本發(fā)明屬于病原分子檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及桑生球針殼its序列及其在桑生球針殼分子檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桑里白粉病(mulberrypowderymildew)，即桑白粉病，因病原菌的菌絲體存在于桑枝條中下部葉片的背面，故準(zhǔn)確的稱呼一般為桑里白粉病，是一種真菌感染桑葉造成的在桑葉表面產(chǎn)生大片粉狀斑塊的植物病害。桑白粉病發(fā)病周期可從春季末持續(xù)到秋季，由于大量菌絲在桑葉表面生長(zhǎng)，使桑葉的產(chǎn)量降低、質(zhì)量變劣、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值差，喂食這種桑葉的家蠶體質(zhì)弱，易發(fā)生蠶病，影響繭絲的質(zhì)量以及產(chǎn)量，降低蠶業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)值(呂鴻聲，2008；王向東，2009)。

在過(guò)去的一百多年間，對(duì)桑里白粉病病原菌的形態(tài)觀察已足夠詳細(xì)，在種屬的分類(lèi)上并沒(méi)有異議。桑里白粉病病原菌的有性世代表現(xiàn)為球針殼屬(phyllactinia)，因寄主為桑樹(shù)，一般稱呼為phyllactiniamoricola，無(wú)性世代為擬小卵孢屬(ovulariopsis)，稱為ovulariopsismoricola；但桑樹(shù)白粉病的病原菌并非只有這一種，榛球針殼phyllactiniaguttata可寄生超過(guò)51科的植物，包括?？频纳?鄭儒永，1987)。但是，桑白粉病的病原菌較為單一，為球針殼屬(phyllactinia)，而基于分子鑒定的病原菌種則為phyllactiniamoricola，基本可以確定桑白粉病的病原菌為單一屬的真菌。

桑里白粉病是一種可從春季一直持續(xù)到冬季產(chǎn)生有性世代閉囊果的病害，在全國(guó)各大桑園均有發(fā)生，病征為葉片背面存在大塊白色病斑。但是，當(dāng)葉片表現(xiàn)出病斑存在時(shí)，已不可用于生產(chǎn)使用。因此，桑里白粉病的早期檢測(cè)和預(yù)防具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有桑里白粉病的早期檢測(cè)和預(yù)防技術(shù)的缺陷和不足，提供一種可在桑葉未表現(xiàn)出明顯的病斑、病害大規(guī)模爆發(fā)前，檢測(cè)葉片中病原菌的存在及含量，進(jìn)而對(duì)桑園葉片等進(jìn)行相應(yīng)的處理。具體是以白粉病病原菌——桑生球針殼rdna上its1至its2靶基因設(shè)計(jì)桑假尾孢菌的特異檢測(cè)引物；特異檢測(cè)引物可以以病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等提取的總dna為模板，并且檢測(cè)結(jié)果可靠、易于操作(簡(jiǎn)單快速)、特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于桑假尾孢菌的快速檢測(cè)，尤其是侵染早期檢測(cè)和土壤中、枝條上病原菌的快速檢測(cè)。

本發(fā)明的目的是提供一種桑生球針殼phyllactiniamoricola的its區(qū)段序列。

本發(fā)明另一目的是提供所述桑生球針殼phyllactiniamoricola的its區(qū)段序列在桑生球針殼分子檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明再一目的是提供一組桑生球針殼特異性檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種桑生球針殼phyllactiniamoricola的its區(qū)段序列，其特征在于，核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述桑生球針殼phyllactiniamoricola的its區(qū)段序列在桑生球針殼分子檢測(cè)中的應(yīng)用，以及在制備桑生球針殼分子檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

基于本發(fā)明人對(duì)桑生球針殼its區(qū)段序列的研究實(shí)驗(yàn)和針對(duì)性分析總結(jié)，選擇該區(qū)段序列作為檢測(cè)的靶基因，設(shè)計(jì)出三組桑生球針殼特異性檢測(cè)引物，分別如下：

一組桑生球針殼特異性檢測(cè)引物，包括上游引物1b1877f和下游引物1b2291r，核苷酸序列分別如seqidno.2和seqidno.3所示。

一組桑生球針殼特異性檢測(cè)引物，包括上游引物2b1802f和下游引物2b2303r，核苷酸序列分別如seqidno.4和seqidno.5所示。

一組桑生球針殼特異性檢測(cè)引物，包括上游引物3b1808f和下游引物3b2347r，核苷酸序列分別如seqidno.6和seqidno.7所示。

所述引物靈敏、快速、特異性高，依據(jù)本引物可有效地檢桑生球針殼菌，尤其是對(duì)侵染早期的檢測(cè)和蠶卵中家蠶微孢子蟲(chóng)的快速檢測(cè)，具有重要的意義。其中，引物組2b1802f和2b2303r最佳。

因此，上述桑生球針殼特異性檢測(cè)引物在桑生球針殼分子檢測(cè)中的應(yīng)用或在制備桑生球針殼分子檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種桑生球針殼特異性檢測(cè)試劑盒，包括上述任一組所述桑生球針殼特異性檢測(cè)引物。

優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括dna提取所需試劑或pcr擴(kuò)增反應(yīng)所需試劑。

優(yōu)選地，所述試劑盒的使用方法如下：以待測(cè)樣本dna為模板，利用桑生球針殼特異性檢測(cè)引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增dna片段的大小判定結(jié)果。

其中，待測(cè)樣本可為桑葉、菌絲體、土壤、枝條等多種樣本。

優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

其中，2×反應(yīng)緩沖液的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp；

優(yōu)選地，所述pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明獲得了桑生球針殼的rdna的its全長(zhǎng)序列，并依據(jù)此its區(qū)段設(shè)計(jì)了特異性、靈敏性較好的快速檢測(cè)桑生球針殼的引物組，該引物可用于桑白粉病的pcr檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確地判斷樣品是否含有桑生球針殼，且可為桑葉的健康生產(chǎn)與資源利用提供保證。

另外，本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，使用方便。而且適用的pcr擴(kuò)增模板非常多樣，適用范圍廣，可以是多種樣品的dna，病葉、菌絲體、病斑葉片、土壤、枝條等提取的總dna為模板，大大增加了檢測(cè)對(duì)象的范圍。

重要的是，本發(fā)明的特異檢測(cè)引物和試劑盒均能夠在病原菌侵染早期就能夠特異性的檢測(cè)出來(lái)，為桑污葉病的早期檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單快速的方法。

附圖說(shuō)明

圖1為引物1b1877f/1b2291r用于桑生球針殼的檢測(cè)。注：m：takaradl1000marker；引物組為1b1877f/1b2291r；泳道1-14的dna模版分別為：1為cladosporium屬(枝孢霉)；2為penicilliumverruculosum(疣孢青霉)；3為aspergillus屬(曲霉)；4為lecanicilliumpsalliotae(刀孢輪枝菌)；5為phanerinamellea(蜂蜜色蠟質(zhì)菌)；6為.schizophyllumcommune(裂褶菌)；7為candidamucifera(假絲酵母)；8為lasiodiplodiatheobromae(桑根腐病病原菌)；9為桑污葉病病葉提取dna；10為桑里白粉病病斑菌絲體；11為ciboriacarunculoides(桑菌核病病原菌-肉阜狀杯盤(pán)菌)；12為桑白粉病病原菌dna(陽(yáng)性對(duì)照)；13為桑樹(shù)dna(陰性對(duì)照)；14水(空白對(duì)照)。

圖2為引物2b1802f/2b2303r用于用于桑生球針殼的檢測(cè)。注：m：takaradl1000marker；引物組為2b18032f/2b2303r；泳道1-14的dna模版分別為：1為cladosporium屬(枝孢霉)；2為penicilliumverruculosum(疣孢青霉)；3為aspergillus屬(曲霉)；4為lecanicilliumpsalliotae(刀孢輪枝菌)；5為phanerinamellea(蜂蜜色蠟質(zhì)菌)；6為.schizophyllumcommune(裂褶菌)；7為candidamucifera(假絲酵母)；8為lasiodiplodiatheobromae(桑根腐病病原菌)；9為桑污葉病病葉提取dna；10為桑里白粉病病斑菌絲體；11為ciboriacarunculoides(桑菌核病病原菌-肉阜狀杯盤(pán)菌)；12為桑白粉病病原菌dna(陽(yáng)性對(duì)照)；13為桑樹(shù)dna(陰性對(duì)照)；14水(空白對(duì)照)。

圖3為引物3b1808f/3b2347r用于用于桑生球針殼的檢測(cè)。注：m：takaradl1000marker；引物組為3b1808f/3b2347r；泳道1-14的dna模版分別為：1為cladosporium屬(枝孢霉)；2為penicilliumverruculosum(疣孢青霉)；3為aspergillus屬(曲霉)；4為lecanicilliumpsalliotae(刀孢輪枝菌)；5為phanerinamellea(蜂蜜色蠟質(zhì)菌)；6為.schizophyllumcommune(裂褶菌)；7為candidamucifera(假絲酵母)；8為lasiodiplodiatheobromae(桑根腐病病原菌)；9為桑污葉病病葉提取dna；10為桑里白粉病病斑菌絲體；11為ciboriacarunculoides(桑菌核病病原菌-肉阜狀杯盤(pán)菌)；12為桑白粉病病原菌dna(陽(yáng)性對(duì)照)；13為桑樹(shù)dna(陰性對(duì)照)；14水(空白對(duì)照)。

圖4為特異引物1b1877f/1b2291r的靈敏度測(cè)試。注：m：takaradl1000marker；泳道1-6為敏感性測(cè)試；泳道1-6均為梯度稀釋的病原菌dna；濃度分別為：1為10ng/μl；2為1ng/μl；3為1×10^-1ng/μl；4為1×10^-2ng/μl；5為1×10^-3ng/μl；6為1×10^-4ng/μl。

圖5為特異引物2b1802f/2b2303r的靈敏度測(cè)試。注：m：takaradl1000marker；泳道1-6為敏感性測(cè)試；泳道1-6均為梯度稀釋的病原菌dna；濃度分別為：1為10ng/μl；2為1ng/μl；3為1×10^-1ng/μl；4為1×10^-2ng/μl；5為1×10^-3ng/μl；6為1×10^-4ng/μl。

圖6為特異引物3b1808f/3b2347r的靈敏度測(cè)試。注：m：takaradl1000marker；泳道1-6為敏感性測(cè)試；泳道1-6均為梯度稀釋的病原菌dna；濃度分別為：1為10ng/μl；2為1ng/μl；3為1×10^-1ng/μl；4為1×10^-2ng/μl；5為1×10^-3ng/μl；6為1×10^-4ng/μl。

圖7為真菌通用引物擴(kuò)增桑白粉病病原菌dna的its區(qū)段。注：m:takaradl5000marker；泳道1.引物its1和its4；泳道2.引物its4和its5。

圖8為2b1802f/2b2303r用于用于桑生球針殼的檢測(cè)。注：m：takaradl2000marker；引物組為2b18032f/2b2303r；泳道1-14的dna模版分別為：1.2為桑樹(shù)dna；3.4為桑污葉病病葉dna；5.6為桑菌核病病果dna；7.8為桑白粉病病葉dna；9.10為污葉病的桑枝條；11，12為桑污葉病發(fā)作地區(qū)的土壤；13為陽(yáng)性對(duì)照(白粉病菌絲體dna)；14為陰性對(duì)照(銅綠假單胞菌，細(xì)菌)；15為空白對(duì)照(水)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1桑生球針殼的rdna的its全長(zhǎng)序列獲得

1、利用高通量測(cè)序的方法，獲得了桑白粉病病原菌——桑生球針殼的rdna的its全長(zhǎng)，如seqidno.1所示。

2、根據(jù)測(cè)序結(jié)果的多次確認(rèn)，對(duì)桑生球針殼全rdna序列進(jìn)行了注釋，如表1所示，確定桑生球針殼的rdna各基因區(qū)段與轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置，its區(qū)段為its1、5.8srrna、its2，長(zhǎng)度為1801至2340。

表1桑生球針殼全rdna序列注釋

實(shí)施例2檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及pcr擴(kuò)增方法的建立

1、引物設(shè)計(jì)

在獲得桑球針殼菌rdna序列its區(qū)段全長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用ncbiprimerblast軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過(guò)大量的特異性和靈敏性檢測(cè)，最終選取了3對(duì)有代表性的引物組，引物序列如下：

1b1877f/1b2291r引物組

上游引物1b1877f(seqidno.2)：5’ctcccacccgtgtcgataaa3’

下游引物1b2291r(seqidno.3)：5’gactacacggagagcaccac3’

2b1802f/2b2303r引物組

上游引物2b1802f(seqidno.4)：5’-tgagcgtgaagactctcggt-3’

下游引物2b2303r(seqidno.5)：5’-tcgcgagaacgtgactacac-3’

3b1808f/3b2347r引物組

上游引物3b1808f(seqidno.6)：5’-tgaagactctcggtccccc-3’

下游引物3b2347r(seqidno.7)：5’-acagacgcacaggttgtctt-3’

2、pcr擴(kuò)增方法的建立

以病葉、枝條、土壤的總dna為模板，用實(shí)施例1所述的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

所述pcr反應(yīng)體系(總體積20μl)：

其中，2×taqmastermix(反應(yīng)緩沖液)的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。

pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

3、結(jié)果判斷

第一對(duì)引物1b1877f/1b2291r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到415bp的dna片段判定。當(dāng)能擴(kuò)增出415bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷樣品中存在桑球針殼菌。

第二對(duì)引物2b1802f/2b2303r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到502bp的dna片段判定樣品中是否含有桑球針殼菌存在。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出502bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷樣品中存在桑球針殼菌。

第三對(duì)引物3b1808f/3b2347r：pcr反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到540bp的dna片段判定樣品中是否含有桑球針殼菌存在。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出540bp的dna片段產(chǎn)物，即可判斷樣品中是否含有桑球針殼菌存在。

實(shí)施例3引物特異性檢測(cè)

1、分別以多種從白粉病病斑菌絲體中分離到的真菌和細(xì)菌，以及同為桑樹(shù)病原真菌的桑污葉病病原菌(pseudocercosporamori)和桑菌核病病原菌(ciboriacarunculoides)作為對(duì)照組，以實(shí)施例2的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

2、引物1b1877f/1b2291r的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖1所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(415bp)有條帶。

3、引物2b1802f/2b2303r的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖2所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(502bp)有條帶。

4、引物3b1808f/3b2347r的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖3所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(540bp)有條帶。

結(jié)果顯示，引物1b1877f/1b2291r，2b1802f/2b2303r，3b1808f/3b2347r均能夠特異檢測(cè)到桑球針殼菌的存在。而按照檢測(cè)條帶大小適中、引物特異性(無(wú)非特異性帶等)的原則，引物2b1802f/2b2303r和建立的pcr方法可以更好的用于桑假尾孢菌的快速檢測(cè)。

實(shí)施例4引物靈敏性檢測(cè)

1、提取桑假尾孢菌的dna，原始濃度為10ng/μl。

將上述dna用1×te進(jìn)行稀釋，分別稀釋10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍。即得到使用dna濃度梯度為10、1、1.0×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4ng/μl。

2、以上述各濃度的dna為模板，以引物，以實(shí)施例2的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

3、1b1877f/1b2291r引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖4所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(415bp)有條帶，且檢測(cè)dna濃度可達(dá)1.0×10^-3ng/μl。

4、2b1802f/2b2303r引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖5所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(502bp)有條帶，且檢測(cè)dna濃度可達(dá)1.0×10^-3ng/μl。

5、3b1808f/3b2347r引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖6所示。結(jié)果顯示，只有桑污葉病病原菌dna在目標(biāo)位置(540bp)有條帶，且檢測(cè)dna濃度可達(dá)1.0×10^-2ng/μl。

因此，綜上所述，從特異性和靈敏性的角度考慮，引物2b1802f/2b2303r既能夠特異性的檢測(cè)桑假尾孢菌，又具有很好的檢測(cè)靈敏性。

以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)引物2b1802f/2b2303r的檢測(cè)適用性和靈敏性進(jìn)行測(cè)試。

實(shí)施例5感染桑球針殼的桑葉與患病桑葉的病原菌檢測(cè)

1、材料的選定

選擇的實(shí)驗(yàn)材料，包括患病桑園的枝條，與無(wú)病的新鮮紙條；回感實(shí)驗(yàn)葉肉中有菌絲生長(zhǎng)的葉片，以及帶病斑的葉片等材料。

2、包含桑樹(shù)成分的材料總dna提取

使用鼎國(guó)植物基因組dna提取試劑盒(lot：69700110)進(jìn)行dna的提取，步驟如下：

選取含植物組織材料，使用液氮充分研磨至粉末；1.5ml離心管中加入800μl的lysisbuffer，并添加β-巰基乙醇至終濃度0.1％；加入液氮研磨后的粉末樣品，65℃恒溫金屬浴30分鐘至2小時(shí)；先使用500μl酚/氯仿/異戊醇振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入500μl氯仿，振蕩混勻5分鐘，后12000r/min離心10分鐘，取上清；加入700μl的bindingbuffer，混勻；吸取混合液于離心柱中，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的washingbuffera，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入700μl的washingbufferb，12000r/min離心1分鐘，棄濾液；加入500μl的washingbufferb，12000r/min，離心1分鐘，棄濾液；再次12000r/min離心2分鐘，棄濾液棄收集管；將離心柱裝入1.5ml離心管中，加入50μltebuffer，室溫放置3分鐘，12000r/min離心2分鐘；重復(fù)上一步驟，即獲得純度較高的總dna。

3、pcr檢測(cè)

以病葉的總dna為模板，用實(shí)施例1所述的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。對(duì)照組使用桑園其他的病害材料

所述pcr反應(yīng)體系(總體積20μl)：

其中，2×taqmastermix(反應(yīng)緩沖液)的組分為taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。

pcr反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

4、結(jié)果

首先利用現(xiàn)有的真菌通用引物對(duì)its1和its4，以及引物對(duì)its4和its5，對(duì)提取的病葉總dna進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，可知總dna中包含2種以上的dna。

利用引物2b1802f/2b2303r對(duì)相關(guān)的桑樹(shù)病害材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示，表明桑白粉病病葉中可檢測(cè)到與陽(yáng)性對(duì)照大小相符的502bp大小的條帶。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>桑生球針殼its序列及其在桑生球針殼分子檢測(cè)中的應(yīng)用

<130>

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>540

<212>dna

<213>桑生球針殼phyllactiniamoricola的its序列

<400>1

ctgagcgtgaagactctcggtcccccgccccattggtgcaagccagtgcgaggggggagc60

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<213>上游引物1b1877f

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<213>下游引物1b2291r

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<213>上游引物2b1802f

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<213>下游引物2b2303r

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<213>上游引物3b1808f

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tgaagactctcggtccccc19

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<213>下游引物3b2347r

<400>7

acagacgcacaggttgtctt20