一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法。以臍血樣本、羊水樣本或外周血樣本作為起始材料，不進(jìn)行DNA提取，加入核酸擴(kuò)增所需反應(yīng)體系，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物；其中所述的反應(yīng)體系中含有中性鹽、Tris溶液、鎂離子、擴(kuò)增引物、dNTP混合物以及擴(kuò)增用酶。本發(fā)明所提供的PCR擴(kuò)增方法，不經(jīng)過(guò)核酸的分離和提取過(guò)程，不經(jīng)過(guò)任何核酸擴(kuò)增前預(yù)處理步驟，直接從臍血、羊水或外周血中高效擴(kuò)增目的核酸片段或全基因組核酸。本發(fā)明在產(chǎn)前基因診斷及染色體病快速診斷中具有很大的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程與產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，涉及一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在產(chǎn)前診斷中，高危、高齡以及具有不良孕產(chǎn)史、遺傳病家族史的孕婦來(lái)說(shuō)，羊膜腔穿刺結(jié)合胎兒染色體核型分析和臍帶穿刺結(jié)合臍血染色體核型分析是全世界最經(jīng)典的診斷方法，但該方法需經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)富集特定的胎兒細(xì)胞，非常耗時(shí)耗力，病人等待報(bào)告的周期長(zhǎng)。因此，臨床上需要不經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)直接進(jìn)行遺傳病診斷的方法，如全基因組測(cè)序技術(shù)、比較基因組雜交技術(shù)(arrayCGH)，但相對(duì)于檢測(cè)方法所需樣本量來(lái)說(shuō)，羊水及臍血中胎J L遺傳物質(zhì)較少，需要對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行放大。另外，遺傳病診斷前需對(duì)家系中的先癥者或父母雙方進(jìn)行致病位點(diǎn)的尋找及確定，因此常抽取家系成員的外周血進(jìn)行分析，同樣需要對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是一種有效的體外擴(kuò)增目的基因技術(shù)，它能在短時(shí)間內(nèi)將少量的胎兒遺傳物質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增放大，即將靶DNA擴(kuò)增百萬(wàn)倍，直接或者與其它技術(shù)結(jié)合后用于基因診斷和染色體病診斷。但一般步驟是從I _3ml臍血樣本或外周血樣本、10 -20ml羊水樣本中提取DNA后，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA提取的方法有酚氯仿法、尿素法、柱提取法等，提取過(guò)程中通常要用到一些特定的試劑和復(fù)雜的步驟，盡管現(xiàn)在一些商品化的DNA純化試劑盒大大地簡(jiǎn)化了這個(gè)過(guò)程，但仍然費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于自動(dòng)化，費(fèi)用也增高，同時(shí)也容易產(chǎn)生核酸之間的交叉污染，更重要的是羊水以及血液樣品中可能存在的各種致病菌，甚至病毒等，對(duì)操作人員的健康會(huì)造成很大的威脅。當(dāng)孕婦由于多種原因，如羊水量少、臍帶位置不好或胎兒不配合，導(dǎo)致獲取的臍血或羊水樣本量少，或者由于新生兒抽血困難獲得血量較少等，這種提取DNA后再擴(kuò)增的方法更是不方便或不可行。如不經(jīng)DNA提取直接利用臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增，可大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間和檢測(cè)成本，也可避免樣本間的交叉污染，將會(huì)有很廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]由于體液中存在一些成分干擾了細(xì)胞的裂解，抑制了 DNA聚合酶的活性，因此給直接運(yùn)用臍血、羊水或外周血進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶來(lái)了難度，另外，臍血或外周血中的抗凝劑也影響PCR擴(kuò)增。Al - soud研究小組發(fā)現(xiàn)血液中對(duì)PCR擴(kuò)增的主要抑制物質(zhì)是免疫球蛋白 G(IgG)【Al -Soud WA, Jonsson LJ, Radstrom P.1dentificat1n and characterizat1nof immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR.J ClinMicrob1l, 2000, 38:345 -50】，將純化的IgG(PIgG)與模板DNA —起加熱后發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增受到阻礙。之后研究又發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞中的血紅蛋白和白細(xì)胞中的乳鐵蛋白也是人血細(xì)胞中的兩種主要的 PCR 抑制劑【Al -Soud WA, Radstrom P.Purificat1n and characterizat1n ofPCR-1nhibitory components in blood cells.J Clin Microb1l 2001 ；39:485 - 93.】。抑制劑與基因組DNA之間的相互作用阻止了 DNA聚合酶與DNA模板之間的結(jié)合和延伸反應(yīng)的發(fā)生，影響了 PCR的擴(kuò)增，給直接利用臍血或外周血進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶來(lái)了難度。
[0004]本研究小組曾提出了不經(jīng)過(guò)核酸提取，直接對(duì)羊水進(jìn)行高溫處理后加入HpHbuffer中進(jìn)行擴(kuò)增用于快速診斷脊肌萎縮癥【黃歡等，羊水直接PCR法快速診斷脊肌萎縮癥的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13 (25):6845 - 7】，其中HpH buffer的成分為高 pH 值的 Tris - HCl 溶液(pH 8.81 - 9.90)【Huang et al, Direct polymerase chainreact1n (PCR) from human whole blood and filter - paper - dried blood by using aPCR buffer with a higher pH, Analytical B1chemistry, 2008，375，370 -372】。羊水中含有的蛋白質(zhì)樣本經(jīng)過(guò)高溫變性，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而導(dǎo)致溶解度降低，沉淀，另外，高溫處理羊水使得羊水中的胎兒細(xì)胞破裂，DNA釋放入溶液中參與PCR擴(kuò)增。但該方法也存在一些缺點(diǎn)，如需在PCR擴(kuò)增前對(duì)羊水進(jìn)行開(kāi)蓋離心，去上清后，高溫處理，之后再次開(kāi)蓋取處理后的羊水樣本加入HpH buffer中，雖然與羊水DNA提取相比簡(jiǎn)化了擴(kuò)增前處理步驟，節(jié)省了成本，但仍然存在反復(fù)開(kāi)蓋產(chǎn)生污染的風(fēng)險(xiǎn)，也同樣存在一些擴(kuò)增前處理的操作步驟。然而，羊水不經(jīng)過(guò)高溫處理直接加入HpH buffer中卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的擴(kuò)增。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法。
[0006]本方法的目的是通過(guò)下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的:
[0007]—種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，以臍血、羊水或外周血作為起始材料，不進(jìn)行濃縮，也不進(jìn)行DNA提取，加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的所需物質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物(包括凝膠電泳、芯片電泳、測(cè)序等)；其中最終的反應(yīng)體系中含有中性鹽、0.04 - 0.09mol/L的Tris溶液、1.5-3.0mmoI/L鎂離子及擴(kuò)增引物，反應(yīng)體系 pH 為 8.0 - 10.00
[0008]所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法中，臍帶血樣本或外周血樣本加到擴(kuò)增用反應(yīng)管的底部，羊水樣本加到擴(kuò)增用反應(yīng)管中，不對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行任何攪動(dòng)，直接加入核酸擴(kuò)增所需反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。羊水加入量?jī)?yōu)選1- 5μ 1，進(jìn)一步優(yōu)選2μ I。
[0009]所述的直接對(duì)臍血或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法中，臍血樣本選自含抗凝劑的抗凝臍血、不含抗凝劑的干燥濾紙臍血、含抗凝劑的干燥濾紙臍血。
[0010]所述的血樣為肝素鈉抗凝血或?yàn)V紙血時(shí)，所述的核酸擴(kuò)增所需反應(yīng)體系中還包括甘油，甘油的終濃度在0.5% - 25% (V/V)。
[0011]所述的羊水為羊膜腔穿刺抽取的胎兒羊水。
[0012]所述的中性鹽優(yōu)選硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選硫酸銨；所述的中性鹽在核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中的濃度為5mmol/L -20mmol/L。當(dāng)中性物質(zhì)為硫酸銨時(shí)，其在核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中的濃度優(yōu)選6mmol/L~16mmol/L,進(jìn)一步優(yōu)選10mmol/L。
[0013]所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法中，擴(kuò)增對(duì)象為臍血或外周血時(shí)，控制反應(yīng)體系的pH為8.5 -10.0 ;擴(kuò)增對(duì)象為羊水時(shí)，控制反應(yīng)體系的pH為8.0 -10.0。
[0014]所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法中，反應(yīng)體系中還包含PCR反應(yīng)所需的特異性引物和Taq DNA聚合酶，特異性引物的濃度為0.8-1.6pmol/μ 1，擴(kuò)增對(duì)象為臍血或外周血時(shí)，Taq DNA聚合酶的濃度為0.04 - 0.15υ/μ I。擴(kuò)增對(duì)象為羊水時(shí)，TaqDNA聚合酶的濃度為0.15 - 0.2U/ μ I。
[0015]所述的反應(yīng)體系中，所述的Tris溶液濃度優(yōu)選0.06mol/L;鎂離子濃度優(yōu)選2.0mmoI/L ；dNTP濃度優(yōu)選0.2mmol/L,特異性引物的濃度優(yōu)選0.8 - 1.6ρπιο1/μ I。擴(kuò)增對(duì)象為臍血或外周血時(shí)，每條特異性引物濃度進(jìn)一步優(yōu)選1.0pmol/ μ I ；Taq DNA聚合酶濃度優(yōu)選0.05U/ μ I ;擴(kuò)增對(duì)象為羊水時(shí)，每條特異性引物濃度進(jìn)一步優(yōu)選1.2pmol/y I ；TaqDNA聚合酶濃度優(yōu)選0.20U/ μ I。
[0016]一種用于直接對(duì)臍血或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組合物，包括5mmol/L - 20mmol/L中性鹽、0.04 - 0.09mol/L Tris 溶液、1.5-3.0mmol /I,續(xù)離子溶液、0.1 ~0.3mmol/L dNTP混合物、0.04~0.2U/ μ I Taq DNA聚合酶及滅菌蒸餾水，pH為8.0 - 10.0。
[0017]所述的中性鹽優(yōu)選硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種，進(jìn)一步優(yōu)選硫酸銨。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)有效抑制蛋白質(zhì)與基因組DNA之間的靜電作用，實(shí)現(xiàn)直接以臍血、羊水或外周血為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。臍血、羊水及外周血中含有的蛋白質(zhì)類(lèi)PCR抑制劑在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周?chē)乃肿訑?shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。在含蛋白質(zhì)類(lèi)抑制劑的PCR反應(yīng)液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周?chē)乃瘜訙p弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀，消除蛋白質(zhì)對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制。肝素鈉抗凝血中的肝素鈉成分以及濾紙血中的濾紙成分對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制作用，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，使用甘油實(shí)現(xiàn)肝素鈉抗凝血以及濾紙血直接作為擴(kuò)增的起始材料。EDTA抗凝血以及枸櫞酸鈉抗凝血直接PCR時(shí)，加入甘油提高EDTA抗凝血以及枸櫞酸鈉抗凝血的擴(kuò)增產(chǎn)量。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
[0020](I)提高了檢測(cè)效率
[0021]通常分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行臍血樣本、羊水樣本及外周血樣本中DNA檢測(cè)時(shí)，在PCR擴(kuò)增前，均需要對(duì)臍血、羊水或外周血中的DNA進(jìn)行提取。以常規(guī)使用的酚氯仿提取法為例，整個(gè)DNA提取過(guò)程耗時(shí)近2h ;如果使用商品化的DNA提取試劑盒，一個(gè)提取過(guò)程也需花費(fèi)Ih左右的時(shí)間。而利用本發(fā)明進(jìn)行臍血、羊水或外周血擴(kuò)增，省略了 DNA提取這一繁瑣的過(guò)程，從收到樣本到上機(jī)擴(kuò)增、電泳、檢測(cè)出結(jié)果，整個(gè)過(guò)程可控制在2h以內(nèi)，極大地提高了檢測(cè)效率，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0022](2)降低了檢測(cè)成本
[0023]DNA提取除了各種試劑以外，還需要配備一些儀器設(shè)備，如恒溫水浴鍋，高速離心機(jī)等。如果使用商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取，則成本還要提高。而使用本發(fā)明直接進(jìn)行臍血樣本、羊水樣本及外周血樣本擴(kuò)增，無(wú)需提取DNA。其配制的試劑成本低，全部檢測(cè)成本與普通PCR擴(kuò)增基本相同。
[0024](3)減少了交叉污染
[0025]常規(guī)的DNA提取過(guò)程需要反復(fù)打開(kāi)管蓋，吸去棄液，加入新的試劑，最后還需要將上清轉(zhuǎn)移至另外的試管中。人工操作步驟多且繁瑣。平行提取多份樣本時(shí)，交叉污染的幾率更大。即使不提取核酸而使用高溫前處理步驟釋放羊水中DNA，也存在濃縮及開(kāi)管等易引起交叉污染的步驟，與起始模板為DNA的PCR反應(yīng)相比，直接對(duì)羊水原液、臍血或外周血進(jìn)行擴(kuò)增，不需濃縮，也不許進(jìn)行DNA提取，僅在PCR反應(yīng)液配制時(shí)將樣本加入即可，大大降低了污染的可能。
[0026](4)產(chǎn)前基因診斷及染色體病快速診斷中的臨床應(yīng)用前景廣闊
[0027]臍血、羊水或外周血直接擴(kuò)增法操作簡(jiǎn)便易行，省略了傳統(tǒng)的DNA提取步驟，節(jié)約了檢測(cè)成本，降低了樣本的需要量，血液樣本僅需5μ L以內(nèi)，羊水樣本僅需1- 4μ L即可，較之直接擴(kuò)增減少了交叉污染的可能，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。該發(fā)明無(wú)需特殊儀器設(shè)備，僅需PCR實(shí)驗(yàn)室最基本的儀器即可開(kāi)展檢測(cè)。因此，在基于核酸擴(kuò)增測(cè)定的產(chǎn)前基因診斷及染色體病快速診斷中具有較好的應(yīng)用前景。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是對(duì)比不同類(lèi)型的臍血樣本直接PCR擴(kuò)增的效果。A圖為經(jīng)純化后的DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；Β圖為添加2Na.EDTA抗凝劑的臍血直接PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；C圖為添加肝素鈉抗凝劑的臍血直接PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；D圖為添加枸櫞酸鈉抗凝劑的臍血直接PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；E圖為未添加抗凝劑的濾紙臍血直接PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；F圖為添加肝素鈉抗凝劑的濾紙臍血直接PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中左側(cè)的泳道添加了甘油，右側(cè)泳道未添加甘油。
[0029]圖2是在PCR反應(yīng)體系中直接加入臍血或外周血樣本后攪拌與不攪拌對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。泳道2，3，6及7不進(jìn)行攪拌；泳道4，5，8及9進(jìn)行攪拌。泳道2，4，6及8為一個(gè)胎兒的臍血樣本，泳道3，5，7及9為另一個(gè)成人的外周血樣本。
[0030]圖3是緩沖液中不同中性鹽硫酸銨濃度對(duì)擴(kuò)增的影響。硫酸銨濃度分別為100mmol/L (泳道 I) ’ HOmmoI /I,(泳道 2) ’ BOmmoI /I,(泳道 3), 40mmol/L (泳道 4), 1 BmmoI / 泳道 6), 12mmol/L (泳道 7), 10mmol/L (泳道 8), 8mmol/L (泳道 9),Bmmol /I,(泳道 10)和 Ommol /I,(泳道 11)。
[0031]圖4臍血或外周血直接PCR在產(chǎn)前診斷單基因遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用。A:臍帶血軟骨發(fā)育不全基因檢測(cè):臍帶血軟骨發(fā)育低下基因檢測(cè)；C:外周血軟骨發(fā)育不全基因檢測(cè)；D:外周血軟骨發(fā)育低下基因檢測(cè)。
[0032]圖5是不同擴(kuò)增體系對(duì)羊水直接PCR擴(kuò)增效果的影響。泳道I =TaKaRa rTaq DNA聚合酶擴(kuò)增體系，加入2 μ I羊水原液擴(kuò)增；泳道2 =Promega Taq DNA聚合酶體系，加入2 μ I羊水原液擴(kuò)增；泳道3:HpH buffer體系，加入2 μ I羊水原液擴(kuò)增；泳道4:本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，加入2μ I羊水原液擴(kuò)增；泳道5:本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中去除中性鹽，加入2 μ I羊水原液擴(kuò)增；泳道6:本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，加入2 μ I高溫濃縮處理后的羊水。
[0033]圖6是羊水直接PCR擴(kuò)增時(shí)加入的不同量羊水量考察及效果評(píng)價(jià)。泳道1:2 μ I羊水原液；泳道2:5 μ I羊水原液；泳道3:10 μ I羊水原液；泳道4:19 μ I羊水原液。
[0034]圖7是考察酶的不同加入量以及引物的不同加入量對(duì)擴(kuò)增效率的影響。泳道1:
0.05U/ μ I Promega Taq DNA 聚合酶，0.4pmol/ μ I 每條引物；泳道 2:0.1OU/ μ I PromegaTaq DNA 聚合酶,0.4pmol/μ I 每條引物；泳道 3:0.15U/μ I Promega Taq DNA 聚合酶，
0.4pmol/ μ I 每條引物；泳道 4:0.20U/ μ I Promega Taq DNA 聚合酶，0.4pmol/ μ I 每條弓丨物；泳道5:0.1OU/ μ I Promega Taq DNA聚合酶，0.8pmol/μ I 每條引物；泳道6:0.1OU/μ I Promega Taq DNA聚合酶，1.2pmol/ μ I每條引物。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系pH 8.0 - 10.0,含濃度0.06mol/L Tris溶液，濃度在2.0mmoI/L的鎂離子，濃度為10mmol/L的中性鹽，濃度為0.2mmol/L的dNTP混合物。
[0035]圖8羊水直接PCR在產(chǎn)前診斷單基因遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用。A:進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良基因檢測(cè)；B:Y染色體微缺失基因檢測(cè)。

【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1
[0037]I)臍血DNA的提取:對(duì)收集的臍血標(biāo)本，每份取0.5ml，按酚/氯仿法提取，再以TE緩沖液溶解而得。實(shí)驗(yàn)用DNA模板均用紫外分光光度法測(cè)定其濃度及純度，以TE緩沖液調(diào)整終濃度為20~10ng/μ I備用。
[0038]2)臍血樣本的準(zhǔn)備:臍靜脈穿刺抽取孕婦的臍帶血，一部分加入一定量的抗凝劑，本實(shí)驗(yàn)采用的抗凝劑分別是枸櫞酸鈉、2Na -EDTA和肝素鈉，留取部分抗凝血置于4°C待用，同時(shí)取幾滴肝素鈉抗凝血滴于干凈濾紙上干燥室溫保存，其余血樣放在-35°C冷凍保存。另一部分血液不加入抗凝劑，直接滴到干凈的濾紙上，并置于干燥器中室溫保存。
[0039]3) PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè):
[0040]以純化的DNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系25μ1，組成為:lXTaq buffer(不含Mg2+)，每條引物 0.4pmol/μ I, 1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP 混合物，0.04U/μ I TaqDNA聚合酶，用滅菌水補(bǔ)充至25 μ I。
[0041]以臍血為模板進(jìn)行PCR，直接取抗凝臍血模板0.5μ I或適量濾紙血，加入含中性鹽硫酸銨的 buffer (Tris 0.06mol/L, MgCl22mmol/L,硫酸銨 10mmol/L, pH9.3)，0.2mmol/LdNTP混合物，0.05U/y I Taq DNA聚合酶，兩條引物(序列分別為:F1:5，_ACC RCT GTA CTGACT GTG ATT ACA C - 3’ (SEQ ID N0.1)以及 Rl:5’ - GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAGT -3，(SEQ ID N0.2))各lpmol/μ 1，滅菌蒸餾水加至25μ I。在肝素鈉抗凝血、無(wú)抗凝劑濾紙血及肝素鈉抗凝濾紙血擴(kuò)增體系中分別加入10% (v/v,以整個(gè)反應(yīng)體系的總體積為基準(zhǔn))的甘油。放入PCR儀中，96°C，3分鐘；(96°C，30秒；55°C，30秒；72°C，I分鐘)35個(gè)循環(huán)；72°C，7分鐘；4°C保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖1所示，各種抗凝血與DNA擴(kuò)增相比，所有的血樣都成功得到了高效擴(kuò)增。含中性鹽的擴(kuò)增體系能適用于臨床各種血樣的直接擴(kuò)增，甘油能提高肝素鈉抗凝濾紙血的擴(kuò)增效率，實(shí)現(xiàn)快速基因檢測(cè)。
[0042]本實(shí)施例中PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)的濃度均為在反應(yīng)體系中的終濃度。
[0043]實(shí)施例2
[0044]利用實(shí)施例1的方法對(duì)向臍帶血樣本或外周血樣本中加入反應(yīng)體系后攪動(dòng)與不攪動(dòng)反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增效率考察。結(jié)果如圖2所示，泳道2，3，6及7完全參照實(shí)施例1流程進(jìn)行，泳道4，5，8及9在實(shí)施例1流程中擴(kuò)增前加入攪動(dòng)反應(yīng)管的步驟，攪動(dòng)反應(yīng)管后擴(kuò)增效率明顯降低，擴(kuò)增產(chǎn)量極大的較少，結(jié)果在擴(kuò)增兩份不同的血樣(泳道2，4，6及8為一個(gè)胎兒的臍血樣本，泳道3，5，7及9為另一個(gè)成人的外周血樣本)，每份血樣擴(kuò)增兩個(gè)基因片段(泳道2 - 5擴(kuò)增片段的大小為539bp，擴(kuò)增引物為上游引物F2:5’ - TCA ACT GCA CAA CGATTG TCA - 3’ (SEQ ID N0.3)與下游引物 R2:5’ - TCC CTT AGC ACC TAG TTG TAA - 3’ (SEQID N0.4);泳道6 - 9擴(kuò)增片段的大小為338bp，擴(kuò)增引物為F3:5’ - CAT CAG ACT TTG ACCGTA-3’ (SEQ ID N0.5)與 R3:5，-AGA ATT AGC AAG CTG CCA-3’ (SEQ ID N0.6))，都得到了相似的擴(kuò)增效率，攪動(dòng)含有血樣的反應(yīng)管確實(shí)會(huì)降低臍血直接PCR的擴(kuò)增效率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加DNA聚合酶的用量能夠提高PCR管攪拌后的擴(kuò)增效率，因此認(rèn)為攪拌引起的低擴(kuò)增效率有可能是由于懸浮的絮狀物抓住了 PCR混合物中的DNA聚合酶，而在不攪動(dòng)的情況下絮狀物只形成在PCR管底的血樣周?chē)木植繀^(qū)，不會(huì)與溶液中分散的大量DNA聚合酶結(jié)合，因此也就不會(huì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生明顯的抑制。因此在臍血或外周血擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)操作中，在加入臍血樣本或外周血樣本后不攪動(dòng)PCR管直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0045]實(shí)施例3
[0046]利用實(shí)施例1的方法對(duì)血樣擴(kuò)增緩沖液中中性鹽硫酸銨濃度進(jìn)行研究，在其它PCR條件和成分不變的情況下，改變硫酸銨的加入量,分別為0mmol/L,6 mmol/L,8mmol/L,10mmol/L,12mmol/L,13mmol/L,16mmol/L,40mmol/L,6OmmoI/T,,80mmol/L 和 1OOmmol/L，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖3所示，硫酸銨的加入量在很寬范圍內(nèi)(6mmol/L - 16mmol/L)均能得到較好的擴(kuò)增結(jié)果(泳道5 -10)。與硫酸銨加入量為O (泳道11)的陰性做對(duì)照，顯示硫酸銨的加入對(duì)PCR的成功起到了重要作用。硫酸銨加入量最適范圍在8mmol/L - 13mmol/L(泳道6 - 9)之間,硫酸銨的最佳加入量為10mmol/L(泳道8)。過(guò)多的硫酸銨對(duì)反應(yīng)有抑制作用(泳道1- 4)。不加入中性鹽硫酸銨也無(wú)明顯擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0047]實(shí)施例4
[0048]單基因遺傳病指由于單個(gè)基因的突變而引起的遺傳病，其遺傳方式符合孟德?tīng)柖?，所以又稱孟德?tīng)栠z傳病。人類(lèi)大約有3萬(wàn)個(gè)基因，目前約有2000個(gè)單基因病的致病基因被鑒定。多數(shù)單基因病目前尚無(wú)有效的治療，給家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。對(duì)于一些嚴(yán)重的單基因病可通過(guò)基因診斷和產(chǎn)前診斷的方法，避免再生育患兒。在本實(shí)施例中檢測(cè)了兩種單基因遺傳病，分別為軟骨發(fā)育不全(臍血或外周血直接PCR診斷)以及軟骨發(fā)育低下(臍血或外周血直接PCR診斷)，具體方法和結(jié)果分析如下:
[0049]I)軟骨發(fā)育不全(ACH)致病基因?yàn)镕GFR3基因，位于4pl6.3，包含19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)16.5kb，由806個(gè)氨基酸殘基編碼組成。FGFR3受體蛋白包括三部分:胞外區(qū)為3個(gè)免疫球蛋白樣的配體結(jié)合區(qū)(Ig 1、Ig II和IgIII);跨膜區(qū)；胞內(nèi)區(qū)為酪氨酸激酶區(qū)(TKl和TK2)。目前已知，ACH患者基因突變的同質(zhì)性與其臨床表型的同質(zhì)性相一致，所有ACH患者都是由于FGFR3跨膜區(qū)突變引起。其中98 %為G380R突變，還有個(gè)別為G375C或G346E突變。FGFR3發(fā)生G380R突變，產(chǎn)生ACH表型，是由于在受體高度疏水的跨膜區(qū)引入一個(gè)親水殘基，影響跨膜區(qū)α -螺旋的形成。FGFR3基因G375C突變，是由于在受體跨膜區(qū)引入I個(gè)大的疏水性Cys，可以形成二硫鍵，從而改變FGFR3分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生ACH表型。ACH是一種常染色體顯性遺傳病。95%以上的患者是由于FGFR3基因跨膜區(qū)1138位核苷酸G — A的突變，少數(shù)為G — C的顛換，導(dǎo)致380位密碼子的錯(cuò)義突變，即精氨酸替代了甘氨酸，而致病。該實(shí)施例中建立的方法為臍血或外周血直接PCR后電泳測(cè)序。擴(kuò)增用引物序列為:F4:5’ - AGG AGC TGG TGG AGG CTG A - 3，(SEQ ID N0.7)以及 R4:5，- GGAGAT CTT GTG CAC GGT GG-3，(SEQ ID N0.8)。結(jié)果如圖4A及圖4C所示，該胎兒及患兒均發(fā)生了 1138位核苷酸G — A的突變，即均診斷為軟骨發(fā)育不全。
[0050]2)軟骨發(fā)育低下(HCH)和ACH —樣，都是遺傳性侏儒，呈常染色體顯性遺傳。HCH和ACH均以身材矮小為特征，表現(xiàn)為四肢過(guò)短、椎骨莖縮短。雖然常見(jiàn)的HCH癥狀較ACH輕，但二者僅存在細(xì)微的表型差異。因此，臨床上很難將HCH從此類(lèi)疾病中鑒別出來(lái)。60%~65%的HCH患者被檢測(cè)到FGFR3基因的N540K突變。該突變影響了胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶的活性，或者在無(wú)配體結(jié)合時(shí)，調(diào)節(jié)FGFR3形成二聚體，引起受體的異位表達(dá)或暫時(shí)異常表達(dá)。該實(shí)施例中所用方法為臍血或外周血直接PCR后電泳測(cè)序。擴(kuò)增用引物序列為:F5:5’ -ACTGAC AAG GAC CTG TCG GAC C - 3’ (SEQ ID N0.9)以及 R5:5’ - TTG CAG GTG TCG AAG GAGTAG TC -3’ (SEQ ID N0.10)。結(jié)果如圖4B及4D所示，該胎兒(圖4B)發(fā)生了 N540K突變，即核苷酸C — A的突變，該胎兒診斷為軟骨發(fā)育低下。該患者(圖4D)未發(fā)生N540K突變，不診斷為N540K突變引起的軟骨發(fā)育低下。
[0051]實(shí)施例5
[0052]實(shí)驗(yàn)流程:
[0053]I)羊水樣本處理:經(jīng)過(guò)羊膜腔穿刺抽取的羊水樣本，分成兩份，一份直接貯存于4°C冰箱備用，另一份取100 μ I于0.2ml PCR管中，短暫離心30秒后，去除上清90 μ 1，將剩余的10 μ I樣本置于PCR儀上95°C處理2 - 10分鐘，結(jié)束后取出備用。
[0054]2)PCR擴(kuò)增:使用四種不同擴(kuò)增體系進(jìn)行羊水直接PCR擴(kuò)增考察，擴(kuò)增體系25 μ I (含樣本)分為四種:(I) TaKaRa公司的rTaq DNA聚合酶，及對(duì)應(yīng)buffer體系成分；
(2)Promega公司的Taq DNA聚合酶,及對(duì)應(yīng)buffer體系成分；(3) HpH buffer體系:pH為9.0 的 Tris-HCl 溶液【Huang et al, Direct polymerase chain react1n (PCR) from humanwhole blood and filter - paper - dried blood by using a PCR buffer with a higherpH, Analytical B1chemistry, 2008, 375, 370 - 372】,每條濃度為 1.2pmol/ μ I 的引物，濃度為0.2U/y I的擴(kuò)增用酶，濃度為0.2mmol/L的dNTP混合物；(4)本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系(pH9.3)，含濃度 0 濃度為1.2pmol/y I的引物，濃度為0.2U/y I的擴(kuò)增用酶，濃度為
0.2mmol/L的dNTP混合物；(5)除不含中性鹽外，其他同⑷中的反應(yīng)體系。
[0055]引物序列分別為:上游引物:F1:5，-ACC RCT GTA CTG ACT GTG ATT ACA C -3，(SEQID N0.1)以及下游引物:R1:5’-GCA CYT CTT TGG TAT CYG AGA AAG T -3’ (SEQ ID N0.2)。
[0056]在PCR單管中加入備用羊水原液樣本或濃縮后高溫處理的羊水樣本2 μ I。在94°C預(yù)變性3分鐘后，于94°C 20秒、55°C 25秒以及72°C 20秒的條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后于72°C延伸5分鐘。
[0057]3)電泳檢測(cè):取PCR產(chǎn)物3μ1與上樣緩沖液混合后，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠，在100V電壓電泳15min。凝膠成像儀800ms曝光，根據(jù)擴(kuò)增片段的有無(wú)來(lái)判斷是否擴(kuò)增成功。由圖5的結(jié)果可以看出，使用商品化的Promega體系，TaKaRa體系以及HpH buffer體系(泳道1- 3)，均無(wú)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，而使用本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行羊水直接PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效果較好，電泳圖上出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道4)，能達(dá)到與濃縮及高溫處理羊水?dāng)U增(泳道6)相似的擴(kuò)增強(qiáng)度。在本發(fā)明中核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系去除中性鹽成分，擴(kuò)增強(qiáng)度有所減弱(泳道5)，說(shuō)明中性鹽成分能提高羊水直接擴(kuò)增的效率。
[0058]實(shí)施例6
[0059]經(jīng)過(guò)羊膜腔穿刺抽取的羊水樣本，分別取2 μ 1、5μ 1、10μ I以及19 μ I加入實(shí)施例5的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增用引物及程序同實(shí)施例5。結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增效果(即擴(kuò)增產(chǎn)物量):泳道1>泳道2>泳道3>泳道4。加入的羊水樣本量越大，對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制成分越多，擴(kuò)增效率越差。加入量大于10μ I擴(kuò)增效率急劇下降，19μ I的加入量導(dǎo)致無(wú)明顯擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，羊水的適合加入量小于等于5μ I。
[0060]實(shí)施例7
[0061]利用實(shí)施例6的方法對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中酶的加入量以及引物的加入量進(jìn)行擴(kuò)增效率的考察，羊水樣本的加入量為2μ I。結(jié)果如圖7所示，隨著酶的加入量增大，擴(kuò)增效率提高，濃度達(dá)到0.15U/ μ I時(shí)，擴(kuò)增效率到達(dá)高點(diǎn)(擴(kuò)增效果:泳道1>泳道2>泳道3以及泳道4)，再增加酶量，擴(kuò)增效率變化不明顯(泳道3以及泳道4擴(kuò)增效率相似)；隨著引物量的增加，擴(kuò)增效率提高(擴(kuò)增效果:泳道6>泳道5>泳道2)，考慮到引物二聚體的產(chǎn)生，本發(fā)明優(yōu)選引物量為1.2ρπι01/μ I。
[0062]實(shí)施例8
[0063]在本實(shí)施例中檢測(cè)了兩種單基因遺傳病，分別為進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良(羊水直接PCR診斷)，Y染色體微缺失(羊水直接PCR診斷)，具體方法和結(jié)果分析如下:I)進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良診斷:進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良簡(jiǎn)稱DMD，是一種X染色體連鎖隱性遺傳病。DMD主要由dyst1phin基因的缺失突變，重復(fù)突變，點(diǎn)突變和微小插入/缺失引起。最多見(jiàn)的突變是基因內(nèi)部的缺失，占總突變類(lèi)型的65%。dystrophin基因共有79個(gè)外顯子，通過(guò)測(cè)定79個(gè)外顯子中的19個(gè)熱點(diǎn)缺失區(qū)域，可以測(cè)到90%的缺失突變。在DMD基因的突變中，約有30%是新發(fā)突變，而非遺傳所致。本實(shí)施例通過(guò)羊水直接PCR擴(kuò)增結(jié)合電泳的方法來(lái)檢測(cè)DMD 基因 19 對(duì)外顯子 3,4,6,8,12，13，17，19，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52 和 60，結(jié)果如圖8A所示，正常胎兒所有的片段都獲得明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，患者胎兒缺失了 3，4及6號(hào)外顯子，診斷為DMD。
[0064]

【權(quán)利要求】
1.一種直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于以臍血、羊水或外周血作為起始材料，不進(jìn)行濃縮，也不進(jìn)行DNA提取，加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的所需物質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物；其中最終的反應(yīng)體系中含有中性鹽、0.04 - 0.09mol/L的Tris溶液、1.5 - 3.0mmoI/L鎂離子、特異性擴(kuò)增引物、dNTP混合物和Taq DNA聚合酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于臍血樣本、外周血樣本加到擴(kuò)增用反應(yīng)管的底部，羊水樣本加到擴(kuò)增用反應(yīng)管中，不對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行任何攪動(dòng)，直接加入核酸擴(kuò)增所需反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增；羊水的加入量為1- 5μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于血樣選自含抗凝劑的抗凝血、不含抗凝劑的干燥濾紙血、含抗凝劑的干燥濾紙血。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于所述的血樣為肝素鈉抗凝血或?yàn)V紙血時(shí),所述的核酸擴(kuò)增所需反應(yīng)體系中還包括甘油，甘油的終濃度在0.5% - 25% (V/V)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于所述的羊水為羊膜腔穿刺抽取的胎兒羊水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于所述的中性鹽選自硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種；所述的中性鹽在核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中的濃度為Smmol/I, - 20mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于擴(kuò)增對(duì)象為臍血或外周血時(shí)，控制反應(yīng)體系的pH為8.5 - 10.0 ;擴(kuò)增對(duì)象為羊水時(shí)，控制反應(yīng)體系的pH為8.0 - 10.00
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征在于反應(yīng)體系中特異性引物的濃度為0.8 - 1.6ρπι01/μ 1，擴(kuò)增對(duì)象為臍血或外周血時(shí)，Taq DNA聚合酶的濃度為0.05 -0.15U/y I ;擴(kuò)增對(duì)象為羊水時(shí)，Taq DNA聚合酶的濃度為0.15 -0.2U/μ I。
9.一種用于直接對(duì)臍血、羊水或外周血進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組合物，其特征在于包括Smmol /I, - 20mmol/L 中性鹽、0.04 - 0.09mol/L Tris 溶液、1.5-3.0mmol /I,鎂離子溶液、0.1~0.3mmol/L dNTP混合物、0.04~0.2U/ μ I Taq DNA聚合酶及滅菌蒸餾水，pH為8.0 - 10.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑組合物，其特征在于所述的中性鹽選自硫酸銨、乙酸銨、乙酸鈉、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸鉀、草酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化銨、氯化鈉、磷酸鈉中的任意一種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104178574SQ201410419644
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】黃歡, 李朔, 孫麗洲, 周?chē)?guó)華 申請(qǐng)人:黃歡