專利名稱：一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ProWOX11a及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子 ProWOXl Ia及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
扦插作為林木無性繁殖的重要手段，不僅簡單易行、效高價(jià)廉，而且能保持母株的優(yōu)良性狀、提早開花結(jié)實(shí)。20世紀(jì)70年代以來，隨著無性系林業(yè)的興起，林木扦插技術(shù)日益成熟，廣泛應(yīng)用。在林業(yè)生長實(shí)踐中，通常所說的扦插，一般指硬枝扦插或嫩枝扦插，其關(guān)鍵是不定根的形成首先是薄壁細(xì)胞或維管束細(xì)胞脫分化形成特定細(xì)胞群，即分生點(diǎn)-根原始體，而后分生細(xì)胞逐漸向活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)變并且開始分裂，新產(chǎn)生的細(xì)胞群逐漸形成錐狀體并分化成木質(zhì)部和韌皮部，繼而與插穗的輸導(dǎo)組織結(jié)合在一起，漸漸地根原基穿過皮層和表皮向外突出形成不定根(Haissig 1974a)。有些樹種不定根原始體在發(fā)育早期未離體時(shí)就已經(jīng)產(chǎn)生，即潛伏根原始體。扦插前它一直處于休眠狀態(tài)，直至插穗離體后在適宜的環(huán)境條件下繼續(xù)發(fā)育成根原基產(chǎn)生不定根。但也有一些樹種是在扦插后才分化出根原始體，稱為誘發(fā)根原始體。林木扦插生根按其形成的時(shí)間、部位和機(jī)制可分為皮部生根型、愈傷生根型和混合生根型三大類。皮部生根型植物在插穗離體前或經(jīng)過貯藏，激素處理后，插穗皮層、形成層等組織就有根原始體形成，扦插后，只是根原始體的繼續(xù)生長發(fā)育。愈傷組織生根型是在插穗扦插后從下切口愈傷組織內(nèi)的再生維管形成層處，或在切口處的原維管形成層產(chǎn)生愈傷組織的同時(shí)，也產(chǎn)生不定根原始體，進(jìn)而形成不定根?；旌仙愋褪侵讣扔衅げ可?又有愈傷組織生根；其過程是扦插后，先是皮部生根來吸收水分和養(yǎng)分以維持生命，待下切口愈傷組織生根后，皮部產(chǎn)生的不定根有的很快衰亡，有的退居次要，而由愈傷組織產(chǎn)生的不定根發(fā)育成植株的主要根系。林木扦插生根是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，國內(nèi)外學(xué)者對其機(jī)理進(jìn)行了大量研究，但這些工作都局限于解剖學(xué)和生理學(xué)領(lǐng)域，對扦插生根分子機(jī)理的認(rèn)識和了解比較缺乏。一方面在于林木分子遺傳學(xué)起步較晚；再者，由于林木自身的一些生物學(xué)特性，在林木中精確定位與克隆未知基因一度被視為遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的難點(diǎn)。楊樹全基因組測序完成， 克隆和驗(yàn)證楊樹生長發(fā)育相關(guān)基因成為可能。WOX基因家族在根尖干細(xì)胞維持、不定根根原基啟動等過程中起著非常重要的作用。在楊樹中克隆和鑒定不定根特異表達(dá)啟動子，不僅可豐富植物根系分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ)，而且在植物無性繁殖和離體器官再生方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。植物基因工程中常用的啟動子有3類組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。組織特異性啟動子是指在這類啟動子調(diào)控下，基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官或組織中。這類啟動子中一般同時(shí)存在幾種控制組織特異性表達(dá)的元件，其表達(dá)特異性由這些元件的種類、數(shù)目及相對位置等共同決定。在楊樹中尚未有克隆和鑒定不定根特異表達(dá)啟動子的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla。本發(fā)明的另一目的是提供一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子 ProffOXlla 的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla，其氨基酸序列如SEQ NOl所示。含有楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla的載體。所述載體在ftx)W0Xlla啟動子的3’端組裝GUS報(bào)告基因。所述載體組裝Bial基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，可以用除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的篩選。所述載體組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的 ProffOXlla啟動子表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因Bial整合至植物受體細(xì)胞染色體中。含有楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla的宿主細(xì)胞。楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftx)WOXlla在調(diào)控基因在植物體根原基及根尖分生組織特異表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明以南林895 楊(PopulusXeuramericana cv. ‘Nanlin895，)DNA 為材料，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出啟動子I^roWOXlla序列。采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建植物啟動子表達(dá)載體pBGGUS-ProWOXlla，該啟動子序列后接⑶S報(bào)告基因，在啟動子ftx)W0Xlla的驅(qū)動下，報(bào)告基因⑶S可在植物體根原基及根尖分生組織處特異表達(dá)。有益效果本發(fā)明通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將ftOWOXlla啟動子轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)ftOWOXlla 啟動子載體的T2代擬南芥植株GUS染色結(jié)果顯示，GUS基因在側(cè)根原基及根尖分生組織均特異表達(dá)，因此，應(yīng)用本發(fā)明提供的啟動子，可以在植物基因工程中，誘導(dǎo)相應(yīng)目的基因在根原基和根尖分生組織中特異表達(dá)。


圖1是植物表達(dá)載體pBGGUS的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2和圖5是野生型植株⑶S染色圖；圖3、圖4和圖6是轉(zhuǎn)基因植株⑶S染色圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例所使用的主要試劑盒和藥品為Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN), LR Clonase II enzyme Mix (Invitrogen), pCR 8/Gff/T0P0 vector (Invitrogen), TaKaRa LA Taq(TaKaRa)，TaKaRa Taq(TaKaRa) ,pMD-19T(TaKaRa) ,H. Q. &Q. Gel Extraction kit II(安徽優(yōu)晶生物工程有限公司)，所有引物合成及測序工作均(上海)完成。其他未作出說明的均為常規(guī)要求。實(shí)施例1提取南林895楊DNA可采用常規(guī)方法提取南林895楊DNA，也可以采用TIANGEN公司的植物基因組DNA 提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit)來提取南林895楊DNA，操作步驟稍有改進(jìn)
吸取ImL緩沖液GPl于2mL離心管中，65°C預(yù)熱；同時(shí)，取南林895楊組培苗葉片 IOOmg于液氮中充分研磨；分裝65°C預(yù)熱GPl緩沖液；將研磨精細(xì)的樣品粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的ImLGPl緩沖液中(加樣前在預(yù)熱的ImL緩沖液GPl中加入10 μ L β -巰基乙醇)，劇烈顛倒混勻后65°C水浴20min ；加入ImL氯仿，充分混勻，12000rmp離心5min后轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管中；重復(fù)該步驟一次；向裝有上層水相的離心管中加入ImL緩沖液GP2， 充分混勻；將混合液轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rmp離心30sec，棄濾液；向吸附柱CB3中加入500 μ L去蛋白液⑶，12000rmp離心30sec，棄濾液；向吸附柱CB3中加入700 μ L漂洗液PW，12000rmp離心30sec，棄濾液；向吸附柱CB3中加入500 μ L漂洗液PW，12000rmp離心30seC，棄濾液；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入新的離心管，12000rmp離心2min，去除殘余的漂洗液， 室溫靜置氣干吸附柱CB3 ；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入新的離心管中，向吸附膜的中部加入50 μ L滅菌Milli-Q水，室溫靜置anin，12000離心30sec ；將濾液重新轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，室溫靜置 2min, 12000離心2min，濾液即為基因組DNA。實(shí)施例2克隆ftOWOXlla啟動子以南林895楊DNA (實(shí)施例1制備)為材料，參考楊樹基因組序列信息(http // www, phytozome. net/)，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增ProWOXlIa啟動子序列。其中，特異性引物包括ProTOXlla 正向弓丨物5，TGGACTCTTTCTCTCATCTCTGC 3，禾Π ProffOXlla 反向弓丨物5，TTCATCCTTTGGTGGGTTTAC 3，。高保真PCR反應(yīng)體系如下10 XLA PCR Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 8. 0 μ L ；25mM Mg2+5. 0 μ L ;LA Taq DNA Polymerase (5U/μ L)0. 5μ L ；Pr off 0X1 la 正向弓| 物(10 μ M) 2 μ L ；Pr off 0X1 la 反向引物 (10 μ Μ) 2 μ L ；模板(895楊DNA 1 μ g/ μ L) 1 μ L ；加無菌ddH20補(bǔ)足50 μ L。反應(yīng)程序預(yù)變性 940C，3min ；94°C，40s, 55°C，30s, 72°C，2min, 35 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin0 對擴(kuò)增產(chǎn)物測序， 得ProWOXlla啟動子1797bp的序列，如SEQ NOl所示。實(shí)施例2ProW0Xlla啟動子表達(dá)載體構(gòu)建利用通路克隆技術(shù)構(gòu)建ftOWOXlla啟動子的表達(dá)載體。使用特異PCR引物(同實(shí)施例1的特異性引物)，以南林895楊DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。高保真PCR反應(yīng)體系如下10 X LA PCR Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 8. 0 μ L ；25mM Mg2+5. OyL ； LA Taq DNA Polymerase (5U/μ L) 0· 5 μ L ;ProW0Xlla 正向引物(10 μ Μ) 2 μ L ;ProW0Xlla 反向引物(10 μ Μ) 2 μ L ；模板(895楊DNA 1 μ g/ μ L) 1 μ L ；加無菌ddH20補(bǔ)足50 μ L。反應(yīng)程序預(yù)變性 94°C，3min ；94°C，40s，55°C，30s，72°C，2min，35 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin0 并定向克隆到入門載體，入門載體為pCRTM8/GW/T0P0 Vector(Irwitrogen)。反應(yīng)體系為=Fresh PCR product(purified)10_20ng ；Salt solution 1 μ L；pCR 8/Gff/T0P0 vector 1 μ L；力口無菌ddH20補(bǔ)足6 μ L。反應(yīng)程序?yàn)槭覝仂o置30min。大腸桿菌轉(zhuǎn)化將新鮮制備或-70°C凍存的大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化；將6 μ L連接產(chǎn)物，加入到100 μ L感受態(tài)細(xì)胞中，并輕輕混勻，冰浴30min左右；42°C水浴中熱擊90sec，迅速置于冰上3-5min ；加入800 μ LLB液體培養(yǎng)基，37°C，IOOrmp搖菌Ih ； 4000rmp離心3min，吸掉上層800 μ L培養(yǎng)基，混勻剩余菌液；將菌液涂抹于含有spc的LB 篩選培養(yǎng)板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。陽性克隆篩選及測序分析從篩選培養(yǎng)板上挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測及測序驗(yàn)證，反應(yīng)體系如表1所示。
表IPCR檢測反應(yīng)體系
10XPCR Buffer (Mg2+free)2. Ομ LMgCl2 (25mM)1. 5μ LdNTP Mixture (each 2. 5mM)1. 3μ LProWOXlla正向引物1. Ομ LProWCttlla反向引物l.OuL菌液0. 1μ LTaKaRa TaqLOuLMilli-Q Water12. 1μ LTotal volume20. 0μ L反應(yīng)程序?yàn)?94°C,3min；94°C，30s，60°C，30s，72°C，lmin，28 個(gè)循環(huán)；72°C，7min。 菌液PCR檢測為陽性的克隆送英駿生物技術(shù)公司(上海)測序鑒定，正確。帶有ftx)W0Xlla的入門載體與植物表達(dá)載體pBGGUS Qnvitrogen)進(jìn)行LR反應(yīng)。 反應(yīng)體系為linearized entry clone IOOng ；purified destination vector (lOOng/ μ L) 1. 5μ L ；LR Clonase II enzyme mix 2yL;力口 TE(pH 8.0)補(bǔ)足 IOyL;。反應(yīng)條件25°C lh。植物表達(dá)載體pBGGUS如圖1所示。經(jīng)LR反應(yīng)后ftx)W0Xlla啟動子交換至植物表達(dá)載體PBGGUS中，通過PCR檢測及測序驗(yàn)證，確認(rèn)啟動子載體構(gòu)建成功，命名為 pBGGUS-ProffOXlla,該載體在ftOWOXlIa啟動子的3’端組裝⑶S報(bào)告基因，其編碼的β -葡萄糖苷酸酶，能催化5-溴-4-氯-3吲哚葡萄糖苷酸(X-Gluc)形成不溶解的5，5’_二溴-4， 4’-二氯深色的靛藍(lán)色物質(zhì)，使得具有⑶S活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色。在載體上組裝Bial基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，可以用除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的篩選。所述載體組裝 LB和RB序列，促使組裝于其間的ftOWOXlla啟動子表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因Bial整合至植物受體細(xì)胞染色體中。實(shí)施例3ProW0Xl Ia啟動子組織特異表達(dá)分析通過常規(guī)液氮凍融法將所構(gòu)建的pBGGUS-ProWOXl Ia轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株 EHA105anvitrogen)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將ProWOXlla啟動子轉(zhuǎn)入擬南芥。轉(zhuǎn)ProWOXlla啟動子載體的T2代擬南芥植株GUS染色結(jié)果如圖3、4和6，通過與圖2和圖5的野生型植株 ⑶S染色圖對比，顯示，⑶S基因在側(cè)根原基及根尖分生組織均特異表達(dá)，因此，應(yīng)用本發(fā)明提供的啟動子，可以在植物基因工程中，誘導(dǎo)相應(yīng)目的基因在根原基和根尖分生組織中特異表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftx)W0XlIa，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有權(quán)利要求1所述的楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體在ftOWOXlla啟動子的3’端組裝GUS報(bào)告基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝Bial基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記，可以用除草劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的篩選。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的ftOWOXlla啟動子表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因Bial整合至植物受體細(xì)胞染色體中。
6.含有權(quán)利要求1所述的楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftx)W0Xlla的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ftOWOXlla在調(diào)控基因在植物體根原基及根尖分生組織特異表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種楊樹根原基特異表達(dá)啟動子ProWOX11a，其核苷酸序列如SEQNO1所示。本發(fā)明以南林895楊DNA為材料，參考楊樹基因組序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增出啟動子ProWOX11a序列。采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建植物啟動子表達(dá)載體pBGGUS-ProWOX11a，該啟動子序列后接GUS報(bào)告基因，在啟動子ProWOX11a的驅(qū)動下，報(bào)告基因GUS可在植物體根原基及根尖分生組織處特異表達(dá)。因此，應(yīng)用本發(fā)明提供的啟動子，可以在植物基因工程中，誘導(dǎo)相應(yīng)目的基因在根原基和根尖分生組織中特異表達(dá)，具有很好的實(shí)用性。
文檔編號C12N15/82GK102559682SQ201210018319
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 謝雯凡, 陳英, 黃敏仁 申請人:南京林業(yè)大學(xué)