專利名稱：一種獲得并繁育羊草無(wú)性系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲得并繁育羊草無(wú)性系的方法。
背景技術(shù)：
羊草隸屬單子葉植物綱、禾本科、禾亞科、早熟禾系、大麥族、野麥亞族、賴草屬植物，是歐亞大陸草原區(qū)東部的重要草原建群種之一。主要分布于俄羅斯、朝鮮、蒙古及我國(guó)東北、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、新疆等省區(qū)。羊草是多年生根莖型禾草，對(duì)不同的生境條件表現(xiàn)出很強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，對(duì)改善我國(guó)北方草原生態(tài)環(huán)境和西部鹽漬化土地治理具有重大生態(tài)意義。同時(shí)，羊草是一種重要的牧草資源，蛋白質(zhì)含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，耐踐踏，是一種優(yōu)質(zhì)牧草。
“體細(xì)胞變異somatic variance”也稱“克隆變異clone variance”，是指體細(xì)胞在繁殖過(guò)程中出現(xiàn)的各種變異。細(xì)胞誘變是獲得植物體細(xì)胞變異的方法之一，是植物育種，研究與開(kāi)發(fā)植物種質(zhì)資源，特別是牧草及草坪草育種的重要途徑之一。羊草體細(xì)胞誘變是創(chuàng)造新的變異品種的方法之一，通過(guò)體細(xì)胞變異誘導(dǎo)植株，進(jìn)行高品質(zhì)品種篩選，提高資源豐度。獲得植物體細(xì)胞變異的方法有組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)，化學(xué)誘變及物理誘變法等。目前，人們利用這些誘變方法已經(jīng)獲得了多種植物的突變體。但到目前為止，尚沒(méi)有一種方法成功地用于羊草的誘變研究并獲得突變體。
低能重離子(簡(jiǎn)稱低能離子)是指能量在10keV-100keV之間，原子序數(shù)大于氦的剝離原子核。19世紀(jì)70年代，低能離子束被廣泛的應(yīng)用于物理材料表面的修飾，它與生物體的相互作用研究是近十幾年的事情。科學(xué)家應(yīng)用不同的材料進(jìn)行離子注入的生物效應(yīng)和作用機(jī)理的研究，揭開(kāi)了一個(gè)新的生命科學(xué)研究領(lǐng)域，如低能離子束與生命起源和進(jìn)化的關(guān)系，環(huán)境中低劑量輻射的危害以及低能離子束對(duì)生物遺傳物質(zhì)的修飾作用等。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種獲得并繁育矮化，返青早，根莖生長(zhǎng)快的羊草的方法。
本發(fā)明所提供的繁育羊草無(wú)性系的方法，是使用N+離子輻照羊草愈傷組織，再培養(yǎng)經(jīng)N+離子輻照后的愈傷組織，得到矮化，返青早，根莖生長(zhǎng)快的羊草；所述N+離子輻照中N+的能量可為20-30keV、脈沖劑量可為1.4-3.4×1016N+/cm2，優(yōu)選為N+的能量為25keV、脈沖劑量為2.6×1016N+/cm2。
其中，進(jìn)行N+離子輻照的羊草愈傷組織可由常規(guī)方法得到，最好是以羊草幼穗為外植體，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的羊草愈傷組織，且最好為緊密型愈傷組織。
經(jīng)N+離子輻照后的愈傷組織的分化培養(yǎng)基最好為含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件最好為25℃，光照強(qiáng)度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
本發(fā)明將低能離子誘變法應(yīng)用于羊草愈傷組織，獲得了矮化，返青早，根莖生長(zhǎng)快的羊草無(wú)性株系。本發(fā)明方法的特點(diǎn)是實(shí)用性強(qiáng)，誘變效率高，具有重要的理論意義和實(shí)際意義。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、一種獲得并繁育羊草無(wú)性系的方法繁育羊草的工藝流程為原材料無(wú)性繁殖→幼穗培養(yǎng)→繼代培養(yǎng)→低能離子輻射→植株再生→幼苗移栽→大田形態(tài)鑒定→分子鑒定。具體方法和過(guò)程如下1、植物材料來(lái)源及特征本實(shí)施例采用的羊草“無(wú)性系3號(hào)”原產(chǎn)于河北省沽源牧場(chǎng)蒙古大營(yíng)，它是經(jīng)以下篩選得到的先從河北省沽源牧場(chǎng)蒙古大營(yíng)的13個(gè)種質(zhì)中選擇形成68個(gè)無(wú)性克隆系，然后將25個(gè)無(wú)性系移栽到中科院植物研究所試驗(yàn)田(北京)，最后通過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)篩選出植株(試管苗)再生能力較強(qiáng)的“無(wú)性系3號(hào)”羊草作為本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料?！盁o(wú)性系3號(hào)”的特點(diǎn)是4月30日前后返青，5月?tīng)I(yíng)養(yǎng)枝高46cm，生殖枝高72cm，葉色深藍(lán)，葉毛少，葉寬0.41cm，葉長(zhǎng)18cm，群體抽穗率42％，每平米的枝數(shù)230，穗型復(fù)生，穗長(zhǎng)18cm，每穗小花數(shù)114，莖葉比1.64，產(chǎn)草量(鮮重)約2.6kg/平方米。
2、幼穗培養(yǎng)(1)羊草外植體處理采集孕穗期的羊草幼穗，長(zhǎng)度為4-7cm，幼穗完全被葉鞘緊密包裹。從田間取回的材料在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75％的酒精將包裹幼穗的葉鞘擦拭幾遍，然后小心剝出幼穗，葉鞘中的幼穗一般是無(wú)菌的，無(wú)需消毒。
(2)培養(yǎng)基培養(yǎng)基的基本成分是N6培養(yǎng)基，在誘導(dǎo)愈傷、繼代、誘導(dǎo)分化、生根等培養(yǎng)基中需添加適當(dāng)激素、蔗糖和瓊脂，所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)整為5.8，培養(yǎng)基先分裝，然后在120℃高壓鍋內(nèi)滅菌20min。
(3)愈傷組織的誘導(dǎo)將無(wú)菌幼穗切成3mm左右的小段，接種在含有0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養(yǎng)基上。25℃恒溫暗培養(yǎng)，培養(yǎng)4周統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
3、愈傷組織的繼代愈傷組織形成后，將緊密型愈傷組織轉(zhuǎn)到含有2，4-D 0.5mg/1的N6培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每4-5周繼代1次。
4、低能離子輻照選取繼代的緊密型愈傷組織，將其分為對(duì)照組和處理組，將處理組放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，置于靶室中進(jìn)行離子注入。小靶室本身消毒，并在樣品進(jìn)出時(shí)通入無(wú)菌空氣，保證樣品不受雜菌污染。處理組N+離子能量為25key，脈沖劑量分別為1.4×1016，1.8×1016，2.2×1016，2.6×1016，3.4×1016N+/cm2；對(duì)照組除沒(méi)有N+離子注入外，其他條件同處理組。
5、植株再生及幼苗移栽將輻照后和未經(jīng)輻照的愈傷組織切成2-4mm大小，分別轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基(含有2，4-D 0.5mg/l的N6培養(yǎng)基)上，1周后成活率如表1所示，結(jié)果說(shuō)明各處理對(duì)愈傷組織存活率有顯著影響，劑量越高愈傷組織存活率越低。將存活的愈傷組織接種到附加1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6分化培養(yǎng)基(經(jīng)過(guò)篩選，在這個(gè)培養(yǎng)基上愈傷組織的分化頻率最高，平均達(dá)到67％)。25℃恒溫，光照強(qiáng)度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。一個(gè)半月左右再生頻率如表2所示，結(jié)果說(shuō)明各處理對(duì)愈傷組織再生頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)上的顯著影響。將3-5mm長(zhǎng)的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(不含激素的1/2MS基本培養(yǎng)基)中生根，生根后的試管苗移栽到裝有按照1∶1比例混合沙土的小盆中，在溫室中過(guò)度一周，成活后轉(zhuǎn)到試驗(yàn)田，移栽成活率平均96％。共獲得1280個(gè)無(wú)性系，其中對(duì)照組306個(gè)株系，處理組974個(gè)株系。
表1 離子注入劑量與愈傷組織存活率的關(guān)系


*離子為N+離子，注入能量是25keV/次**相同的字母表示在統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著差異。
表2 離子注入劑量與愈傷組織再生頻率的關(guān)系

*離子為N+離子，注入能量是25keV/次**愈傷組織再生頻率是指存活的愈傷組織的再生頻率***相同的字母表示在統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯著差異。
6、大田形態(tài)鑒定在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)移栽植株進(jìn)行了形態(tài)記錄。包括株高，葉色，葉長(zhǎng)，葉寬，葉數(shù)，無(wú)性繁殖量，有性繁殖量，穗長(zhǎng)，小穗數(shù)，小花數(shù)，結(jié)實(shí)率等。植株數(shù)目與樣方面積的比值定義為植株密度，并折算為1平方米面積內(nèi)的植株密度，莖重與葉重的比值定義為莖葉比；二者重量之和為樣方面積內(nèi)的產(chǎn)草量，并折算為1平方米面積內(nèi)的產(chǎn)草量。始花期對(duì)以上性狀重復(fù)測(cè)量，并記錄營(yíng)養(yǎng)枝和生殖枝的數(shù)量，將二者的比值定義為抽穗率。種子成熟期進(jìn)行室內(nèi)考種，包括穗長(zhǎng)，每株種子產(chǎn)量，小穗數(shù)，小花數(shù)，千粒重，結(jié)實(shí)率等性狀。結(jié)果如表3所示，表明N+離子能量為25keV，脈沖劑量為2.6×1016N+/cm2時(shí)得到的形態(tài)變異(稱“典型無(wú)性系”)適合羊草作為優(yōu)良牧草和草坪草的需要。與對(duì)照“無(wú)性系3號(hào)”相比，本方法獲得的“典型無(wú)性系”具有以下顯著特點(diǎn)植株矮化(營(yíng)養(yǎng)枝高28cm，生殖枝高39cm)，葉色深綠，葉間距縮短，葉形變寬(0.65cm)，穗軸縮短(6cm)，返青早(3月5-15日)，根莖生長(zhǎng)快(枝數(shù)316/平方米/周年)，產(chǎn)草量提高(3.18kg/平方米)。
表3 離子注入誘導(dǎo)的形態(tài)變異概率

注“-”表示未發(fā)生新的形態(tài)變異6、分子鑒定采用分子標(biāo)記分析RAPD大田取200mg幼嫩葉片按CTAB法提取基因組DNA。純化后用含0.5g/mL溴化乙錠的0.8％瓊脂糖電泳檢測(cè)，模板DNA濃度平衡為100ng/μL。RAPD反應(yīng)總體積為20μL，其組分為MgSO42mmol/L；(NH4)2SO410mmol/L；KCl 10mmol/L；TrisHCl(PH9.0)50mmol/L；Triton X-100 0.1％；dNTP各200μmol/L；引物0.2μmol/L；基因組模板DNA 100ng；Taq plusI DNA聚合酶0.75U(購(gòu)自上海生工工程公司)，超純水13.25μl；加16μl石蠟油。PCR擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性5min，然后每個(gè)循環(huán)94℃ 40s，41℃ 90s，72℃ 70s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min，PCR在N.J.Co.Ltd.AmpGene4800熱循環(huán)儀上完成。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖膠[EB(溴化乙錠)含量0.5mg/L]，1×TAE緩沖液為介質(zhì)中，100V電泳1.5h，電泳結(jié)束后，紫外燈檢測(cè)并照相。用λDNA/EcoRI+HindIII做分子量標(biāo)記。
結(jié)果如表4所示，表明在對(duì)照組306個(gè)株系中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的形態(tài)變異，但檢測(cè)到1個(gè)株系的DNA發(fā)生了變化，即減少了一條RAPD條帶，變異頻率為1/208＝0.48％。而處理組974個(gè)株系，發(fā)生了14個(gè)形態(tài)變異，變異頻率為14/974＝1.44％；還檢測(cè)到53條RAPD帶發(fā)生了DNA水平上的變異，變異頻率為181/3706＝4.88％。
表4 離子注入誘導(dǎo)的RAPD變異效率

權(quán)利要求
1.一種獲得并繁育羊草無(wú)性系的方法，是使用N+離子輻照羊草愈傷組織，再培養(yǎng)經(jīng)N+離子輻照后的愈傷組織，得到矮化、返青早、根莖生長(zhǎng)快的羊草無(wú)性系；所述N+離子輻照中N+的能量為20-30keV、脈沖劑量為1.4-3.4×1016N+/cm2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述N+的能量為25keV，脈沖劑量為2.6×1016N+/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于進(jìn)行N+離子輻照的羊草愈傷組織是以羊草幼穗為外植體，以含0.5-2.5mg/L 2，4-D的N6培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于進(jìn)行N+離子輻照的羊草愈傷組織為緊密型愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于經(jīng)N+離子輻照后的愈傷組織的分化培養(yǎng)基為含有1mg/L KT和1mg/L 6-BA的N6培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于經(jīng)N+離子輻照后的愈傷組織的培養(yǎng)條件為25℃，光照強(qiáng)度15mol m-2s-1，光照周期12h光/12h暗。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種獲得并繁育羊草無(wú)性系的方法，其目的是提供一種獲得并繁育矮化、返青早、根莖生長(zhǎng)快的羊草的方法。本發(fā)明的繁育羊草的方法，是使用N
文檔編號(hào)A01H1/06GK1543777SQ200310115338
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者劉公社 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所