再將此物質通過超濾裝置，該裝置具有截留分子量為100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。將滲余物依次用3％KCl(w/v)洗滌幾次以除去粘附(也許是通過離子相互作用)至大分子量物質上的不純物。超濾后物質EC50值為0.3μg/mL，回收率為0.2％。
用比色檢測法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，評估超濾后NP16848制品的糖類含量為90％至100％。以此推斷此物質是多糖制品。超濾后物質的糖基組分和連接分析見表2。NP16848主要由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和甲基化的糖殘基以及其它單糖和乙?；被墙M成。雖然文獻中已報告了得自小球藻屬多個種類的其它免疫刺激多糖和水溶性制品，但是NP16848是新的組合物。
超濾后物質NP16848用實施例1中描述的HPLC大小排阻層析方法進行分析，發(fā)現(xiàn)了在外水體積中洗脫的一個峰(圖2)，與葡聚糖標準物比較，其滯留時間與表觀分子量超過2百萬道爾頓一致。
實施例3-表現(xiàn)出強單核細胞激活性質的得自鈍頂螺旋藻的高分子量多糖制品(NP16846)的粗分離得自螺旋藻屬的粗提物(Lot No.B16933得自Triarco Industries，Wayne，NJ)，通過用70％乙醇在40℃提取凍干物(35g)三次(各4小時)來制備。此粗提物EC50值為50μg/mL。將含水乙醇提取物蒸發(fā)至干，然后在水和氯仿(1∶1)之間進行溶劑分配。只在水層中發(fā)現(xiàn)活性，將其進一步在正丁醇中分配(水∶正丁醇，63∶37)。將活性更強的水層在-80℃進行24小時的醇沉淀(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)。再將此物質通過超濾裝置，該裝置具有截留分子量為100,000的聚醚砜膜(Centricon Plus-20得自Millipore，Bedford，MA)。將滲余物依次用3％KCl(w/v)洗滌幾次以除去粘附(也許是通過離子相互作用)至大分子量物質上的不純物。超濾后物質EC50值為0.3μg/mL，回收率為0.1％。
用比色檢測法(41)用酚-硫酸在450nm和490nm下，評估超濾后螺旋藻屬制品的糖類含量為90％至100％。以此推斷此物質是多糖制品。超濾后物質的糖基組分和連接分析見表3。NP16846主要由鼠李糖，葡萄糖醛酸，巖藻糖，半乳糖和甲基化的糖殘基以及其它單糖、糖醛酸及乙?；被墙M成。文獻中已報告了得自螺旋藻屬多個種類的具有類似糖基組分的其它多糖，但是粒徑遠比NP16846小。
超濾后物質NP16846用實施例1中描述的HPLC大小排阻層析方法進行分析，發(fā)現(xiàn)了在外水體積中洗脫的一個峰(圖3)，與葡聚糖標準物比較，其滯留時間與表觀分子量超過2百萬道爾頓一致。
單核細胞/巨噬細胞的活化檢測促炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的信使RNA水平，以確定微藻多糖制品對THF-1單核細胞/巨噬細胞的激活。作為對照，還檢測GAPDH的mRNA水平，以確定IL-1β和TNF-αmRNA水平的特異性變化。由于GAPDH是管家基因，mRNA水平預計應保持恒定，除非人為地引起變化。
IL-1β、TNF-α和GAPDH的RT-PCR引物購自Integrated DNAtechnologies，Inc.(Coralville，1A)。引物的序列描述于Su等的文獻(42)中。L-1β正向引物(5′-ATG-GCA-GAA-GTA-CCT-AAG-CTC-GC-3′)；IL-1β反向引物(5′-ACA-CAA-ATT-GCA-TGG-TGA-AGT-CAG-TT-3′)；TNF-α正向引物(5′-GAG-TGA-CAA-GCC-TGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC3′)；TNF-α反向引物(5′-GCA-ATG-ATC-CCA-AAG-TAG-ACC-TGC-CCA-GAC-T-3′)；GAPDH正向引物(5′-TGA-AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TTG-GT-3′)；GAPDH反向引物(5′-CAT-GTG-GGC-CAT-GAG-GTC-CAC-CAC-3′)。
將活躍生長的THP-1細胞(3mL，1×106細胞/mL)在被測物質的存在下孵育2小時。用TRI Reagent試劑盒(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)分離全部RNA，其中細胞用酚和硫氰酸胍聯(lián)合裂解。加入溴氯丙烷后，將RNA分離到水相，然后用異丙醇沉淀。用此方法回收的總RNA約為30μg。用0.8％瓊脂糖凝膠進行的分離后RNA的電泳，沒有顯示出污染DNA的信號。
用Promega(Madison，WI)的試劑盒試劑進行RT-PCR反應。各反應用下列組分(總體積30μL)6μL AMV/Tfl 5×反應緩沖液，0.6μL dNTP混合物(10mM)，1.2μL MgSO4(25mM)，0.6μL AMV逆轉錄酶(5單位/μL)，0.6μL TflDNA聚合酶(5單位/μL)，1.2μL的各引物(15pmol/μL)，及2ng總RNA(IL-1β，TNF-α)或5ng總RNA(GAPDH)。用Techne Unit Progene自動熱循環(huán)儀進行RT-PCR。第一個循環(huán)在48℃45分鐘，接著在94℃2分鐘。用35個循環(huán)完成擴增在94℃變性45秒，在60℃退火1分鐘，并在68℃延伸2分鐘。最后的循環(huán)將樣品在68℃保持7分鐘。用12μL的反應混合物在5％聚丙稀酰胺凝膠上用溴乙啶作為染色劑完成RT-PCR產物(mRNA IL-1β，TNF-α和GAPDH)的電泳。
與對照組相比，用LPS或微藻多糖制品處理THP-1細胞都導致IL-1βmRNA(810bp)和TNF-αmRNA(444bp)的顯著增加。管家基因甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH，1000bp)的mRNA水平對于所有樣品來說都是相同的(圖4)。
所觀察到的NP16847、NP16848和NP16846對NF-κB的激活不是由于這些制品中的內毒素雜質。這通過確定此可能性的下列兩個試驗的結果得到了證實。首先，聯(lián)合加入多粘菌素B(10μg/mL，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和各多糖制品(0.1至1μg/mL)，觀察在NF-κB激活中是否存在任何消弱。多粘菌素B是已知通過結合LPS分子的脂A部分來阻斷LPS的多種生物作用的多陽離子抗生素。所有三個微藻多糖制品對多粘菌素B的加入不敏感(數(shù)據未給出)。向LPS中加入多粘菌素B(10μg/mL)將NF-κB激活降低了75％。用來檢測可能的內毒素介導的作用的第二個試驗，在糖基組分分析中尋找β-羥基豆蔻酸酯的存在。在NP16848和NP16846的樣品制品中沒有檢測到β-羥基豆蔻酸酯。因此，觀察到的NP16848和NP16846引起的巨噬細胞激活不太可能是由內毒素引起。
但是，在NP16847的兩個不同樣品中檢測到了少量的β-羥基豆蔻酸酯(總峰面積的0.6％)。為了確定存在多少“內毒素樣”物質，用Limuls阿米巴狀細胞裂解物(LAL)試驗(由Bio Whittaker，Walkersville，MD進行分析)分析AFA的六個樣品。用此試驗檢測到的LAL陽性物質的量為微藻干重的0.002％。通過比較，NP16847的回收百分率高出約300倍(微藻干重的0.6％)。這意味著NP16847處在產生半數(shù)最大NF-κB激活的濃度時(100ng/mL)，潛在LAL陽性物質的總量應為300pg/mL。內毒素的此濃度用巨噬細胞試驗系統(tǒng)是不能檢測到的。因此，可能的內毒素污染不能解釋NP16847對巨噬細胞激活的刺激作用。
實施例1至3說明了用70％乙醇在40℃可以從食品級微藻中提取具有強免疫刺激活性的多糖制品。這些多糖制品分離中的隨后步驟包括復雜的方案及有機溶劑的使用。按照慣例，由于其具有高的水溶性，用熱水從天然原料中提取多糖。因此，與首先用70％提取相比，此熱水分離方法預計會得到更高收率的這些多糖。此外，由于熱水提取物一般很少含有非極性物質，故將不需要用有機溶劑萃取(如果此方法可行)。但是，恰恰相反，水提取(實施例4至6)得到的制品，實際上，與首先用含水乙醇提取(實施例1)的方法得到的制品相比，活性要小，并還帶來了其它問題。
如上述實施例所述，進行HPLC大小排阻層析分析并檢測免疫刺激活性(巨噬細胞的活化)。在各實施例中所用微藻是凍干的AFA(Lot.041900 Merc)，得自Klamath Algae Products Inc.，Klamath Falls，OR。超濾(當使用時)用具有截留分子量為100,000的聚醚砜膜的(Centricon Plus-20 from Millipore，Bedford，MA)裝置進行。對于該試驗，超濾后的滲余物用3％KCl(w/v)洗滌若干次，以除去粘附(也許是通過離子相互作用)至大分子量物質上的不純物。
實施例4-40℃水提取并用乙醇沉淀法除去藻藍蛋白40℃AFA的水提取存在問題，因為此粗提物含有大量的藻藍蛋白(藍色蛋白質色素)。通過超濾無法成功除去藻藍蛋白，由于此物質與NP16847多糖制品一起保留在截留分子量為100,000道爾頓的過濾器中。用乙醇徹底沉淀藻藍蛋白物質需要70％乙醇或濃度更高的乙醇(未給出數(shù)據)溶液。為了評價此方法，在40℃將10g的凍干AFA用水提取三次(62.5mL每次)，每次4至8小時。將粗水提物凍干并再溶解于40mL的水中。室溫下加入乙醇(92mL)至乙醇最終濃度為70％。除去沉淀的物質(含有藻藍蛋白)，并將上清液通過超濾裝置。評價此分離步驟中每步物質對巨噬細胞的活化作用(圖5)。十分清楚，在70％乙醇沉淀過程中，大部分免疫刺激活性損失在該沉淀物(也含有藻藍蛋白)中。用此方法得到的超濾后物質(高于100,000道爾頓)的回收率為1.0％。雖然，此回收率高于實施例1中用70％乙醇提取方法得到的超濾后物質的回收率0.6％，但該物質含有NP16847以外的其它物質，因為它的EC50值為1000ng/mL，而實施例1的物質的EC50值為100ng/mL。
實施例5-40℃水提取并用硫酸銨除去藻藍蛋白分離藻藍蛋白的方法(43，44)一般使用硫酸銨沉淀(40-65％飽和度)?，F(xiàn)研究此方法，以便評價硫酸銨沉淀是否能夠從此粗提物中選擇性除去藻藍蛋白。在40℃將凍干AFA(10g)用水提取三次(62.5mL每次)，每次4至8小時。將粗水提物凍干并再溶解于40mL的含48g硫酸銨(50％飽和度)的水中。除去沉淀物質(含藻藍蛋白)并將此上清液通過超濾裝置。超濾后物質的百分回收率是1.32％，但是其中可能含有極少的NP16847，因為其特異活性非常低(EC50＞1000ng/mL)。附圖6總結了該分離方法中每步物質的免疫刺激活性。與前面的研究類似，硫酸銨的加入使大部分NP16847與藻藍蛋白一起沉淀。
十分清楚，無法成功地分離粗水提取物中的藻藍蛋白和NP16847。此外，將殘渣物質(40℃水提取后殘余物)用含水乙醇在較高溫度下(例如，50％乙醇/60℃)進行重提取，分離出大量的NP16847(見實施例43)。因此，在40℃用水提取沒有使NP16847完全回收。
實施例6-70℃熱水提取在較高溫度如70℃進行的水提取，會導致藻藍蛋白變性并沉淀，剩下NP16847及其它極性分子在溶液中。為了評價此方法，將20g的凍干AFA在70℃用水提取三次(125mL每次)，每次4至8小時。此粗提物似乎不含任何藻藍蛋白物質，因為看不出藍色。將粗水提物凍干并再溶解于80mL的水中。在-20℃，將NP16847用醇(水∶甲醇∶乙醇，1∶2∶3)沉淀24小時。沉淀物質通過超濾裝置。附圖7總結了該分離方法中各步物質的免疫刺激活性。超濾后物質的巨噬細胞激活的EC50值(200ng/mL)比實施例1得到的物質(100ng/mL)略高。用此方法得到的超濾后物質的回收率為1.74％，比實施例1的70％乙醇方法得到的0.6％NP16847回收率有本質的提高。因此，如通過對超濾后物質的EC50值進行比較所示，用70℃水提取回收了約3倍的NP16847。
用熱水提取(在70℃)的NP16847的分離，比實施例1中的分離方法產生了若干優(yōu)點。沒有使用有機溶劑，得到終產物只需要幾個步驟，并提取了約3倍的NP16847。但是，該方法存在若干缺點。首先，粗水提物為了濃縮需要凍干，以避免沉淀中醇的體積過大。其次，超濾前物質含有大量的無活性物質(如通過約500ng/mL的低EC50值和附圖7中HPLC色譜圖所證實)，用超濾裝置其純化非常慢。
基于對實施例1描述的70％乙醇提取方法的改進，以下評價了若干其它方法。如下實施例描述的分離方法不需要使用有機溶劑，且在有限的幾步中完成分離。這樣，開發(fā)出克服了與用熱水提取有關的所有問題的簡單、經濟且有效的方法。
實施例7-40℃70％乙醇提取，用氯仿萃取在實施例1為了提取NP16847，在正丁醇和水之間的第二溶劑分配步驟，導致免疫刺激活性大量損失到丁醇層中。因此，對實施例1的方案進行改良，除去正丁醇溶劑萃取步驟。此新方法與實施例1的方法相同，只是僅有在氯仿和水(1∶1)之間的一個溶劑分配步驟。附圖8總結了此分離方案和此分離方法中各步的免疫刺激活性。用此方法得到的超濾后物質的EC50值(200ng/mL)略高于實施例1所得物質(100ng/mL)。用此方法得到的超濾后NP16847的百分回收率為1.97％。因此，從70％乙醇提取方法(實施例1)中除去正丁醇溶劑萃取步驟將超濾后NP16847的回收率提高了3倍以上。但是，此方法的主要缺點是在有機溶劑萃取步驟中使用了氯仿。
實施例8-40℃70％乙醇提取并直接進行醇沉淀為了評價不使用丁醇和氯仿萃取的方法，在40℃將10g的凍干AFA用70％乙醇提取兩次(125mL每次)。第一次提取進行3小時，第二次提取進行12小時。將粗品70％乙醇提取物在-20℃保存幾小時，并通過離心除去沉淀物質。將沉淀用冷的95％乙醇洗滌(除去殘留的非極性物質)，再溶解于水，然后通過超濾裝置。附圖9總結了該分離方法中各步物質的免疫刺激活性。超濾后物質的EC50值(200ng/mL)略高于實施例1獲得的物質(100ng/mL)。超濾后NP16847的百分回收率為1.2％。雖然此回收率比實施例1描述的提取方法所得的高出2倍，但是它比實施例7中方案所得回收率低約30％。較低的回收率可能是由于在70％乙醇中沒有完全沉淀。
實施例9-40℃70％乙醇提取并直接進行80％醇沉淀將上述方法(實施例8)稍加改進以獲得更大收率的NP16847。通過加入冷的100％乙醇，將得自70％乙醇提取的粗提物調節(jié)為80％乙醇并在-20℃保存幾小時。沉淀物如上所述進行處理。附圖10總結了此分離方案和此分離方法中各步的免疫刺激活性。此改良的方法得到超濾前NP16847制品的回收率為5.7％，且在單核細胞激活試驗中EC50值為200ng/mL。超濾后物質的回收率為1.8％。超濾后物質EC50值(200ng/mL)略高于實施例1所得物質(100ng/mL)，但是與實施例6和7所得超濾后物質的EC50值相等。
此方法從粗品70％乙醇提取物中直接沉淀NP16847多糖制品(實施例9)，其目的順利達到。不使用有機溶劑(或甲醇)，沒有凍干/溶劑蒸發(fā)步驟，且獲得NP16847的較純制品只是需要幾個步驟。除去超濾純化步驟可得到NP16847的半純制品(參見附圖10中的超濾前或后物質的HPLC色譜圖)。此超濾前NP16847制品足夠用作食品增補劑(植物學的)提取物。此物質的分離只需要由粗品70％乙醇提取物直接進行乙醇沉淀。
下面總結了此分離方法(實施例9)優(yōu)于其它被測方法的原因。
1.在40℃水提取。
a.含有高濃度的藻藍蛋白，其不能通過超濾或者通過乙醇或硫酸銨沉淀從NP16847中分離。
b.超濾后所得NP16847特異活性低，EC50-1000ng/mL對應200ng/mL(實施例9)。
c.殘渣物質含有大量的NP16847，在此溫度下其不能用水提取回收(見
2.在70℃水提取。
a.在此溫度下水提取，在超濾前物質中含有過量的無活性極性物質。這是不利的，原因有二個。首先，超濾前制品含低濃度的NP16847。其次，為了獲得超濾后NP16847制品進行的超濾極其緩慢。
b.雖然此方法沒有使用毒性有機溶劑，但是其確實需要粗提物的凍干步驟。
3.70％乙醇提取，接著有機溶劑萃取。
a.顯而易見，此步驟的主要缺點是使用有機溶劑(即氯仿)來除去非極性物質。
上述實施例中，最佳的通用方法(實施例9)包括在40℃用70％乙醇對凍干AFA進行兩次初步提取。將粗提物調節(jié)至80％乙醇并冷卻至-20℃。收集沉淀并用冷的95％乙醇洗滌以除去殘留的親脂性物質。高分子量物質(超過100,000道爾頓)，含有約30％的超濾前多糖制品，可以用超濾方法分離。下面提供了實施例9所得NP16847制品與通過用70％乙醇/40℃提取制備的NP16847(實施例1)的比較結果NP16847(實施例9)NP16847(實施例1)超濾前物質回收率5.7％3.0％超濾前物質EC50值 200ng/mL 200ng/mL超濾后物質回收率1.8％0.6％超濾后物質EC50值 200ng/mL 100ng/mL這些數(shù)據表明用實施例9的方法提取AFA得到2倍的超濾前物質和3倍的超濾后物質NP16847。但是此方法所得超濾后物質的EC50值稍高于實施例1所得的，這表明回收率的提高部分是由于非活性物質。因此，實施例9中所用條件被選作進一步優(yōu)化以改善NP16847制品的特異活性的起始點，因為該新分離方法提供了如下優(yōu)點1.超濾前物質和超濾后物質NP16847多糖制品的最佳收率和良好的特異活性。
2.不使用毒性有機溶劑。
3.不包括大體積的水或溶劑的旋轉蒸發(fā)或凍干。
實施例10-38提供了對改變的提取溫度和乙醇濃度以優(yōu)化實施例9中所用條件的詳細分析。
實施例10-在50℃70％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在50℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到6.5％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例11-在60℃70％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在60℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到7.1％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例12-在70℃70％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在70℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到7.1％回收率的超濾前物質NP16847制品且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為75ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到2.7％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約35ng/mL。
實施例13-在80℃70％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在80℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到7.6％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為50ng/mL(表4)。
實施例14-在23℃70％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在23℃用70％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.5mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到4.5％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
實施例15-在23℃下60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在23℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到7.0％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
實施例16-在40℃60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在40℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到8.4％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為200ng/mL(表4)。
實施例17-在50℃60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在50℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.0mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到9.4％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例18-在60℃60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在60℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到9.5％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到3.5％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約75ng/mL。
實施例19-在70℃60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在70℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.0％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為50ng/mL(表4)。
實施例20-在80℃60％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在80℃用60％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.2％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為25ng/mL(表4)。
實施例21-在23℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在23℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到9.1％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為200ng/mL(表4)。
實施例22-在40℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在40℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到8.9％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例23-在50℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在50℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.1mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到9.4％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為75ng/mL(表4)。
實施例24-在60℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在60℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.8％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為25ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到4.5％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約20ng/mL。
實施例25-在70℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在70℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mmL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.2％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為25ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到5.6％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約20ng/mL。
實施例26-在80℃50％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在80℃用50％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.7％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為25ng/mL(表4)。
實施例27-在23℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在23℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.4％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值＞250ng/mL(表4)。
實施例28-在40℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在40℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.7％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例29-在50℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在50℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.0mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.3％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例30-在60℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在60℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.8％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為50ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到3.3％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約25ng/mL。
實施例31-在70℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在70℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.4mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.1％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為50ng/mL(表4)。
實施例32-在80℃40％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在80℃用40％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到12.6％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為50ng/mL(表4)。除去低分子量物質(＜100,000道爾頓)得到6.2％回收率的超濾后物質NP16847制品，而其EC50值為約30ng/mL。
實施例33-在23℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在23℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到13.7％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為200ng/mL(表4)。
實施例34-在40℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在40℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到13.8％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例35-在50℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在50℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。兩次后合并兩次提取物的上清液(11.1mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.9％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例36-在60℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在60℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.2mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到10.5％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為100ng/mL(表4)。
實施例37-在70℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在70℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.1mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.0％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中的EC50值為75ng/mL(表4)。
實施例38-在80℃30％乙醇提取并直接進行80％乙醇沉淀將1g的凍干AFA在80℃用30％乙醇提取，先用7.5mL提取3小時，再用6.25mL提取12小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.0mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到11.9％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中的EC50值為75ng/mL(表4)。
表4總結了用于首次提取的溫度和乙醇濃度對上述最終結果的影響。用來評價各提取條件的有效性的最終結果，除了EC50值外還有超濾前物質的百分回收率。選擇超濾前物質進行這些分析，是因為其作為食品增補劑或藥物制品的潛在用途。除去超濾步驟將使該分離步驟產生實質上的簡化。
用于實施例9的條件(70％乙醇/40℃)得到5.7％回收率的超濾前物質NP16847，其EC50值為200ng/mL。在初步提取中，在70％存在下將提取溫度升高到40℃以上，增加了NP16847多糖制品的回收率和特異活性。但是，將提取溫度從40℃降低至23℃，用70％乙醇或其它濃度的乙醇，并沒有帶來較低的EC50值。在此溫度下(23℃)，在乙醇濃度較低時得到了較高的回收率。這種回收率的增加部分可能是由于對藻藍蛋白更有效的提取，該物質藍色的加深即是證明。在較高溫度下用70％乙醇提取，稍微提高了回收率并在實質上增加了特異活性(例如，70％乙醇/80℃)。與其它濃度乙醇相比，用超過40℃的任何溫度下用50％乙醇提取得到了較低的EC50值。在乙醇濃度超過或低于50％時，在各溫度條件下特異活性一般降低。濃度超過或低于50％的乙醇對回收產生相反的作用較高乙醇濃度使回收率下降，但是較低濃度時稍增加(在溫度為50℃或50℃以下)。在乙醇濃度高于50％時帶來的回收率和特異活性的降低，表明在這些條件下提取的NP16847較少，對于低于50％的乙醇濃度，回收率的提高以及特異活性的降低，表明與NP16847一起提取出的非活性物質更多。在低于60℃用30％和40％乙醇提取，部分非活性物質最可能是由于對藻藍蛋白更有效的提取，該沉淀藍色的加深再次成為證據。
表4中60℃-80℃50％乙醇的區(qū)域代表了得到最佳回收率和特異活性的條件。優(yōu)選的溫度范圍是60℃至70℃之間(實施例24和25)，因為對80℃40％至60％乙醇提取條件下得到的超濾前物質和超濾后物質的進一步分析，顯示了大量的水溶性物質。這些最佳條件帶來的超濾后物質的回收率為4.5％至5.6％(比實施例1的70％乙醇/40℃條件高出7.5至9.3倍)，而EC50值約為20ng/ml(比70％乙醇/40℃條件低5倍)。
實施例39-縮短提取時間表4中的數(shù)據是針對提取兩次的物質收集的，在每個條件下第一次提取3小時，第二次提取12小時。為了便于大規(guī)模提取NP16847，檢測各縮短1小時的結果，并發(fā)現(xiàn)就回收率和特異活性而言是相等的。
實施例40-在95℃只用熱水提取30分鐘現(xiàn)有技術從其它類型的微藻中分離免疫刺激多糖的方法(17，27)一般包括在95℃只用熱水提取30分鐘。為了評價此方法，將1g的凍干AFA在95℃用20mL的水一次提取30分鐘。將水提取液調至80％乙醇并在-20℃孵育幾小時。收集的沉淀物回收率為12.1％，但是含有非常少的NP16847，因為此物質的EC50約500ng/mL。超濾得到的回收率為5.1％，但特異活性無變化。顯然，這些條件不適于由AFA中提取NP16847。
實施例41-在4℃水提取，接著用50％乙醇/60℃再提取通過初步水提取選擇性除去污染的極性物質而基本上不損失NP16847，這是可能的。檢測兩步驟的提取方法來評價此研究。第一步包括在4℃對AFA進行初步水提取，接著第二步在最佳條件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。雖然此方法的NP16847的特異活性與最佳條件所得結果是類似的，但是超濾前物質和超濾后物質的回收率降低了約70％。
實施例42-在23℃水提取，接著用50％乙醇/60℃再提取對實施例41的方法稍加改進，將提取溫度由4℃升高到23℃。因此，第一次提取包括在23℃對AFA的初步水提取，接著第二步在最佳條件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。結果類似于實施例41(即特異活性與最佳條件下的特異活性可比，但是超濾前物質和超濾后物質的回收率降低了約70％)。
實施例43-在40℃水提取，接著用50％乙醇/60℃再提取對實施例41的方法稍加改進，將提取溫度由4℃升高到40℃。因此，第一次提取包括在40℃對AFA的初步水提取，接著第二步在最佳條件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。結果類似于實施例41(即特異活性與最佳條件下的特異活性可比，但是超濾前物質和超濾后物質的回收率降低了約70％)。
實施例44-用70％乙醇/40℃提取，接著用50％乙醇/60℃再提取通過初步乙醇提取選擇性除去污染的非極性物質而基本上不損失NP16847，這是可能的。檢測兩步驟提取方法來評價此研究。第一步包括在40℃用70％乙醇對AFA進行初步提取，接著第二步在最佳條件(50％乙醇/60℃)下再提取AFA。雖然對于超濾后物質NP16847來說，此方法比實施例24和25得到了稍好的EC50值(10ng/mL)，但是回收率僅1.0％。此超濾前物質回收率為2.2％，EC50值為20ng/mL。
純化的NP16847的一個性質是它似乎對聚丙烯移液管頭具有粘附性。為了避免在系列稀釋中轉移該物質引起的增大的EC50值，在每個稀釋度之間更換移液管頭。
超濾前、后NP16847的色譜分析見附圖5-11。用實施例1的方法分離的NP16847制品一般以寬單峰的形式洗脫(圖1)。但是，用改良的方法(實施例4-9)，超濾后物質NP16847以寬區(qū)的形式洗脫，其中似乎包括三個峰(參見附圖5-10)。但是，通過將這些超濾后物質NP16847制品在水和氯仿(1∶1)之間進行溶劑分配，可以將此三峰變?yōu)閷拞畏?。附圖9和10顯示了用氯仿進行此分配后純化的NP16847多糖峰的峰形。各色譜圖的右側遠處的寬峰在空白對照中也出現(xiàn)，因此可能是氯仿造成的。多重峰向單峰的轉變有幾種可能的解釋?？赡艽嬖谂cNP16847締合的痕量非極性或脂肪類物質，其引起NP16847多糖的分子間締合。這些較大的復合物給出多重峰。用氯仿除去非極性物質將破壞這些締合并產生單色譜峰。脂肪類物質或非極性物質與NP16847可能的締合可以解釋為何此多糖物質用高濃度的含水乙醇是可提取的。由于其分子量非常高，NP16847是單一的多糖還是相關多糖的混合物是難以評價的。但是，在用最佳提取條件(50％乙醇/60℃-70℃，見圖11)得到的前和超濾后物質NP16847制品中沒有發(fā)生多重峰現(xiàn)象。這可能是由于較低的乙醇濃度或較高的提取溫度造成的，或者兩種因素兼而有之。
用對TMS-甲基糖苷進行GC-質譜分析評價不同NP16847制品的糖類組成(表5)。對實施例1的NP16847物質(NP1)再次進行分析，發(fā)現(xiàn)其糖類組成特性與以前所確定的相同。由于不同批號的AFA(購自其它公司)用于實施例4-44，用實施例1的提取方法從該新物質中分離NP16847制品(NP2)。該NP16847制品與NP1具有類似的糖基組分，這表明了AFA的不同批號之間的一致性。但是，NP2制品比NP1活性低5倍(表5)，這是由于在正丁醇/水分配過程中部分活性多糖損失到了正丁醇相中?？傊?，用最佳提取條件(在60℃和70℃用50％乙醇)得到的超濾前物質和超濾后物質NP16847制品(NP3-NP6)中也發(fā)現(xiàn)了類似的糖類組分。但是，超濾前物質NP16847比超濾后物質制品在葡萄糖組分方面一致性更高，而在N-乙酰基化糖單位方面一致性低。基于這些不同NP16847制品(NP1-NP7)的糖類組分的一致性，得知在該物質中存在的主要糖基是甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖。為了識別在TMS-甲基糖苷方法中檢測到的O-甲基化的糖，還用糖醇乙酸酯分析來測定糖基組分。在這些制品中含有的甲基化的糖殘基包括2-甲基鼠李糖、3-甲基鼠李糖、4-甲基鼠李糖、2-甲基巖藻糖、3-甲基阿拉伯糖和3-甲基甘露糖。令人感興趣的是，這些NP16847制品含有5.1-12.5％甲基化的糖類殘基以及高百分比的脫氧己糖(例如，鼠李糖和巖藻糖)。這些特征可以解釋用較高濃度的含水乙醇產生的NP16847多糖物質的不尋常的可提取性。
由于被測樣品(NP1-NP7)EC50值的差異高達50倍，人們會預測它們之間糖類組成的一些不同。由于事實并非如此，顯然用此參數(shù)不能確定NP16847制品的純度或活性。因此，NP16847制品應更適于通過生物活性、大小以及在含水乙醇中的可提取性來定性?？赡塥毺氐慕Y構特征是NP16847具有激活單核細胞/巨噬細胞能力的原因，而不是特異性糖類的組成。還可能NP1-NP7糖類組分反映了多糖對于含水乙醇溶液的可提取性，而免疫刺激多糖應以此類中某結構類型的形式存在。用熱水提取所得物質(NP8和NP9)與用含水乙醇提取分離的NP16847制品(NP1-NP7)相比糖類組成差異很大，這一現(xiàn)象支持了該解釋。熱水提取AFA所得超濾前物質和超濾后物質的主要糖殘基是葡萄糖(表5)。NP8和NP9另一個顯著不同的特性是與用含水乙醇提取分離的NP16847物質相比鼠李糖的百分組成低。
實施例45-在65℃用60％甲醇提取，并直接進行80％醇沉淀將1g的凍干AFA在65℃用60％甲醇提取，先用7.5mL提取1小時，再用6.25mL提取1小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.5mL)。通過加入冷的100％甲醇將上清液的甲醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到1.8％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中EC50值為75ng/mL。
實施例46-在65℃用40％異丙醇提取并直接進行80％醇沉淀將1g的凍干AFA在65℃用40％異丙醇提取，先用7.5mL提取1小時，再用6.25mL提取1小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.5mL)。通過加入冷的100％異丙醇將上清液的異丙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到12.0％回收率的超濾前物質NP16847制品，而其在單核細胞激活試驗中EC50值為100ng/mL。
實施例47-用100％乙醇回流提取并通過冷卻至-20℃沉淀將1g的凍干AFA用100％乙醇回流提取，先用8.0mL提取1小時，再用6.50mL提取1小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.0mL)。將合并后的上清液在-20℃保存幾小時，并通過離心移出沉淀物質。隨后用冷的95％乙醇洗滌此沉淀。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。此提取方法得到0.68％回收率的超濾前物質NP16847制品，且其在單核細胞激活試驗中EC50值為約750ng/mL。
實施例48-用含水乙醇從其它食品級微藻(小球藻屬和螺旋藻屬)中提取免疫刺激多糖物質用由AFA獲得NP16847的方法，用含水乙醇在最佳條件下初步提取，所得制品比用熱水提取所得物質的活性高20倍(單核細胞激活的EC50值分別為25ng/mL和500ng/mL)。
同樣的含水乙醇提取方法也可以應用到其它食品級微藻中以獲得富含免疫刺激多糖的制品。例如，上述專利(16，17，27)報告了小球藻屬多種類和螺旋藻屬多種類含有免疫刺激多糖，其是用熱水提取的。但是，用含水乙醇(代替熱水)提取給免疫刺激多糖帶來了選擇性的富集，于是從這些有機體中得到的制劑含有優(yōu)異的生物活性和較高的回收百分率的活性物質(見如下試驗)。
下列食品級微藻用于試驗中蛋白核小球藻(Sun Chlorella，Lot.No.WS1422)和鈍頂螺旋藻(Nature′s Way，Lot.No.912091)。所有的多糖制品為超濾前物質。為了制備熱水提取物，將1g的凍干微藻在95℃用20mL水提取30分鐘。將熱水提取物調至80％乙醇并在-20℃孵育過夜。從小球藻屬所收集沉淀的回收率為13.2％而EC50值為1,000ng/mL。從螺旋藻屬所收集沉淀的回收率為16.5％而其在單核細胞/巨噬細胞激活中EC50值為10,000ng/mL。
通過系統(tǒng)地改變初步提取中所用的溫度和溶劑濃度(乙醇在水中的百分濃度)制備含水乙醇提取物。用百分回收率和巨噬細胞激活的EC50值的最終結果來確定制備免疫刺激多糖物質的最佳條件。用下列方法制備小球藻屬和螺旋藻屬提取物。將1g的凍干微藻在適當溫度下提取，先用7.5mL的含水乙醇溶劑提取2小時，再用6.25mL的含水乙醇溶劑提取2小時。離心后合并兩次提取物的上清液(11.3mL)。通過加入冷的100％乙醇將此上清液的乙醇濃度調至80％。之后在-20℃孵育幾小時，離心收集沉淀并隨后用冷的95％乙醇洗滌。將分離出的物質真空干燥并溶解于水中，濃度為10mg/mL。
得自小球藻屬和螺旋藻屬的免疫刺激制品的最佳回收率和特異活性的提取條件，類似于由AFA提取NP16847的最佳條件(60℃-70℃50％乙醇)。對于小球藻屬，制備免疫刺激多糖物質的最佳條件包括在70℃用50％乙醇的初步提取。該條件所得超濾前物質回收率為6.5％，EC50值為25ng/mL。對于螺旋藻屬，制備免疫刺激多糖物質的最佳條件包括在50℃至70℃溫度之間用40％-50％乙醇進行的初步提取。這些條件所得超濾前物質回收率為約9.0％，EC50值為500ng/mL。比較而言，雖然熱水提取物回收了多出約2倍的物質，但是它們與用含水乙醇的最佳提取條件所得制品比較活性降低了20至40倍。
總之，我們開發(fā)了由AFA最好地回收NP16847的簡單、有效的分離方法。對于超濾前物質NP16847制品來說，最佳的提取方法是由兩個被合并的提取物中直接用乙醇進行沉淀(在-20℃用80％乙醇)，這兩個提取物分別在60℃-70℃用50％乙醇提取1小時。此超濾前物質NP16847制品占AFA干重的11％。用包括超濾的一個附加步驟除去所有低于100,000道爾頓的物質，可以獲得相對純的NP16847多糖制品，回收率為4.5％至5.6％。超濾前物質和超濾后物質制品具有幾乎相同的EC50值(超濾前物質為25ng/mL而超濾后物質為20ng/mL)。與實施例1(在40℃用70％乙醇提取)所得NP16847物質比較，此最佳的超濾后物質制品含有高出7.5至9.3倍的NP16847，其活性高出5倍。此方法適于制備食品增補劑(植物性的)提取物及大體積的藥物制品。
由AFA微藻獲得免疫刺激多糖組合物(NP16847)的方法，同樣可以用來從富含免疫刺激多糖(例如激活單核細胞/巨噬細胞)的其它微藻(包括小球藻屬多個種類和螺旋藻屬多個種類)中獲得制品。所有三種微藻多糖制品的獨特的糖類組成允許使用選擇性地富集免疫激活物質的方法。這些多糖用傳統(tǒng)的熱水提取方法提取效果很差。熱水制品與用最佳方法獲得的制品比較，活性低了20至40倍。
藥物制劑本發(fā)明還包括低成本的大體積多糖制品。用來分離這些多糖制品的微藻可以生長在箱中，類似于普通的培養(yǎng)人食用微藻的商業(yè)方法。這意味著供應沒有問題，但對從天然產物中分離的化合物進行藥物開發(fā)通常是主要問題。本發(fā)明的多糖制品以高濃度(占微藻干重的6.5％至11％)存在，并可以用本發(fā)明的簡單、快速且低成本的技術加以分離。
在免疫缺陷疾病、癌癥、傷口愈合和感染性疾病的治療中，本發(fā)明的多糖制品可以用作免疫治療劑，故本發(fā)明包括了藥物組合物，其中含有任選地與藥用載體或賦形劑混合的本發(fā)明的多糖制品。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含有以達到預定目的的有效量的活性組分的組合物。具體地說，治療有效量指有效防止被治療對象所患癥狀的發(fā)生或減輕該癥狀。有效量的確定是本領域技術人員的一般知識，特別是基于本文中的詳細描述。
所用組合物的量將依賴于以下因素所治療的病癥、所治療的對象、患者的體重、所患疾病的嚴重性、給藥的方式和具體醫(yī)生的判斷。
本發(fā)明的藥物組合物可以以已知的方式來制備，例如，通過常規(guī)混合、溶解、制粒、包糖衣、磨細、乳化、包囊、包封或冷凍方法。
因此，本發(fā)明的藥物組合物可以以常規(guī)方法用含有賦形劑和輔劑的一種或多種生理可接受的載體進行配制，這些載體有利于這些組分化合物加工為可以藥用的制劑。適當?shù)闹苿┮蕾囉诮o藥途經的選擇。
對于注射，本發(fā)明的制劑可以配制成水溶液，優(yōu)選在生理相容緩沖液中，如Hanks溶液、林格氏溶液或生理的鹽緩沖液中配制。對于透粘膜給藥，在該制劑中使用適于滲透屏障的滲透劑。這些滲透劑是本領域公知的。
對于口服給藥，通過將活性組分與本領域熟知的藥用載體混合，可以容易地配制組合物。這些載體能夠將本發(fā)明的化合物配制為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮劑等由接受治療的患者口服攝入。將活性組分與固體賦形劑混合，任選地研磨所得混合物，并加工顆粒的混合物(如果需要在加入適宜的輔劑后)來獲得片劑和錠劑核，可以獲得口服藥物制劑。適宜的賦形劑特別是填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨醇；纖維素制品如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
如果需要，可以加入分解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽如藻酸鈉。
糖錠核用適當包衣進行包被。為此，可以使用濃糖溶液，其中可以任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、真漆溶液、以及適宜的有機溶劑或溶劑混合物。可以將染料或色素加入到片劑或錠劑包衣中，用來鑒別或確定活性化合物配料的不同組合。
可以口服的藥物制劑包括明膠制成的推進式膠囊(push-fit capsules)、明膠和增塑劑如甘油或山梨醇制成的密封膠囊。該推進式膠囊可能裝有與如下物質混合的活性組分填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選地穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解于或懸浮于適宜的液體中，如脂油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。口服給藥的所有制劑應該具有適宜此給藥的劑量。
對于頰部給藥，這些組合物可以是常規(guī)方式配制的片劑或錠劑。
對于吸入給藥，本發(fā)明使用的組合物以氣霧劑噴霧的形式便利地給藥，該汽霧由加壓包裝或噴霧器發(fā)出，其中使用適宜的噴射劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜的氣體。對于加壓氣霧劑，可以通過閥確定劑量單位，來轉運已經計量的量?？梢耘渲朴糜谖肫骰虼等肫鞯哪z囊或藥筒(例如明膠的)，其中含有化合物和適宜的粉末基質如乳糖或淀粉的強力混合物。
經配制，這些組合物可以通過注射，例如，通過快速輸注(bolus injection)或連續(xù)輸液，進行非腸道給藥。注射劑可以以單位劑型的形式存在，例如，在安瓿或在多劑容器中，其中加有防腐劑。這些組合物的形式可以是存在于油性或含水載體中的懸浮劑、溶液劑或乳液，并可以含有配制試劑，如助懸劑、穩(wěn)定和/和分散劑。
非腸道給藥藥物制劑包括水溶性活性化合物的水溶液。此外，可以將活性組合物的懸浮劑配制為適當?shù)挠托宰⑸鋺腋＿m宜的親脂性溶劑或載體，包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂質體。含水注射懸浮劑可以含有增加該懸浮劑粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，此懸浮劑還可以含有適宜的穩(wěn)定劑或者增加化合物溶解度以制備高濃度溶液的試劑。
或者，活性組分可以是粉末形式，在使用前用適宜的載體如滅菌無熱原水進行配制。
這些組合物還可以配制為直腸用組合物，如栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常規(guī)栓劑基質如可可脂或其它甘油脂。
除了上述制劑，這些組合物還可以配制為緩釋制劑。這些作用時間長的制劑可以通過植入(例如皮下或肌肉內)或通過肌肉內注射進行給藥。因此，例如，這些組合物可以用適當?shù)木酆匣蚴杷镔|(例如，作為可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂進行配制，或者配制為難溶衍生物，例如，難溶鹽。
這些藥物組合物還可以含有適宜的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠及聚合物如聚乙二醇。
適宜的給藥途經可以，例如，包括口服、直腸、透粘膜、透皮或腸內給藥，非腸道給藥包括肌肉內、皮下、髓內注射，以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。
或者，可以局部而不是系統(tǒng)方式使用該組合物，例如，通過將該化合物直接注射到患病區(qū)，常常是以緩釋制劑或持續(xù)釋放制劑的形式。
此外，可以在靶向藥物轉運系統(tǒng)中使用該藥物，例如，在用患病細胞的特異性抗體包被的脂質體中。這些脂質體將靶向該細胞并被該細胞選擇性地攝入。
如果需要，這些組合物可以存在于包裝或分配裝置中，其中可以裝有含有活性組分的一個或多個單位劑型。例如，此包裝可以包括金屬或塑料薄片如泡罩包裝。此包裝或分配裝置可以帶有給藥說明。還可以制備含有本發(fā)明組分、在相容的藥物載體中的組合物，將其置于適當?shù)娜萜髦?，并標明所治療的適應癥。標簽上的適宜病癥可以包括疾病的治療。
食品增補劑適用于本發(fā)明的食品增補劑包括其中含有為達到其預定目的的有效量的活性組分的組合物。更具體地講，有效量指能有效防止被治療對象所患病癥的發(fā)生或能減輕該病癥的量。有效量的確定是本領域技術人員的一般知識，特別是基于本文中的詳細描述。給藥組合物的量將依賴于以下因素所治療的病癥、所治療的對象、患者的體重、所患疾病的嚴重性、給藥的方式和具體醫(yī)生的判斷。
本發(fā)明的食品增補劑的組分含于口服可接受的賦形劑和/或載體中。載體的確切形式及隨之產生的該食品增補劑本身的形式并不重要。載體可以是液體、凝膠、凝膠片、膠囊、粉末、固體片劑(包衣的或非包衣的)、茶等等。適宜的賦形劑和/或載體包括麥芽糖糊精、碳酸鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、微晶纖維素、葡萄糖、米粉、硬脂酸鎂、硬脂酸、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、淀粉甘醇酸鈉、交聯(lián)聚維酮、蔗糖、植物膠、瓊脂、乳糖、甲基纖維素、聚維酮、羧甲基纖維素、玉米淀粉等(包括其混合物)。用常規(guī)技術將多種組分和賦形劑和/或載體混合，并配制為需要的形式。可以調整劑量水平/單位，以便每天以合理的單位數(shù)提供推薦水平的這些組分。
該食品增補劑還可以含有任選的組分，例如，包括草藥、維生素、礦物質、增效劑、著色劑、甜味劑、調味劑、惰性組分等。這些任選的組分可以是天然的或者濃縮的形式。一種或多種此類組分的選擇是配制、設計、消費者喜好及直接用戶所涉及的問題。加入到本發(fā)明的食品增補劑中的這些組分的量是本領域技術人員容易確定的。U.S.RDA推薦的供給量可以提供兒重和成人用量的指導。
參考文獻所有的參考文獻，或者本申請中引用或涉及的文獻，特引入本說明書中，以供參考。
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權利要求
1.免疫刺激制品，其自微藻分離，其中含有可用含水或者水和至少一種低級烷基醇的混合物的溶劑提取的多糖，所述烷基醇的烷基部分含有1至4個碳原子，所述活性多糖表觀分子量高于約2百萬道爾頓。
2.權利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述免疫刺激活性通過單核細胞/巨噬細胞的激活來顯示。
3.權利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是水華束絲藻。
4.權利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是水華束絲藻。
5.權利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
6.權利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
7.權利要求1所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
8.權利要求2所述的免疫刺激制品，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
9.權利要求3所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、甲基化糖和N-乙?；被墙M成。
10.權利要求4所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、甲基化糖和N-乙?；被墙M成。
11.權利要求5所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甲基化的糖組成。
12.權利要求6所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖和甲基化的糖組成。
13.權利要求7所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由鼠李糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、半乳糖和甲基化的糖組成。
14.權利要求8所述的免疫刺激制品，其中所述活性多糖的糖基組分基本上由鼠李糖、葡萄糖醛酸、巖藻糖、半乳糖和甲基化的糖組成。
15藥物組合物，其中含有權利要求1-14任一項所述的免疫刺激制品以及藥用載體或賦形劑。
16.食品增補劑，其中含有權利要求1-14任一項所述的免疫刺激制品以及食品增補劑可接受的載體或賦形劑。
17.為有治療需要的個體提高免疫功能的方法，其中包括給所述個體有效量的權利要求15所述的藥物組合物。
18.權利要求17所述的方法，其中所述個體患有病毒、細菌或真菌感染。
19.權利要求17所述的方法，其中所述個體患有癌癥。
20.權利要求17所述的方法，其中所述個體患有免疫缺陷。
21.權利要求17所述的方法，其中所述個體是人。
22.權利要求17所述的方法，其中所述個體是動物。
23.為有需要的個體提高免疫功能的方法，其中包括給所述個體有效量的權利要求16所述的食品增補劑。
24.權利要求23所述的方法，其中所述個體患有病毒、細菌或真菌感染。
25.權利要求23所述的方法，其中所述個體患有癌癥。
26.權利要求23所述的方法，其中所述個體患有免疫缺陷。
27.權利要求23所述的方法，其中所述個體是人。
28.權利要求23所述的方法，其中所述個體是動物。
29.從富含免疫刺激多糖的食品級微藻中獲得制品的方法，其中包括如下步驟(a)用含有水或水和至少一種低級烷基醇的混合物的溶劑提取所述微藻，制備提取物，其中所述烷基醇的烷基部分含1至4個碳原子，提取溫度為約4℃至100℃；(b)任選地將所述提取物濃縮至較小體積，如果提取物體積較大就需要該濃縮步驟；(c)通過沉淀方法從所述提取物中沉淀出多糖制品；(d)通過分離方法分離沉淀的多糖制品；及(e)用95％的醇洗滌(d)的沉淀物。
30.權利要求29的方法，其中所述提取中所用的醇是乙醇。
31.權利要求29的方法，其中所述提取中所用的醇是甲醇。
32.權利要求29的方法，其中所述提取中所用的醇是異丙醇或丙醇。
33.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在(a)中所述優(yōu)選的醇濃度為20-80％。
34.權利要求29-32任一項所述的方法，其中提取的優(yōu)選溫度是40至80℃。
35.權利要求29-32任一項所述的方法，其中所述微藻是水華束絲藻。
36.權利要求29-32任一項所述的方法，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
37.權利要求29-32任一項所述的方法，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
38.權利要求29-32任一項所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過蒸發(fā)溶劑進行(當需要時)，優(yōu)選在減壓下進行。
39.權利要求29-32任一項所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過凍干進行(當需要時)。
40.權利要求29-32任一項所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過透析進行(當需要時)。
41.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入乙醇至最終濃度約80％乙醇沉淀所述多糖制品。
42.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(c)中通過冷卻此提取物沉淀所述多糖制品。
43.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入鹽沉淀所述多糖制品。
44.權利要求43的方法，其中所述鹽是硫酸銨。
45.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(d)中通過過濾分離沉淀的多糖制品。
46.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(d)中通過離心分離沉淀的多糖制品。
47.權利要求29-32任一項所述的方法，其中在步驟(e)中用95％乙醇洗滌沉淀的多糖制品。
48.權利要求29-32任一項所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過超濾基本上除去分子量小于約100000道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
49.權利要求29-32任一項所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過大小排阻層析基本上除去分子量小于約2百萬道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
50.為刺激個體單核細胞/巨噬細胞的活性，用免疫刺激多糖制品治療個體的方法，包括給該個體使用有效量的、提取自食品級微藻的多糖制品以及可接受的載體。
51.權利要求50所述的方法，其中使用該免疫刺激多糖制品以促進傷口愈合。
52.權利要求50所述的方法，其中使用該免疫刺激多糖制品以治療癌癥。
53.權利要求50所述的方法，其中使用該免疫刺激多糖制品以治療免疫缺陷。
54.權利要求50所述的方法，其中使用該免疫刺激多糖制品以治療病毒、細菌或真菌感染。
55.權利要求50所述的方法，其中所述個體是人。
56.權利要求50所述的方法，其中所述個體是動物。
57.權利要求50所述的方法，其中所述微藻是水華束絲藻。
58.權利要求50所述的方法，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
59.權利要求50所述的方法，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
60.權利要求33所述的方法，其中所述微藻是水華束絲藻。
61.權利要求33所述的方法，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
62.權利要求33所述的方法，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
63.權利要求33所述的方法，其中所述提取的優(yōu)選溫度是40至80℃。
64.權利要求33所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過蒸發(fā)溶劑進行(當需要時)，優(yōu)選在減壓下進行。
65.權利要求33所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過凍干進行(當需要時)。
66.權利要求33所述的方法，其中濃縮步驟(b)通過透析進行(當需要時)。
67.權利要求33所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入乙醇至最終濃度約80％乙醇沉淀所述多糖制品。
68.權利要求33所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入鹽沉淀所述多糖制品。
69.權利要求68的方法，其中所述鹽是硫酸銨。
70.權利要求33所述的方法，其中在步驟(c)中通過冷卻所述提取物來沉淀所述多糖制品。
71.權利要求33所述的方法，其中在步驟(d)中通過過濾分離沉淀的多糖制品。
72.權利要求33所述的方法，其中在步驟(d)中通過離心分離沉淀的多糖制品。
73.權利要求33所述的方法，其中在步驟(e)中用95％的乙醇洗滌沉淀的多糖制品。
74.權利要求33所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過超濾基本上除去分子量小于約100000道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
75.權利要求33所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過大小排阻層析基本上除去分子量小于約2百萬道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
76.權利要求34的方法，其中所述微藻是水華束絲藻。
77.權利要求34的方法，其中所述微藻是蛋白核小球藻。
78.權利要求34的方法，其中所述微藻是鈍頂螺旋藻。
79.權利要求34的方法，其中濃縮步驟(b)通過蒸發(fā)溶劑進行(當需要時)，優(yōu)選在減壓下進行。
80.權利要求34的方法，其中濃縮步驟(b)通過凍干進行(當需要時)。
81.權利要求34的方法，其中濃縮步驟(b)通過透析進行(當需要時)。
82.權利要求34所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入乙醇至最終濃度約80％乙醇沉淀所述多糖制品。
83.權利要求34所述的方法，其中在步驟(c)中通過加入鹽沉淀所述多糖制品。
84.權利要求83的方法，其中所述鹽是硫酸銨。
85.權利要求34所述的方法，其中在步驟(c)中通過冷卻所述提取物來沉淀所述多糖制品。
86.權利要求34所述的方法，其中在步驟(d)中通過過濾分離沉淀的多糖制品。
87.權利要求34所述的方法，其中在步驟(d)中通過離心分離沉淀的多糖制品。
88.權利要求34所述的方法，其中在步驟(e)中用95％乙醇洗滌沉淀的多糖制品。
89.權利要求34所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過超濾基本上除去分子量小于約100000道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
90.權利要求34所述的方法，其中還包括通過將所述沉淀溶解于水中并通過大小排阻層析基本上除去分子量小于約2百萬道爾頓的所有組分來純化所述沉淀物。
全文摘要
用含水乙醇提取方法可以將免疫－多糖優(yōu)先從食品級微藻中提取出來。所得制品表現(xiàn)出極強的免疫激活活性。這些免疫刺激多糖的優(yōu)先提取依賴于所用乙醇的濃度和提取溫度。最有效的條件是50％乙醇濃度，60至70℃的溫度。分離出的多糖制品將用作改善免疫功能的植物或藥物制品。
文檔編號A61K36/02GK1447695SQ01814316
公開日2003年10月8日 申請日期2001年7月10日 優(yōu)先權日2000年7月10日
發(fā)明者戴維·S·帕斯科, 尼梅爾·皮尤, 薩米爾·羅斯, 馬芒德·埃爾索利, 哈拉·N·埃爾索利 申請人:密西西比大學