專利名稱：白菜aha10基因家族及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及甘藍型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(Brassica oleracea) AHAlO (autoinhibited H+-ATPase 10，自抑制H+-ATP酶10)基因家族及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養(yǎng)價值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業(yè)提供飼料，具有重要的經(jīng)濟價值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍型油菜是由2個二倍體物種白菜和甘藍通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產(chǎn)量僅次于大豆。白菜和甘藍也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍功能基因的比較基因組學(xué)研究將為揭示它們之間的遺傳進化關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應(yīng)用基礎(chǔ)。籽粒顏色是甘藍型油菜的重要性狀之一。甘藍型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅柏蛋白含量高等優(yōu)點，與黑籽品系相比，餅柏的經(jīng)濟價值和油的品質(zhì)都有所提高。雖然白菜和甘藍中均存在表型穩(wěn)定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍型油菜黃籽基因型。已有的甘藍型油菜黃籽材料主要通過遠緣雜交等方式而創(chuàng)造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩(wěn)定，易受環(huán)境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負相關(guān)性狀難以克服等缺點，遠遠不能滿足生產(chǎn)要求。因此，獲得穩(wěn)定遺傳的甘藍型油菜黃籽性狀成為甘藍型油菜育種的重要目標(biāo)。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機理仍不清楚，更沒有通過轉(zhuǎn)基因分子育種創(chuàng)造黃籽性狀的任何報道。蕓薹屬和擬南芥(Arabidopsis thaliana)同屬十字花科,具有較近的親緣關(guān)系。 原花青素(proanthocyanidin, PA)是形成甘藍型油菜黑籽顏色的基礎(chǔ),在黃籽種皮中明顯降低。擬南芥AHAlO (AtAHAlO)基因參與了種皮中原花青素的聚合，也影響著早期種皮細胞中液泡的發(fā)育。在擬南芥ahalO突變體中，雖然花青素(anthocyanidin)能在種皮中正常的積累，但原花青素的積累量只有非突變體的百分之一，這表明質(zhì)膜H+-ATPase參與了原花青素在種皮細胞中的代謝，特別是在原花青素的聚合過程中起著重要的調(diào)控作用。AtAHAlO 基因的突變同樣使得突變體種子的種皮呈現(xiàn)出透明種皮的特性。在正常的擬南芥種子發(fā)育早期，種皮內(nèi)層細胞中能觀察到較大的液泡，而在擬南芥ahalO突變體中只能看到一些較小的液泡，但隨著種皮的逐漸成熟，這些差別會隨之消失，表明該基因的突變導(dǎo)致了液泡發(fā)育的延遲。因此，在蕓薹屬中對AHA10基因進行同源克隆和功能鑒定，將有助于揭示甘藍型油菜種皮色素和早期種皮細胞中液泡發(fā)育的分子機理，是篩選甘藍型油菜黃籽位點的重要途徑。蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發(fā)生分離，蕓薹族植物發(fā)生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，529Mbp)、甘藍(CC組，696Mbp) 和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當(dāng)于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當(dāng)于甘藍和白菜兩個基因組之和，約相當(dāng)于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍和白菜中可能分別有3個對應(yīng)的拷貝，而在甘藍型油菜中可能有6個拷貝。目前，除AtAHAlO基因外，尚無其它植物的AHAlO 基因被克隆，對AHAlO基因的研究報道較少，而AHAlO基因在甘藍型油菜、白菜、甘藍等蕓薹屬物種中的成員數(shù)、蛋白特征、進化關(guān)系、表達的組織特異性及與黃籽性狀的關(guān)系、轉(zhuǎn)基因分子育種等都未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍 AHAlO基因家族。為達到上述目的，本發(fā)明采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)，分別克隆了甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍AHAlO基因家族成員的全長cDNA和對應(yīng)的基因組序列，并進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示所述白菜AHAlO (BrAHAlO)基因家族包括以下2個成員BrAHA10_l基因和 BrAHA10-2基因；所述BrAHAlO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrAHA10_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 4所示；所述甘藍AHAlO (BoAHAIO)基因家族包括以下2個成員ΒοΑΗΑ10_1基因和 ΒοΑΗΑ10-2基因；所述BoAHAIO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoAHA10_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 8所示；所述甘藍型油菜AHAlO (BnAHAlO)基因家族包括以下2個成員BnAHA10_l基因和 BnAHA10-2 基因；所述 BnAHAlO-I 基因的全長 cDNA 序列如 SEQ ID No. 10 所示，BnAHA10-2 基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。進一步，所述BrAHAlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. I所示，BrAHA10_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoAHAIO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所不，BoAHA10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所不；所述BnAHAlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 9所示，BnAHA10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 11所示。上述3個物種的6條AHAlO基因與AtAHAlO基因具有較高的同源性，基因組序列一致性為72. 4 74. I %，編碼區(qū)序列一致性為89. 6 90. 6 % ;6條AHAlO基因之間也具有很高的同源性，基因組序列一致性為85. O 99. 8%，編碼區(qū)序列一致性為95. 7 99. 9%。 核酸水平和氨基酸水平的序列比對、系統(tǒng)發(fā)生聚類等表明，6條AHAlO基因都是AtAHAlO 基因的垂直同源基因，具有相似的結(jié)構(gòu)特征；其中BnAHAlO-I基因起源于BoAHAIO-I基因，BnAHA10-2基因起源于BrAHA10_2基因。半定量RT-PCR檢測表明，BnAHAlO, BrAHAlO, BoAHAIO基因家族具有類似AtAHAlO基因的轉(zhuǎn)錄特征，都是在早期發(fā)育中的種子中表達豐度最高；此外，AHAlO基因在白菜、甘藍、甘藍型油菜黑籽與黃籽材料的生殖器官中的表達存在著較明顯的差異，AHAlO基因表達顯著下調(diào)是蕓薹屬黃籽性狀的重要成因。
基于上述結(jié)果，利用本發(fā)明的BnAHAlO、BrAHAlO、BoAHAIO基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構(gòu)建AHAlO基因重組表達載體和轉(zhuǎn)化體，用于AHAlO基因的正義表達、反義抑制、RNA干擾等。本發(fā)明的目的之二在于提供所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍AHAlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用。進一步，所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍AHAlO基因家族在甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用。為達到上述目的，本發(fā)明選取甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍AHAlO基因家族特異保守片段BAHA10I (核苷酸序列如SEQ ID No. 10中第2768 3028位堿基所示) 為RNA干擾片段，以基于pFGC5941改造的植物RNA干擾基礎(chǔ)載體pFGC5941M為骨架，將 BAHA10I片段分別以反義和正義方式同時插入pFGC5941M的CaMV35S啟動子和OCS終止子之間形成反向重復(fù)序列，構(gòu)建了蕓薹屬AHAlO基因家族RNA干擾載體pFGC5941M_BAHA10I， 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸侵染法轉(zhuǎn)化了甘藍型油菜典型黑籽品種中雙10號，所得陽性轉(zhuǎn)基因植株和種子的性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默BnAHAlO基因家族后，轉(zhuǎn)基因種子多數(shù)呈黃棕色和紫黃色，少數(shù)呈金黃色，與非轉(zhuǎn)基因種子的典型黑籽形成鮮明對比。轉(zhuǎn)基因后代植株的主體形態(tài)特征與非轉(zhuǎn)基因的對照植株無明顯差異，但是轉(zhuǎn)基因種子普遍偏小，飽滿度偏低。說明在甘藍型油菜等植物中，AHAlO基因除了參與調(diào)控種皮色素合成以外，還參與調(diào)控了一些其它種子性狀如種子大小，可以應(yīng)用于蕓薹屬作物種子性狀的分子育種，尤其是甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種，利于創(chuàng)造出新型的甘藍型油菜黃籽材料，也可以超量表達后用于增加種子的大小，提高種子千粒重。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了 AHAlO基因在甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍中的成員數(shù)、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進化關(guān)系、表達的組織特異性等，并確認了 AHAlO基因表達顯著下調(diào)是蕓薹屬黃籽性狀的重要成因，由此本發(fā)明提供了 AHAlO基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應(yīng)用，應(yīng)用前景好。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中圖I為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族5’cDNA末端擴增的瓊脂糖凝膠電泳。圖2為BrAHAlO、BoAHAIO、BnAHAlO基因家族3’cDNA末端擴增的瓊脂糖凝膠電泳。圖3為BrAHAlO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴增結(jié)果，其中A為 BrAHA I O-ImRNA，B 為 BrAHAlO-I (I)和 BrAHA 10-2 ⑵ gDNA。圖4為BoAHAIO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴增結(jié)果，其中A為 BoAHA I O-ImRNA，B 為 BoAHA10_2mRNA，C 為 BoAHA I O-1 (I)和 BoAHA 10-2 (2) gDNA。圖5為BnAHAlO基因家族全長cDNA和基因組DNA的擴增結(jié)果，其中A為 BnAHA I O-ImRNA，B 為 BnAHA10_2mRNA，C 為 BnAHAlO-I (I)和 BnAHA 10-2 ⑵ gDNA。圖6為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族及AtAHAlO基因mRNA的序列比對。圖7為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族與擬南芥AHA基因家族mRNA的聚類分析。圖8為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO家族蛋白及AtAHAlO蛋白的氨基酸序列比對。圖9為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO家族蛋白與擬南芥AHA家族蛋白的聚類分析。圖10為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖11為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成員的Southern雜交鑒定，其中M 為地高辛標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖12為BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族總體和成員組織器官特異性表達檢測。圖13為白菜、甘藍、甘藍型油菜黑籽、黃籽材料主要生殖器官中AHA10基因家族總體和各成員的表達。圖14為RNA干擾載體pFGC5941M_BAHA10I的元件圖。圖15為RNA干擾片段BAHA101的PCR擴增。圖16為涉及反義片段插入的酶切和中間載體單克隆的PCR檢測，其中，I為 PMD19-T-BAHA10I 的 Ncol+Aatll 雙酶切；2 為 pFGC5941M 的 Ncol+Aatll 雙酶切，3、4 為 PFGC5941M-BAHA10IA 單克隆用引物組合 F35S3N+FBnAHA10I、RBnAHA10I+RBnPAP2I2 檢測，M 為 Marker (1、3、4 為 DL2000plus，2 為 λ -HindIII 與 DL2000plus 的混合物)，CK 為未酶切的質(zhì)粒。圖17為涉及正義片段插入的酶切和RNA干擾載體單克隆的PCR檢測，其中， I 為 pMD19-T-BAHA10I 的 BamHI+Xbal 雙酶切；2 為 pFGC5941M_BAHA10IA 的 BamHI+Xbal 雙酶切，3、4、5、6 為 pFGC5941M-BAHA10IA 單克隆用引物組合 FBnPAP2I2+RBAHA10I、 R0CST5N+FBAHA10I、F35S3N+RBnPAP2I2、FBnPAP2I2+R0CST5N 檢測，M 為 Marker，CK 為未酶切的質(zhì)粒。圖18為再生植株的Basta復(fù)檢鑒定，其中A為陰性植株對照，B為陽性植株。圖19為RNA干擾載體pFGC5941M-BAHA10I轉(zhuǎn)基因油菜的PCR擴增結(jié)果，其中I為陽性菌液對照，2為陰性植株對照，3 10為轉(zhuǎn)基因植株。圖20為非轉(zhuǎn)基因植株㈧和轉(zhuǎn)基因植株⑶的種皮顏色比較。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。優(yōu)選實施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp. oleifera)，包括黑籽系09L597和黃籽系09L600 ;甘藍材料均來自于羽衣甘藍變種 (B. oleracea var. acephala)，包括黑桿系09L598和黃桿系09L599 ;甘藍型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黃籽系09L587)，均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心選育，大田常規(guī)種植，并經(jīng)過了 10代以上的單花序套袋自交；甘藍型油菜黑籽品種中雙10號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所選育，種子由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。優(yōu)選實施例采用的主要試劑及試劑盒=Easy-Taq DNA聚合酶(5U/ μ I)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，LA Taq DNA聚合酶(5U/μ I)、λ -HindIII DNA marker、RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3. O 購自寶生物工程(大連)有限公司，DraI (40U/μ I)、EcoRI、EcoRV、 HindIII,XbaI (lOU/μ I)、尼龍膜、地高辛標(biāo)記的DNA marker、pMD19_T載體連接試劑盒、PCR DIG Probe Synthesis Kit、DIG Easy Hyb、DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit 購自德國 Roche 公司，MS (Murashige and Skoog medium)培養(yǎng)基購自荷蘭Duchefa公司，結(jié)冷膠購自浙江中肯生物科技有限公司，小量植物組織RNA抽提試劑盒 (W7021)購自上海華舜生物工程有限公司，小量膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自杭州博日生物工程有限公司，pGEM-T easy載體連接試劑盒購自美國Promega公司，GeneRacer Kit購自美國Invitrogen公司。改進型植物RNA干擾基礎(chǔ)載體pFGC5941M是在pFGC5941 的基礎(chǔ)上改進而成，改進之處是采用來自甘藍型油菜的BnPAP2基因第2內(nèi)含子(BnPAP2I2) 替換了 PFGC5941上過長的PhChsA間隔區(qū)，并在間隔區(qū)與啟動子間增加了一個AatII切點。一、甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍AHAlO基因家族的克隆I、甘藍型油菜、白菜和甘藍基因組總DNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質(zhì)量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，提取的3個物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于λ-HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA消化徹底，純度較高，可以用于PCR擴增和Southern雜交。2、甘藍型油菜、白菜和甘藍各器官總RNA的提取取大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4個發(fā)育階段的種子[甘藍型油菜和甘藍取開花后15天(1 )、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的種子;白菜取開花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的種子];以及大田常規(guī)條件下栽培的甘藍型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘藍 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾、 花、莢果皮(SP)以及4個發(fā)育階段的種子(甘藍型油菜和甘藍取iro、30D、4 和55D的種子；白菜取10D、2 、40D和4 的種子)共12個器官；采用小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質(zhì)量和濃度。I. 0%瓊脂糖凝膠電泳顯示，獲得的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經(jīng)分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、甘藍型油菜、白菜和甘藍RACE第一鏈cDNA的獲得分別取甘藍型油菜5B、白菜09L597和甘藍09L598的蕾、花和4個發(fā)育階段的種子的總RNA混合成總量為5 μ g的RNA樣品，采用GeneRacer Kit按其說明書進行一系列的 RACE操作，最終反轉(zhuǎn)錄獲得在3’端和5’端同時錨定有人工接頭序列的第一鏈cDNA，PCR放大后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，反轉(zhuǎn)錄比較完全，三個物種均得到了較高質(zhì)量的總cDNA，可用于克隆甘藍型油菜、白菜和甘藍AHAlO基因家族完整的cDNA末端。4、甘藍型油菜、白菜和甘藍AHAlO基因家族5’ cDNA末端的克隆 根據(jù)AtAHAlO序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計了對應(yīng)于兩個最保守點的反向引物RA 通105_1(5’ -ccagttacatctgtactgtccac-3 )和狀通105-2(5’ -cccttcttcttggtcacaggta g_3’)。分別以甘藍型油菜、白菜、甘藍第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物5，P(5’ -cgactggagcacgaggacac-tga-3’ )與 RAHA105-1 配對，進行 5’ cDNA 末端的 RACE — 擴。50 μ I 標(biāo)準(zhǔn) Taq PCR 擴增體系為10 X PCR Buffer 5. O μ 1，25mmol/L 的 MgCl23. O μ 1， 10mmol/L 的 dNTPs I. O μ 1，10 μ mol/L 的正向引物 I. O μ 1，10 μ mol/L 的反向引物 I. O μ 1， 5U/ μ I的Taq酶0. 5 μ I，模板O. 5 μ I，加無菌水至總體積為50 μ I。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為 94°C預(yù)變性2分鐘；再94°C變性I分鐘，52 °C退火I分鐘，72 °C延伸I分鐘，共30個循環(huán)； 最后72°C延伸10分鐘。以一擴產(chǎn)物為模板，用GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP(5’-ggacactgacatggactg aagg-agta-3’)與RAHA105-2配對，進行5’ cDNA末端的RACE巢擴，PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與一擴相同，但模板改為O. I μ 1，退火溫度改為56°C。PCR產(chǎn)物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，采用小量膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，與PGEM-T easy載體連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培養(yǎng)至藍白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，取菌液進行PCR鑒定，結(jié)果陽性克隆子表現(xiàn)出明顯的長度多態(tài)性，各挑選10個具有代表性的陽性克隆子委托上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果表明=BrAHAlO基因的5’cDNA末端介于691 906bp之間，BoAHAlO基因的5’ cDNA末端介于723 856bp之間，BnAHAlO基因的5’ cDNA末端介于730 800bp之間。NCBI BLASTn表明，這些5’ cDNA末端與AtAHAlO 基因(NM_101587. 2)具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬AHAlO基因家族的5’cDNA 末端。5、甘藍型油菜、白菜和甘藍AHAlO基因家族3’ cDNA末端的克隆根據(jù)AtAHAlO序列多重比對的結(jié)果，設(shè)計了對應(yīng)于兩個最保守點的正向引物FA HA103_1(5， -gtaacacgtagtcgaagctggtc-3，)和 FAHA103_2(5， -aacgtcccgggactctcctga t_3’)。分別以甘藍型油菜、白菜、甘藍第一鏈cDNA為模板，用GeneRacer Kit提供的引物3 ，P(5，-gctgtcaacgatacgctacgt_aacg_3，)與 FAHA103-1 配對，進行 3，cDNA 末端的 RACE — 擴。PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE —擴相同。以一擴產(chǎn)物為模板,用GeneRacer Kit 提供的引物 3’NP (5’_cgctacgtaacggcatga cagtg-3’)與FAHA103-2配對，進行3’ cDNA末端的RACE巢擴，PCR擴增體系和擴增循環(huán)參數(shù)與5’ cDNA末端的RACE巢擴相同。PCR產(chǎn)物如前法所述進行電泳檢測(圖2)、膠回收、 T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。測序結(jié)果表明BrAHAlO基因的3’ cDNA末端介于661 697bp之間，BoAHAlO基因的3’ cDNA末端介于625 686bp之間，BnAHAlO基因的3’ cDNA末端介于650 704bp之間[均不包括 poly(A)]。NCBI BLASTn表明，這些3’ cDNA末端與AtAHAlO基因具有很高的一致性，表明它們的確為蕓薹屬AHA10基因家族的3’ cDNA末端。6、甘藍型油菜、白菜和甘藍AHA10基因家族成員全長cDNA及基因組DNA的克隆根據(jù)所獲得的甘藍型油菜、白菜和甘藍AHA10基因家族5’ cDNA和3’ cDNA末端序列，設(shè)計了 7條正向引物和6條反向引物(表I)，將其兩兩組合共得到42對引物組合；分別以甘藍型油菜、白菜、甘藍第一鏈cDNA為模板，采用上述引物組合和50 μ I標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR 擴增體系，擴增甘藍型油菜、白菜和甘藍ΑΗΑ10基因家族各成員的全長cDNA，PCR擴增循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性2分鐘，再94°C變性I分鐘、60°C退火I分鐘、72°C延伸4分鐘，共35 個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；分別以甘藍型油菜、白菜、甘藍基因組總DNA為模板，采用上述引物組合和50 μ I標(biāo)準(zhǔn)Taq PCR擴增體系進行相同PCR，擴增甘藍型油菜、白菜和甘藍 AHAlO基因家族各成員的基因組DNA ;再如前法所述進行電泳檢測、膠回收、T載體克隆、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞、陽性克隆子篩選、菌液PCR鑒定和測序。
表I BrAHAlO、BoAHAlO、BnAHAlO基因家族成員全長cDNA及基因組DNA的擴增引物
權(quán)利要求
1.白菜AHAlO基因家族，其特征在于包括以下2個成員BrAHA10-l基因和BrAHA10-2 基因；所述BrAHAlO-I基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrAHA10-2基因的全長 cDNA序列如SEQ ID No. 4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白菜AHAlO基因家族，其特征在于所述BrAHAlO-I基因的基因組序列如SEQ ID No. I所示，BrAHA10-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示。
3.權(quán)利要求I或2所述白菜AHAlO基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應(yīng)用，所述種子性狀為種皮成熟轉(zhuǎn)色和種子大小。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述蕓薹屬作物種子性狀的分子育種為甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了白菜AHA10基因家族及其應(yīng)用，該基因家族包括二個成員BrAHA10-1基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.2所示)和BrAHA10-2基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.4所示)；該基因家族可應(yīng)用于蕓薹屬作物種皮成熟轉(zhuǎn)色和種子大小等種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/84GK102586275SQ20121001852
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者馮瑜, 唐章林, 李加納, 柴友榮, 殷家明, 王瑞, 諶利, 趙文軍, 陳艷 申請人:西南大學(xué)