專利名稱：一株平菇及其在降解黃曲霉毒素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株平菇及其應(yīng)用，特別是涉及平菇及其在降解黃曲霉毒素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是黃曲霉(A.fIavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)及特曲霉(A.nomius)等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已分離出AFB1、AFB2、AFGpAFGyAFMpAFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等18種之多，其中AFBi的毒性最強(qiáng)。大量的流行病學(xué)調(diào)查及研究均證實(shí)，黃曲霉毒素B1的主要靶器官是肝臟，可導(dǎo)致肝臟壞死、肝癌的形成。黃曲霉毒素B1還會(huì)影響動(dòng)物胚胎，造成免疫抑制和反復(fù)感染，降低某些動(dòng)物的產(chǎn)奶和產(chǎn)蛋量。黃曲霉毒素主要存在于玉米、花生等農(nóng)作物中，嚴(yán)重影響我國(guó)花生及其制品的出口，給我國(guó)的出口貿(mào)易帶來了巨大的損失。因此，迫切需要一種高效安全的脫毒方法消除這類毒素對(duì)人畜健康的危害。目前，黃曲霉毒素的生物學(xué)脫毒方法主要有以下幾種:1、微生物菌體本身及其細(xì)胞壁提取物吸附去除黃曲霉毒素:例如鼠李糖乳桿菌ATCC53103、鼠李糖乳桿菌DSM-705、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌干酪亞種CGMCC 1.539及某些釀酒酵母等，上述菌株能通過物理方式與黃曲霉毒素結(jié)合，形成毒素-菌體復(fù)合物，但如何將復(fù)合物從食品和飼料中分離去除，成為一個(gè)難題。2、微生物代謝產(chǎn)生的酶降解黃曲霉毒素:例如從嗜麥窄食單胞 菌、諾卡氏菌DSM 12676、假密環(huán)菌、分枝桿菌DSM 44556T及紅串紅球菌中提取出的降解酶，此方法降解效率高，降解條件溫和，成本低而受到越來越多的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株平菇及其在降解黃曲霉毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的平燕(Pleurotus ostreatus) LY65,簡(jiǎn)稱平燕LY65,已于2011年11月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCN0.5428。平菇LY65的發(fā)酵液可用于降解黃曲霉毒素B1 (AFB1),具有較高的降解能力，同時(shí)由于平菇菌株是可食用菌株，該發(fā)酵液對(duì)人畜無毒無害。本發(fā)明還保護(hù)一種制備平菇LY65的發(fā)酵液的方法，是液體培養(yǎng)平菇LY65，然后收集發(fā)酵液。所述液體培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基的組成具體可為:蔗糖2%、酵母提取物0.3%、(NH4)2S040.45%、K2HPO40.3%、MgSO4.7H20 0.1%,檸檬酸 0.025%, CaCl2.2Η200.005%,微量元素混合液10mL，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值可為6.3。所述微量元素混合液的制備方法具體可為:取甘氨酸7.Sg、MgSO4.7H2012g、MnSO4.H2O 2.9g、NaCl 17g、FeSO4.7H20 0.359g、CoCl20.775g、CaCl2.2H20 0.9g、ZnSO4.7H20 0.348g、CuSO4.5H20 0.04g、KAl (SO4) 2.12H20 0.021g、H3BO30.16g、NaMoO40.041g,用蒸餾水定容至1L。所述液體培養(yǎng)的條件具體可為:28 V -30 V、180rpm-200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑具體可為20mm-26mm)振蕩培養(yǎng)9天-10天。所述收集發(fā)酵液的方法具體如下:完成所述液體培養(yǎng)后離心收集上清液，即為發(fā)酵液。所述離心的條件具體可為 IOOOOrpm 離心 5min。以上任一所述方法制備得到的發(fā)酵液也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述發(fā)酵液可用于降解黃曲霉毒素所述降解黃曲霉毒素B1的條件具體可為:30°C、72h。所述降解過程中，可采用200rpm振蕩。本發(fā)明還保護(hù)平菇LY65在制備降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述發(fā)酵液在制備降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種培養(yǎng)平菇LY65的方法，是在28°C _30°C條件下培養(yǎng)5天_6天。所述培養(yǎng)具體可采用固體GMY培養(yǎng)基。所述固體GMY培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖1%，麥芽提取物I %，酵母提取物0.4%，瓊脂1.5%，其余為水；所述百分含量均為質(zhì)量百分含量。所述固體GMY培養(yǎng)基為自然pH。實(shí)驗(yàn)證明，平菇LY65的發(fā)酵液對(duì)黃曲霉毒素B1具有很強(qiáng)的降解能力。平菇LY65降解黃曲霉毒素B1的實(shí)驗(yàn)表明，790yL發(fā)酵液可以將1000.0Ong黃曲霉毒素B1降解掉790.21ng，對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)79.02%，黃曲霉毒素B1的濃度從1250.00ng/g降低到了 262.25ng/g。平菇LY65及其發(fā)酵液在黃曲霉毒素B1的降解中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為平燕(Pleurotus ostreatus)LY65的平板菌落形態(tài)。圖2為平燕(Pleurotus ostreatus)LY65的液體培養(yǎng)形態(tài)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。ppb代表Ing/mL。PDA固體培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%，其余為水；所述均代表質(zhì)量百分含量。GMY固體培養(yǎng)基:葡萄糖I %、麥芽提取物I %、酵母提取物0.4%、瓊脂1.5%，其余為水；所述均代表質(zhì)量百分含量。MSM 液體培養(yǎng)基(pH 6.3):蔗糖 2 %、酵母提取物 0.3 %、(NH4)2SO40.45K2HPO40.3%, MgSO4.7H20 0.1 %、檸檬酸 0.025%, CaCl2.2H20 0.005 %、微量元素混合液10mL，其余為水；所述均代表質(zhì)量百分含量。

微量元素混合液的組成為:甘氨酸7.8g、MgSO4.7H20 12g、MnSO4.H2O 2.9g、NaCl 17g、FeSO4.7H20 0.359g、CoCl20.775g、CaCl2.2H20 0.9g、ZnSO4.7H20 0.348g、CuSO4.5H20 0.04g、KAl (SO4)2.12H20 0.021g、H3BO30.16g、NaMoO40.041g，用蒸餾水定容至IL0實(shí)施例1、平菇LY65的獲得和鑒定一、平菇LY65的獲得1、2011年3月，在超凈工作臺(tái)中，取不同的可食用真菌，分別接種于GMY固體培養(yǎng)基平板中，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6d，菌株長(zhǎng)滿整個(gè)平板，取出，放在4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、將活化后的菌株平板用直徑7mm的打孔器在平板中央打孔，取4片接種到裝有IOOmL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C、200rpm培養(yǎng)9_10d。然后將發(fā)酵液IOOOOrpm離心5min，得到上清液，將上述上清液應(yīng)用到降解黃曲霉毒素B1試驗(yàn)中，從而篩選出對(duì)黃曲霉毒素B1降解能力最好的菌株，將該菌株命名為L(zhǎng)Y65(從平菇中篩選出來的)。二、平菇LY65的鑒定平菇LY65的平板菌落形態(tài)見圖1。平菇LY65的菌絲體在瓊脂培養(yǎng)基上表現(xiàn)為濃密、潔白的氣生菌絲，培養(yǎng)后期在氣生菌絲上常出現(xiàn)黃色分泌物，從而出現(xiàn)“黃梢”現(xiàn)象，不形成菌皮。平菇LY65的液體培養(yǎng)形態(tài)見圖2。平菇LY65的菌絲體在液體培養(yǎng)基上表現(xiàn)一個(gè)個(gè)圓形的菌絲球，培養(yǎng)后期會(huì)在瓶壁上長(zhǎng)出白色的氣生菌絲體。三、平菇LY65的保藏平燕(Pleurotusostreatus) LY65,簡(jiǎn)稱平燕 LY65,已于 2011 年 11 月 11 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.5428。實(shí)施例2、平菇LY65發(fā)酵液的制備將平菇LY65在GMY固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5天，然后用直徑7mm打孔器打孔制備成菌絲圈，取4片菌絲圈接種到IOOmLMSM液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm(旋轉(zhuǎn)半徑26mm)的條件下振蕩培養(yǎng)9天，取發(fā)酵體系，IOOOOrpm離心5min，得到發(fā)酵液。實(shí)施例3、平菇LY65發(fā)酵液對(duì)溶液中黃曲霉毒素B1的降解作用試驗(yàn)黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品:sigma公司貨號(hào)A6636。1、將黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶于乙腈(色譜純)，得到濃度為lOOyg/mL的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。2、移取790 μ L實(shí)施例2制備的發(fā)酵液(將MSM液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵液的對(duì)照)和10 μ L濃度為100 μ g/mL的黃曲霉毒素BI標(biāo)準(zhǔn)溶液(發(fā)酵液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積為800 μ L，總質(zhì)量為Ig ;黃曲霉毒素B1在總體系中的初始濃度為1250ng/g)，加入到1.5mL滅菌離心管中，30°C、200rpm反應(yīng)72h，取樣，用黃曲霉毒素& ELISA試劑盒(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司HE09004-1，具體操作完全按照說明書進(jìn)行)檢測(cè)反應(yīng)體系中黃曲霉毒素&的濃度。設(shè)置三個(gè)平行處理，結(jié)果取平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。采用發(fā)酵液的反應(yīng)體系中，黃曲霉毒素B1的濃度為262.24±22.22ng/g。采用MSM液體培 養(yǎng)基的反應(yīng)體系中，黃曲霉毒素B1的濃度為1250±54.01ng/g。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的發(fā)酵液對(duì)黃曲霉毒素B1的降解能力很強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵液的量為790 μ L，黃曲霉毒素B1的含量為IOOOng時(shí)，30°C、200rpm降解72h后，該發(fā)酵液對(duì)黃曲霉毒素B 1的降解率達(dá)79.02 ± 4.18 %，可使總體系中的黃曲霉毒素B1濃度從1250±54.01ng/g降低到262.24±22.22ng/g。即1.0OmL平菇發(fā)酵液可以將25mL黃曲霉毒素B1濃度超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)(20ppb)1.5倍(即濃度為50ppb的黃曲霉毒素B1)降解到lOppb，此為國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的1/2。
權(quán)利要求
1.平菇(Pleurotusostreatus) LY65，它的保藏編號(hào)為 CGMCC N0.5428。
2.一種制備權(quán)利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的發(fā)酵液的方法,是液體培養(yǎng)權(quán)利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus)LY65,然后收集發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述液體培養(yǎng)的條件為:28°C-30180rpm-200rpm振蕩培養(yǎng)9天-10天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述收集發(fā)酵液的方法如下:完成所述液體培養(yǎng)后離心收集上清液，即為發(fā)酵液。
5.權(quán)利要求2至4中任一所述方法制備得到的發(fā)酵液。
6.權(quán)利要求1所述平燕(Pleurotusostreatus)LY65的發(fā)酵液在降解黃曲霉毒素B1中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵液為權(quán)利要求5所述發(fā)酵液。
8.權(quán)利要求1所述平燕(Pleurotusostreatus) LY65在制備降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述發(fā)酵液在制備降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述平燕(Pleurotus ostreatus) LY65的方法，是在280C -30°C條件 下培養(yǎng)5天-6天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株平菇及其在降解黃曲霉毒素中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的平菇(Pleurotus ostreatus)LY65，簡(jiǎn)稱平菇LY65，保藏號(hào)為CGMCC No.5428。平菇LY65的發(fā)酵液可用于降解黃曲霉毒素B1，具有較高的降解能力，同時(shí)由于平菇菌株是可食用菌株，該發(fā)酵液對(duì)人畜無毒無害。平菇LY65及其發(fā)酵液在黃曲霉毒素B1的降解中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103215191SQ20121001797
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者劉陽, 王會(huì)娟, 邢福國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所