橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因 Br-or 功能標(biāo)記的篩選及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標(biāo)記的篩選及應(yīng)用，得到的橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or與白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶（Br-crtiso）的基因等位。對該基因在橙色和白色大白菜中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)在橙色葉球大白菜該基因的啟動子區(qū)域存在86bp的缺失，故根據(jù)二者啟動子結(jié)構(gòu)的差異設(shè)計了InDel標(biāo)記Br-pro，該InDel標(biāo)記與橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or及其等位基因共分離，而且是大白菜中首個與類胡蘿卜素積累相關(guān)的營養(yǎng)品質(zhì)型功能標(biāo)記。利用該功能標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確的從大量大白菜種質(zhì)資源中篩選鑒別帶有橙色基因Br-or的材料，同時可以有目標(biāo)的將橙色基因轉(zhuǎn)到普通大白菜品種中去，極大的加速了優(yōu)質(zhì)橙色大白菜品種的培育。
【專利說明】橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標(biāo)記的篩選及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蔬菜育種及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-OT功能標(biāo)記的篩選及應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002]橙色葉球大白菜由于其獨特的顏色、較高的營養(yǎng)價值及鮮美的口感而備受人們的歡迎，而且橙色葉球大白菜在市場上的價格也都遠遠高于普通的白色葉球大白菜，具有極大的市場潛力和經(jīng)濟價值。因此橙色葉球大白菜育種已經(jīng)成為現(xiàn)代大白菜育種的重要內(nèi)容之一，但是橙色大白菜的葉球顏色直到其結(jié)球末期才能充分表現(xiàn)出，而且得采用田間逐個剖球觀察，操作起來費時費力，極大的延緩了育種進程。因此為了加快橙色大白菜的育種速度，利用現(xiàn)代的分子生物技術(shù)，進行分子標(biāo)記輔助育種十分必要。
[0003]到目前為止，橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因研究取得了一些進展，一些研究者已經(jīng)對橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因進行了遺傳分析及基因定位。Matsumoto etal.(1998)構(gòu)建了大白菜DH群體并用RFLP分子標(biāo)記將控制大白菜橘紅心和花色遺傳的隱性單基因定位于一號連鎖群上，并且找到了三個與橘紅心基因連鎖的RFLP標(biāo)記，其中與橘紅色基因的遺傳距離最近的是HC173標(biāo)記，距離12cM。但是近幾年的一些研究將橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因定位于大白菜九號連鎖群上(Zhang et al.2008 ；Feng etal.2012 ；Zhang et al.2013),這與Matsumoto 的實驗結(jié)果完全不同。Zhang et al.(2008))開發(fā)了兩個與橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因連鎖的SCAR標(biāo)記(SC0R204and SC0R127),其遺傳距離分別為5.0cM和10.0cM。Feng et al.(2012)構(gòu)建了橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的遺傳圖譜，其中一側(cè)最近的SSR標(biāo)記其遺傳距離為1.3cM，另一側(cè)最近的標(biāo)記其遺傳距離為3.3cM。但是以上研究者所開發(fā)的分子標(biāo)記離橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因都比較遠，很難對橙色葉球性狀進行準(zhǔn)確的早期選擇，且都沒有獲得橙色葉球候選基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or的功能標(biāo)記，利用簡單的PCR技術(shù)即可有效地對橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or進行基因型選擇，可以在苗期即可區(qū)分橙色和白色葉球大白菜，從而淘汰非目標(biāo)植株，大大提高了橙色大白菜品種的育種效率。
[0005]為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案:
[0006]一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-or功能標(biāo)記的篩選方法，其特征在于，包括下列步驟:
[0007](I)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的定位
[0008]以橙色葉球大白菜“01S1024”為母本，白菜葉球大白菜“92S24”為父本雜交產(chǎn)生的F1群體，然后通過雜合單株單粒傳方式獲得其F2S4群體，利用包含1724個單株的F2S4群體，構(gòu)建Br-or的高密度遺傳圖譜，利用大白菜全基因組測序結(jié)果，對該基因進行定位；
[0009](2)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的克隆及序列分析
[0010]Br-or基因物理圖譜表明橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因與大白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶的Br-crtiso基因等位，進一步克隆了橙色大白菜和普通大白菜的Br-crtiso基因，序列比較分析發(fā)現(xiàn)橙色大白菜與普通的白色大白菜Br-crtiso相比在啟動子區(qū)域發(fā)生了 86bp的缺失,該缺失位于基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游368bp和454bp之間；
[0011]橙色大白菜Br-crtiso啟動子區(qū)域基因序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因Br-OT的功能標(biāo)記篩選方法，其特征在于，包括下列步驟: (1)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的定位 以橙色葉球大白菜“01S1024”為母本，白菜葉球大白菜“92S24”為父本雜交產(chǎn)生的F1群體，然后通過雜合單株單粒傳方式獲得其F2S4群體，利用包含1724個單株的F2S4群體，構(gòu)建Br-or的高密度遺傳圖譜，利用大白菜全基因組測序結(jié)果，對該基因進行定位； (2)橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因的克隆及序列分析 Br-or基因物理圖譜表明橙色大白菜類胡蘿卜素積累基因與大白菜一號染色體上編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶的Br-crtiso基因等位，進一步克隆了橙色大白菜和普通大白菜的Br-crtiso啟動子區(qū)域基因序列，比較分析發(fā)現(xiàn)橙色大白菜與普通白色大白菜Br-crtiso相比在啟動子區(qū)域發(fā)生了 86bp的缺失，該缺失位于基因轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游368bp和454bp之間； 所述的橙色大白菜Br-crtiso啟動子區(qū)域基因序列如下:
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的InDel標(biāo)記Br-pro的擴增體系是以橙色和白色大白菜品種DNA作模板，按照下述PCR擴增條件和反應(yīng)程序進行: ①PCR擴增條件: 20 μ IPCR反應(yīng)體系為:模板DNA50ng，Taq酶1U，10 μ mol的上、下游引物各0.8 μ 1，0.32 μ I oflOmM dNTPs,2.0μ I oflOXPCR buffer, 1.2μ I of25mM MgCl2，用無菌蒸餾水補充反應(yīng)體系至20 μ I ； ②PCR 反應(yīng)程序為:先 94°C，5min ;然后 94°C，30s，56°C，Imin，72 °C，Imin，共 30 個循環(huán)；最后72°C，10min，4°C保存；PCR反應(yīng)在Bio-Rad S100096型PCR儀中進行。
3.權(quán)利要求1或2所述方法得到的InDel標(biāo)記Br-ρ--在篩選橙色和白色球葉大白菜中輔助育種的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，以待檢測大白菜材料DNA為模板，應(yīng)用功能標(biāo)記Br-pro的特異引物，按照其擴增體系進行擴增，擴增產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖膠電泳分離，如果擴增產(chǎn)物大小為213bp，則表明待檢測材料為橙色葉球，如果擴增產(chǎn)物為299bp，或者213bp和299bp，則待檢.測材料為白色葉球。
【文檔編號】C12N15/10GK103468676SQ201310388853
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】張魯剛, 張俊祥, 李會霞 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)