一種完全降解赤霉烯酮的微桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微桿菌及其完全降解赤霉烯酮的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]赤霉烯酮(zearalenone，ZEN),又稱為F_2毒素，是一種具有類(lèi)雌激素生物活性的霉菌毒素，主要是由鐮刀屬)真菌的某些種，如禾谷鐮刀菌{Fusariumgraminearum)等通過(guò)聚酮類(lèi)合成代謝途徑生成。能導(dǎo)致人或動(dòng)物的生殖系統(tǒng)紊亂，臨床表現(xiàn)為雌激素過(guò)多癥，還有潛在致癌性與肝腎損傷能力。鐮刀菌生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，既營(yíng)寄生又營(yíng)腐生生活，分布廣泛。赤霉烯酮物化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水，難于清除。農(nóng)作物生長(zhǎng)、收獲和儲(chǔ)存、加工等多個(gè)環(huán)節(jié)中，都極易被鐮刀菌侵害而污染赤霉烯酮。
[0003]近些年全球各地越來(lái)越多地在谷物(如玉米等)中檢測(cè)出赤霉烯酮，嚴(yán)重威脅著食用者的健康安全和養(yǎng)殖業(yè)的飼料安全。
[0004]微桿菌屬577.)是一種在土壤中廣泛分布的常見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌，不生孢，不抗酸。不運(yùn)動(dòng)或以I?3根鞭毛運(yùn)動(dòng)。好氧，弱厭氧。在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖瓊脂上菌落不透明，有光澤，黃色?；墚愷B(yǎng)菌，以呼吸代謝為主，也可能弱發(fā)酵產(chǎn)酸。營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜。最適生長(zhǎng)溫度30°C。已報(bào)道微桿菌屬菌株可以降解黃原膠、殼聚糖、氯乙酰及多種含苯環(huán)化合物，目前尚無(wú)關(guān)于降解赤霉烯酮的微桿菌屬菌株的報(bào)道。
[0005]本發(fā)明從青藏高原青海湖邊的草皮(N36.34.243 E100.32.285)中篩選到一株具有赤霉稀酮降解能力的微桿菌屬菌株，命名為577.FY1538，菌株保藏號(hào)為:CGMCC N0.10614，其發(fā)酵上清液可以完全降解赤霉烯酮。該菌可應(yīng)用于玉米等發(fā)霉谷物的脫毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一株可以降解赤霉烯酮的微桿菌屬的菌株Microbacteriutn sp.FYl538，以及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供的微桿菌屬的菌株，是從青藏高原青海湖邊的草皮(N36.34.243E100.32.285)中分離獲得，該菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.10614，保藏日期為2015年3月11號(hào)，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。對(duì)該菌株的16S rDNA (SEQ ID NO 1)，表明該菌株來(lái)源于細(xì)菌中的微桿菌屬，命名577.FY1538。其16S rDNA序列與 Microbacterium paraoxydans>Microbacterium菌種相似度均為 97%。該菌株在LB平板上生長(zhǎng)的菌落為圓形，培養(yǎng)36h后直徑大約1.5mm，不透明，有光澤，黃色(見(jiàn)圖1)，革蘭氏染色及顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌(見(jiàn)圖2 )。
[0008]本發(fā)明還提供利用Microbacterium寧FY1538菌株培養(yǎng)液上清完全降解赤霉稀酮的方法。具體步驟為:將所述菌株培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基的組成為胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH 7.4，水溶液)；添加終濃度5-15 μ I/ml的甲醇(優(yōu)選終濃度10-12 μ I/ml);培養(yǎng)溫度為25-35°C，震蕩或者攪拌培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-800rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24-72小時(shí)(優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí))；對(duì)Microbacterium sp.FY1538的培養(yǎng)液，通過(guò)離心或者過(guò)濾的方法去除菌體，獲得培養(yǎng)液上清溶液；將該培養(yǎng)液上清在30-50°C條件下，與赤霉烯酮經(jīng)過(guò)20-24小時(shí)的反應(yīng)。用TLC方法分析反應(yīng)體系中赤霉烯酮的殘留，用HPLC的方法分析赤霉烯酮的降解，表明赤霉烯酮已完全降解(圖3，圖4)。
[0009]本發(fā)明提供的菌株#/(^0如<^6?/^仰？ 5/7.FY1538可應(yīng)用于玉米等發(fā)霉谷物的脫毒。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1.Microbacterium sp.FY1538菌落形態(tài)圖。該菌株在LB平板上菌落為圓形較小，不透明，有光澤，黃色。該菌落形態(tài)的特征與微桿菌屬細(xì)菌形態(tài)特征相符合。
[0011]圖2.Microbacterium sp.FY1538細(xì)胞經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后在顯微鏡下的形態(tài)。與革蘭氏陽(yáng)性菌特征吻合。
[0012]圖3.TLC方法分析赤霉稀酮的降解。Mi crobac teri um sp.FYl 538在含有甲醇的LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)48小時(shí)后，取發(fā)酵液上清與赤霉烯酮在30°C條件下反應(yīng)24小時(shí)后，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解，用TLC方法分析反應(yīng)體系中赤霉烯酮的殘留。TLC的展開(kāi)劑為石油醚:丙酮:乙酸乙醋=5:4:1。泳道1-,Microbacterium sp.FY1538菌株在含甲醇的LB中培養(yǎng)2天后的培養(yǎng)液上清；泳道2:赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)樣；泳道3:Microbacterium sp.FY1538在加甲醇的LB中培養(yǎng)2天后的培養(yǎng)液上清與赤霉稀酮反應(yīng)24小時(shí)。
[0013]圖4:HPLC的方法分析赤霉稀酮的降解。Microbacterium sp.FY1538培養(yǎng)液上清與赤霉烯酮在30°C條件下反應(yīng)O小時(shí)、I小時(shí)，3小時(shí)、6小時(shí)和20小時(shí)后，用HPLC(Agilent Eclipse Plus C18)分析反應(yīng)體系中赤霉稀酮的殘留。HPLC流動(dòng)相為甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脫30min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。藍(lán)色:0小時(shí)；紅色:催化反應(yīng)I小時(shí)；綠色:催化反應(yīng)3小時(shí)；粉色:催化反應(yīng)6小時(shí)；黃色:催化反應(yīng)20小時(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]所用實(shí)驗(yàn)材料和相關(guān)操作方法如下，未詳述處可以參考冷泉實(shí)驗(yàn)室的《分子克隆》(J.Sambrook, et al.,第二版，1996):
1.培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，其余為水，pH 7.4。
[0015]2.實(shí)驗(yàn)試劑:甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、環(huán)戊酮，各種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(滬試)，分析純；赤霉烯酮購(gòu)于Sigma公司(貨號(hào)Z2125);引物合成和DNA測(cè)序由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。TLC展開(kāi)劑用石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0016]3.TLC的分析方法:用sp.FY1538降解赤霉稀酮的方法:將Mi crobac teri um sp.FY1538接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，添加終濃度10 μ Ι/ml的甲醇，30°C，震蕩培養(yǎng)48 h ;取發(fā)酵液12000印111離心，其上清，每500 ^1加入25^8赤霉烯酮，在30°C水浴反應(yīng)24h后，用適量乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，收集乙酸乙酯蒸干并用少量乙醇溶解析出物，用TLC方法(MERCK公司TLC硅膠板60F254，展開(kāi)劑為石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:I)檢驗(yàn)赤霉稀酬殘留。
[0017]4.HPLC 的分析方法:將 #icro如Cieriws sp.FY1538 接種于 50 mL LB 培養(yǎng)基中，添加終濃度10 μ I/ml的甲醇，30 °C，震蕩培養(yǎng)48 h ;發(fā)酵液12000rpm離心，上清液每500 μ I加入25 μ g赤霉烯酮，在30°C水浴反應(yīng)不同時(shí)間，用HPLC進(jìn)行分析。HPLC層析柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為甲醇和水，甲醇5%_100%梯度洗脫30min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nmo
[0018]實(shí)施例1:赤霉烯酮降解菌株的篩選分離與鑒定
土壤樣品采自青藏高原青海湖邊的草皮(N36.34.243 E100.32.285)。取2 g 土樣，加AlO mL 0.15M氯化鈉水溶液，振蕩30 min，使樣品充分打散后，室溫靜置lmin，立刻取ImL上清，涂布于LB平板上，30°C培養(yǎng)至單克隆生長(zhǎng)，挑取不同形態(tài)單菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中(添加甲醇溶解的終濃度25 μ g/ml的赤霉烯酮)，30°C培養(yǎng)2天，離心取上清，用適量乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法(展開(kāi)劑為石油醚:丙酮:乙酸乙酯=5:4:1)檢驗(yàn)培養(yǎng)液中赤霉烯酮的殘留。由此將可以降解赤霉烯酮的菌群在LB平板上反復(fù)劃線純化單克隆，最終篩選到一株可以獨(dú)立降解赤霉烯酮的單一菌株(圖Do革蘭氏染色后，證明該菌株是革蘭氏陽(yáng)性菌(圖2)。
[0019]對(duì)該菌株抽提基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA。擴(kuò)增用引物序列為16S rDNA通用引物 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG (SEQ ID NO 2))和 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO 3))。得到該菌株 16S rDNA 序列(SEQ ID NO I)，在 genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.ncb1.nlm.nih.rov/)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明該赤霉稀酮降解菌株屬于微桿菌屬，命名為Microbacterium 5/?.FY1538，保存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.10614。
[0020]實(shí)施例2: Mi crobac teri um 5/?.FYl 538 的發(fā)酵培養(yǎng)
Microbacterium印.FY1538菌株發(fā)酵上清用來(lái)降解赤霉稀酮，需要用甲醇誘導(dǎo)。對(duì)菌株進(jìn)行分離純化后，挑取單菌落接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，添加終濃度10 μ Ι/ml的甲醇，30 0C，震蕩培養(yǎng)48 h后，發(fā)酵液12000rpm離心，獲得發(fā)酵上清液。
[0021]實(shí)施例3: Mi crobac teri um 5/?.FY1538發(fā)酵上清液降解赤霉稀酮的能力分析取發(fā)酵上清液500 μ1，加入25ug赤霉烯酮，在30°C水浴反應(yīng)24小時(shí)，用100yl乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，收集乙酸乙酯相，蒸干并用少量甲醇溶解析出物，用TLC方法(MERCK公司TLC娃膠板60F254，展開(kāi)劑為石油醚:丙酮:乙酸乙醋=5:4:1)檢驗(yàn)赤霉稀酮?dú)埩簟Ｈ鐖D3所示，Mi crobac teri um sp.FYl 538發(fā)酵上清液與赤霉稀酮催化反應(yīng)24小時(shí)后，TLC方法檢測(cè)不到反應(yīng)體系中的赤霉稀酮。
[0022]進(jìn)一步用HPLC分析Microbacterium sp.FY1538發(fā)酵上清液在不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)降解赤霉稀酮的能力。HPLC層析柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動(dòng)相為甲醇和水，甲醇5%-100%梯度洗脫30min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。如圖4所示，反應(yīng)時(shí)間I小時(shí)，3小時(shí)，6小時(shí)，反應(yīng)液中的赤霉烯酮逐漸下降，反應(yīng)20小時(shí)后，HPLC已經(jīng)檢測(cè)不到反應(yīng)體系中的赤霉稀酮，說(shuō)明Microbacterium sp.FYl538發(fā)酵上清液具有完全完全降解赤霉稀酮的能力。
[0023]本發(fā)明提供的菌株#/<^9如<^6?/./? 5/7.FY1538可應(yīng)用于玉米等發(fā)霉谷物的脫毒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株微桿菌屬菌株，能夠完全降解赤霉稀酮，命名為FY1538，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.10614。2.如權(quán)利要求1所述的微桿菌屬菌株完全降解赤霉烯酮的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述的微桿菌屬菌株完全降解赤霉烯酮的應(yīng)用，其特征在于具體步驟為:將所述菌株培養(yǎng)在LB液體培養(yǎng)基中，添加終濃度5-15 μ Ι/ml的甲醇；培養(yǎng)溫度為25-35 °C，震蕩或者攪拌培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-800rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24-72小時(shí)；對(duì)Microbacterium sp.FY1538的培養(yǎng)液，通過(guò)離心或者過(guò)濾的方法去除菌體，獲得培養(yǎng)液上清溶液；將該培養(yǎng)液上清在30-50°C條件下，與赤霉烯酮經(jīng)過(guò)20-24小時(shí)的反應(yīng)。4.如權(quán)利要求1所述的微桿菌屬菌株在發(fā)霉谷物脫毒中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種完全降解赤霉烯酮的微桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株微桿菌可以降解赤霉烯酮，命名為Microbacteriumsp. FY1538。該微桿菌屬于微桿菌屬（Microbacterium sp.），分離自青藏高原青海湖邊的草皮（N36.34.243E100.32.285）。Microbacteriumsp. FY1538在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加終濃度10ul/ml的甲醇，培養(yǎng)基pH7.4，培養(yǎng)溫度30℃，搖瓶震蕩培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速220rpm，發(fā)酵上清液具有完全降解赤霉烯酮的能力。本發(fā)明提供的微桿菌可應(yīng)用于玉米等發(fā)霉農(nóng)作物的脫毒。CGMCC NO.1061420150311
【IPC分類(lèi)】A23K1/00, C12N1/20, A23L1/015, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN104946555
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510220300
【發(fā)明人】呂紅, 徐天宇, 周峻崗, 余垚, 胡蘇瑩
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日