專利名稱：白菜tt8基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(lán)(Brassica οleracea) ΤΤ8 (TRANSPARENT TESTA 8，透明種皮8 ；又稱bHLH42，BASIC HELIX-LOOP-HELIX 42，堿性螺旋-環(huán)-螺旋42)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜是由2個二倍體物種白菜和甘藍(lán)通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍(lán)型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍(lán)也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍(lán)型油菜的重要性狀之一。甘藍(lán)型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，與黑籽品系相比，餅粕的經(jīng)濟(jì)價值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍(lán)中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍(lán)型油菜黃籽基因型。已有的甘藍(lán)型油菜黃籽材料主要通過遠(yuǎn)緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負(fù)相關(guān)性狀難以克服等缺點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀成為甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進(jìn)行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機(jī)理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn)基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報(bào)道。類黃酮是植物的重要次生代謝物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，其中花青素苷(anthocyanin, AN)、原花青素(proanthocyanidin，PA)和黃酮醇是十字花科等植物器官表面著色的重要成分。蕓薹屬和擬南芥(Arabidopsis thaliana)同屬十字花科，具有較近的親緣關(guān)系。在擬南芥種皮中，原花青素主要積累在內(nèi)種皮和有顏色的合點(diǎn)區(qū)域，是種皮色素的核心成分。擬南芥TT8 (AtTT8)基因編碼一個bHLH型正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(AtbHLH42)，在積累有花青素苷和原花青素的細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)，TT2、TT8和TTGl形成一個轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，調(diào)控黃酮合成途徑的“晚期”結(jié)構(gòu)基因如DFR、BAN等的表達(dá)，從而調(diào)控原花青素、花青素苷、種皮粘液的積累。擬南芥《8突變體的種子顯示透明種皮即黃籽性狀。因此，在蕓薹屬中對TT8基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，是篩選甘藍(lán)型油菜黃籽位點(diǎn)的重要途徑，也可用于蕓薹屬物種中與原花青素、花青素苷、種皮粘液相關(guān)性狀的分子育種。
蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，5^Mbp)、甘藍(lán)(CC組，696Mbp)和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍(lán)型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍(lán)和白菜兩個基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍(lán)和白菜中可能分別有3個對應(yīng)的拷貝，而在甘藍(lán)型油菜中可能有6個拷貝。目前，TT8基因在甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性、黃籽等性狀的關(guān)系以及轉(zhuǎn)基因分子育種等都未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族成員的全長cDNA和對應(yīng)的基因組序列，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜TT8 (BrTTO)基因家族包括以下2個成員BrTT8_l基因和BrTT8_2基因；所述BrTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 4 所示；所述甘藍(lán)TT8(BoTT8)基因家族包括以下2個成員BoTT8_l基因和BoTT8_2基因；所述BoTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示；所述甘藍(lán)型油菜ΤΤ8(&ιΤΤ8)基因家族包括以下2個成員ΒηΤΤ8-1基因和ΒηΤΤ8-2基因；所述ΒηΤΤ8-1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BnTT8_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。進(jìn)一步，所述BrTT8-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT8_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoTT8-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示，BoTT8-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述&ιΤΤ8_1基因的基因組序列如SEQID No. 9所示，ΒηΤΤ8-2基因的基因組序列如SEQ IDNo. 11所示。上述3個物種的6條ΤΤ8基因之間具有很高的同源性，基因組序列的一致性為69. 7 99. 9%，mRNA —致性為85. 8% 99. 8%，編碼區(qū)的一致性為93. 2% 99. 9%，其中BnTT8-l基因與ΒοΤΤ8-1基因的一致性高達(dá)99. 9%，ΒηΤΤ8_2基因與BrTT8_l基因的一致性高達(dá)99. 1%。它們與AtTTS基因也具有很高的同源性，基因組序列的一致性為44. 2 52. 4%,mRNA的一致性為78. 0% 82. 1%，編碼區(qū)的一致性為80. 83. 6%。6個TT8基因編碼的蛋白之間具有很高的同源性，一致性為89. 6% 100%，相似性為90. 6% 100%，其中&1TT8-1蛋白與BoTT8-l蛋白的相似性和一致性均為99. 6%，BnTT8_2蛋白與BrTT8-l蛋白的相似性和一致性均為100%。它們與AtTT8蛋白也具有很高的同源性，一致性為71. 5 % 77. 2 %，相似性為77. 4 % 84. 1 %。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AtTT8先與BrTT8_2聚在一起，BnTT8-2先與BrTT8-l聚在一起，然后這兩個小類聚在一起；BnTT8_l與ΒοΤΤ8_1聚在一起，ΒοΤΤ8-2雖然單獨(dú)，但與ΒηΤΤ8-1與ΒοΤΤ8_1也很近。從基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、核酸序列同源性、氨基酸序列同源性、系統(tǒng)進(jìn)化等方面均表明，BnTTS-I基因起源于BoTTS-I基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8-l基因，且這6個TT8基因都是AtTT8基因的垂直同源基因。TT8基因家族主要在白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的生殖器官中表達(dá)，以發(fā)育中的種子表達(dá)最高，并隨著種子的發(fā)育進(jìn)程而逐漸下降。此外，TT8基因家族在白菜和甘藍(lán)型油菜的黑、黃籽材料間的總體表達(dá)存在著較明顯的差異，且不同的基因成員表現(xiàn)出不同的黑、黃籽差異表達(dá)模式，而TT8基因家族總體及其成員在甘藍(lán)黑、黃籽材料中的表達(dá)無明顯差異，說明TT8基因家族表達(dá)下調(diào)與白菜和甘藍(lán)型油菜的黃籽性狀有關(guān)，而TT8基因家族不是甘藍(lán)黃籽性狀的重要原因。基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BrTT8、BoTT8、&iTT8基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建TT8基因重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化體，用于TT8基因的正義表達(dá)、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進(jìn)一步，所述甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族在甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明將BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成員的全長cDNA序列分別插入PCAMBIA2301G載體中(插入片段由CaMV35S啟動子驅(qū)動，由Nos終止子終止轉(zhuǎn)錄)，構(gòu)建了正義植物表達(dá)載體 pBrTT8-l、pBrTT8-2、pBoTT8-2 和 pBnTT8_l，用 Flower Dip法將它們轉(zhuǎn)化擬南芥突變體(種子為透明種皮)，通過卡那霉素(Kan)抗性篩選得到了 BnTTS-I轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植株T2代種子的種皮顏色恢復(fù)了野生型的深褐色，證明甘藍(lán)型油菜等蕓薹屬的TT8基因具有與AtTTS基因?qū)?yīng)的功能。因此，本發(fā)明的TT8基因家族在種子性狀的分子育種中具有應(yīng)用價值。當(dāng)然，將甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族中任一種基因的基因組序列或全長cDNA序列正義插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間，都可以構(gòu)建正義植物表達(dá)載體。同時，本發(fā)明還選取&1TT8-1基因的部分編碼序列(如SEQ ID No. 10中第837 1653位堿基所示)，將其反義片段插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構(gòu)建了反義植物表達(dá)載體pBnTTSA，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜典型黑籽品種湘油15號，得到了抑制內(nèi)源&1TT8基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。研究發(fā)現(xiàn)，⑶S染色檢測呈陽性的反義轉(zhuǎn)基因植株收獲種子的顏色與對照相比有明顯變淺，雖然沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的金黃色性狀，但已比較接近黃籽。反義&1TT8轉(zhuǎn)基因后代植株的主體形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)基因的對照植株無明顯差異，但是轉(zhuǎn)基因種子普遍飽滿度下降，粒形偏離球形，千粒重由對照的3. 15g下降到2. 54go說明&1TT8基因除了參與調(diào)控種皮色素合成以外，還參與調(diào)控了一些其它種子性狀如種子大小，可用于蕓薹屬作物種皮顏色、種子大小等種子性狀的分子育種。當(dāng)然，將甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT8基因家族中任一種基因的全部或部分編碼序列反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間，都可以構(gòu)建反義植物表達(dá)載體。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 TT8基因在甘藍(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的組織特異性等，并確認(rèn)了 TT8基因家族表達(dá)下調(diào)與白菜和甘藍(lán)型油菜的黃籽性狀有關(guān)，由此本發(fā)明提供了 TT8基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍(lán)型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族5，cDNA末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳。圖2為BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族3，cDNA末端擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳。圖3為BrTT8、B0TT8和BnTT8基因家族成員全長cDNA的擴(kuò)增，其中A和B分別為 FBnTT816+RBrTT819、FBnTT816+RBrTT821 擴(kuò)增 BrTT8 基因家族全長 cDNA ；C 和 D 分別為 FBoTT8+RBoTT8-l、FBoTT8+RBoTT8_2 擴(kuò)增 BoTT8 基因家族全長 cDNA ；L· 禾口 F 分別為FBoTT8+RBoTT8-l、FBrTT8+RBrTT8-l 擴(kuò)增 BnTT8 基因家族全長 cDNA。圖4為BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成員及AtTT8基因mRNA的核苷酸序列比對。圖5為&iTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成員及AtTT8基因的聚類分析。圖6為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成員的Southern雜交鑒定。圖7為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族蛋白及AtTT8蛋白的氨基酸序列比對。圖8為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族編碼蛋白與其它植物TT8蛋白的聚類分析。圖9為RT-PCR檢測&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族總體和各成員在不同組織器官中的表達(dá)。圖10為RT-PCR檢測&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族總體和各成員在黑、黃籽近
等基因系生殖器官中的表達(dá)。圖11為pCAMBIA2301G正義植物表達(dá)載體中T-DNA區(qū)域中的表達(dá)元件。圖12為ρΒηΤΤ8-1載體轉(zhuǎn)化擬南芥tt8突變體T1代轉(zhuǎn)化子的篩選，其中A為T1代植株的Kan抗性篩選，B為Kan抗性的T1代植株苗期，C為Kan抗性的T1代植株初花期。圖13為Kan抗性的擬南芥T1代植株的⑶S染色鑒定。圖14為擬南芥野生型種子(A)、BnTTS-I轉(zhuǎn)化擬南芥tt8突變體后的T2代種子(B)、擬南芥tt8突變體種子(C)。圖15為反義植物表達(dá)載體p&iTT8A構(gòu)建過程中的電泳檢測，其中A為從pMD18_T上酶切BnTT8A，B為從pCAMBIA2301G上切下1. 9kb的GUS基因，C為pBnTT8A的檢測。圖16為反義植物表達(dá)載體ρΒηΤΤ8Α的T-DNA區(qū)段圖。圖17為Ρ&1ΤΤ8Α轉(zhuǎn)化湘油15后的部分再生抗Kan植株。圖18為p&iTTSA轉(zhuǎn)化湘油15后(右)與對照(左)的葉片⑶S染色。圖19為p&iTTSA轉(zhuǎn)化湘油15后各T3株系的種子(CK為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
優(yōu)選實(shí)施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp.oleifera)，包括典型黑籽系06K130和黃籽系06K1M ；甘藍(lán)材料均來自于羽衣甘藍(lán)變種(B. oleracea var. acephala)，包括典型黑籽系06K158和黃籽系06K165 ；甘藍(lán)型油菜材料包括典型黑籽系5B、黑籽品種湘油15號、籽色近等基因系黑籽系Ll和黃籽系L2，均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供，大田常規(guī)種植。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要試劑及試劑盒Taq DNA聚合酶(5U/ μ 1)購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λ-HindIII digest DNA Marker和DL_2000pIusMarker、LATaq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)、pMD18_T 載體試劑盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3· O 購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRV等購自美國New EnglandBiolabs公司；限制性內(nèi)切酶Mel等、T4DNA連接酶(lOU/μ 1)購自立陶宛MBI Fermentas公司；MS 基本培養(yǎng)基(Murashige&Skoog medium, including vitamins)購自荷蘭 DuchefaBiochemie公司；柱式小量植物組織RNA抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit購自美國hvitrogen公司，Southern雜交與檢測的試劑(盒)、尼龍膜購自德國Roche公司。優(yōu)選實(shí)施例采用的主要儀器PTC-200Programmable Thermal Controller PCR儀購自美國MJ Research公司，UVP HL-2000雜交紫外交鏈儀購自美國UVP公司，其它均為分子生物與學(xué)基因工程常用儀器?！⒏仕{(lán)型油菜及其親本物種白菜和甘藍(lán)TT16基因家族的克隆1、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍(lán)型油菜5B、白菜06K130和甘藍(lán)06K158的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的231Λ條帶，RNA消化比較完全，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴(kuò)增及Southern雜交。2、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的白菜06K130、甘藍(lán)06K158、甘藍(lán)型油菜5B的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、開花后10天的種子(IOD)、開花后20天的種子(20D)、開花后30天的種子(30D)和莢果皮(SP)共11個器官；以及大田常規(guī)條件下栽培的白菜06K1M、甘藍(lán)06K165，甘藍(lán)型油菜Ll和L2的蕾、花以及發(fā)育不同階段的種子(甘藍(lán)型油菜取10D、20D和30D的種子；白菜和甘藍(lán)取IOD和30D的種子)等主要生殖器官；采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質(zhì)量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個物種的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜RACE第一鏈cDNA的獲得分別取白菜06K130、甘藍(lán)06K158、甘藍(lán)型油菜5B的蕾、花、10D、20D、30D種子的總
RNA混合，采用GeneRacer Kit按其說明書進(jìn)行一系列的RACE操作，分別獲得白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA (3’端和5’端同時錨定有人工接頭序列)，PCR放大后進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，3個物種的總cDNA呈現(xiàn)出大小在200bp 101Λ的拖帶，重心區(qū)域在500bp 41Λ之間，最核心區(qū)在1. 5kb左右，說明反轉(zhuǎn)錄完全，得到了高質(zhì)量的RACE總cDNA，可用于克隆白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜TT8基因家族完整的cDNA末端。4、白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜TT8基因家族5，cDNA末端的克隆采用Vector NTI Suite 9. 0 對來自擬南芥(NM_1170502，AJ277509)、牽?；?Ipomoeatricolor) (AB154370)、百合(Lilium) (AB222076)、紫花牽牛(Ipomoea purpurea)(AB154369)、矮牽牛(Ipomoea nil) (AB232775)的TT8或編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列進(jìn)行多重比對，針對5’和3’末端的最保守區(qū)域設(shè)計(jì)了 2個正向引物(FTT8-3和FTT8-3N)和2個反向引物(RTT8-5和RTT8-5N)(表1)作為擴(kuò)增白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜TT8基因家族成員cDNA末端的特異引物。分別以白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜第一鏈cDNA為模板，用引物組合5，P+RTT8_5進(jìn)行5，cDNA末端的 RACE—擴(kuò)。50μ 1 標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴(kuò)增體系為10XPCR Buffer 5 μ l,25mmol/L 的 MgCl23y l,10mmol/L 的 dNTPs 1μ l,10ymol/L 的正向引物 1μ l,10ymol/L 的反向引物1 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板2 μ 1，加雙蒸水至總體積為50 μ 1。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。再以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，用引物組合5，NP+RTT8-5N進(jìn)行5，cDNA末端的RACE巢擴(kuò)，PCR擴(kuò)增體系與一擴(kuò)相同但模板改為0. 1 μ 1，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，56°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共28個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測，BrTTS獲得了一條600bp左右的寬帶，BoTT8獲得了一條^Obp的條帶，BnTT8獲得了一條350-550左右的很亮的寬帶(圖1)。采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與PMD18-T載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培養(yǎng)至藍(lán)白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，每個物種挑選多個代表性單克隆子委托上海英竣生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。表15’和3’ RACE中的基因特異引物(GSP)和GeneRacer試劑盒引物
權(quán)利要求
1.白菜TT8基因家族，其特征在于，包括以下2個成員BrTT8-l基因和BrTT8-2基因；所述BrTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 4 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白菜TT8基因家族，其特征在于，所述BrTTS-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT8-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的白菜TT8基因家族中任一種或多種基因或基因保守片段的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為正義植物表達(dá)載體，是將白菜TT8基因家族中任一種基因的基因組序列或全長cDNA序列正義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間而得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為反義植物表達(dá)載體，是將白菜TT8基因家族中任一種基因的全部或部分編碼序列反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間而得到。
6.含有權(quán)利要求3至5任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體為微生物。
7.權(quán)利要求1或2所述的白菜TT8基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用，所述種子性狀為種皮顏色和種子大小。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述蕓薹屬作物為甘藍(lán)型油菜。
全文摘要
本發(fā)明公開了白菜TT8基因家族，包括BrTT8-1基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.2所示)和BrTT8-2基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.4所示)二個成員，該基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種皮顏色和種子大小等種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/82GK102559701SQ20121001850
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者張瑞熙, 李加納, 林吶, 柴友榮, 殷家明, 肖霞, 許本波, 謝伶俐, 趙文軍 申請人:西南大學(xué)