本發(fā)明涉及物種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列及其在物種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黑鯛(學(xué)名：acanthopagrusschlegelii)，又名黑棘鯛，俗稱黑加吉、烏翅等，為輻鰭魚綱鱸形目鯛科棘鯛屬的魚類，是我國(guó)沿海最受歡迎的經(jīng)濟(jì)魚類之一,也是重要的海水養(yǎng)殖品種。主要分布于西太平洋區(qū)，包括中國(guó)東海、香港、日本等海域。黑鯛為廣溫、廣鹽性魚類，最大個(gè)體長(zhǎng)可達(dá)45厘米，一般4齡之前的生長(zhǎng)速度較快。目前，對(duì)黑鯛的物種識(shí)別僅局限于形態(tài)學(xué)鑒定，而且專業(yè)鑒定人員很少。此外，對(duì)黑鯛地方特有種進(jìn)行有效鑒定對(duì)培育優(yōu)良雜交鯛品種具有很重要的意義。

dna條形碼技術(shù)(dnabarcoding)是指用基因組內(nèi)一段標(biāo)準(zhǔn)的、短的dna片段來鑒定物種的一項(xiàng)分子鑒定新技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行物種鑒定。目前在動(dòng)物中最常見的分子標(biāo)記是線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基i(cytochromecoxidasei,coi)基因的部分序列。dna條形碼具有廣泛的應(yīng)用前景，在物種鑒定、分子進(jìn)化、種群遺傳、瀕危物種保護(hù)等研究領(lǐng)域具有一定的發(fā)展?jié)摿?。dna條形碼不同于以往的傳統(tǒng)鑒別方法，對(duì)研究人員的專業(yè)技能并無較高要求，上至生物學(xué)家，下至普通生物愛好者，都可在短時(shí)間內(nèi)掌握該技術(shù)。dna條形碼技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)的障礙，可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的鑒定，是分子鑒定方法學(xué)上的創(chuàng)新，操作簡(jiǎn)單、效率高、應(yīng)用廣等特點(diǎn)無疑將改變整個(gè)物種鑒定領(lǐng)域的發(fā)展方向。運(yùn)用dna條形碼技術(shù)，可以很好的對(duì)黑鯛進(jìn)行快速、有效的鑒定。

物種鑒定一直是分類學(xué)乃至幾乎所有生物領(lǐng)域上的研究至關(guān)重要的基礎(chǔ)步驟。因此，準(zhǔn)確的對(duì)物種鑒定，特別是對(duì)那些稀有物種和具有保護(hù)意義的種類，分類鑒定工作就顯得尤其重要。自從2003年，加拿大科學(xué)家hebert提出以coi基因做為dna條形碼以來，越來越多的研究表明dna條形碼在物種分類上具有高效可行性。大量的研究結(jié)果顯示以coi基因?yàn)闃?biāo)記的dna條形碼能夠準(zhǔn)確的對(duì)各類動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定，可以選用coi基因作為各種動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)條形碼。

該方法與傳統(tǒng)的分類學(xué)方法互為佐證，不僅可以解決鑒定中標(biāo)本殘缺不全無法準(zhǔn)確鑒定等問題，而且有利于快速鑒定。目前已有專門的魚類數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括1.5萬多種魚類的條形碼數(shù)據(jù)。但是我國(guó)許多魚類由于其特有性，沒有足夠的相關(guān)數(shù)據(jù)。也沒有黑鯛的相關(guān)基因序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列在物種鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列有利于實(shí)現(xiàn)黑鯛的分子鑒定，能有效縮短鑒定時(shí)間。

為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列，該條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列為coi基因，其序列如seqidno:1所示(658bp)：

gaccctttatctcgtatttggtgcttgagctggaatagtaggaaccgccttaagtctgctcattcgagccgaattaagccaacctggcgctctcctaggagatgatcaaatttataatgtaattgttacagcacatgcgtttgtaataattttctttatagtaataccaattatgattgggggctttggaaattgattagtaccacttatgattggtgcccctgacatagcattcccccgtataaacaacataagcttctgacttcttcctccatcattcctcctgctgctagcttcttctggtgtcgaagctggggccggtaccgggtggacagtttaccccccactggcaggaaacctcgcccacgcaggtgcatcagttgacttaaccatcttttctcttcacctagccggaatttcatctattcttggggccatcaattttattaccactattatcaatatgaaaccgccagctatctcacaatatcaaacacccctatttgtgtgggccgttttaattactgctgtcctactcctcttgtccctcccagttcttgctgccggaattacaatactccttacagaccgaaatctaaataccaccttctttgacccagctggaggaggagaccctattctctatcaacacctattc。

一組用于擴(kuò)增上述黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列的通用引物，它包括兩對(duì)通用引物，其中，一對(duì)通用引物的正向引物序列和反向引物序列分別如seqidno:2和seqidno:3所示；另一對(duì)通用引物的正向引物序列和反向引物序列分別如seqidno:4和seqidno:5所示，其中，r處的堿基為a或g，y處的堿基為c或t。

上述的黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列、上述的通用引物在制備用于鑒定黑鯛的試劑盒中的應(yīng)用。

一種用于鑒定黑鯛的試劑盒，它包括上述的通用引物。

上述的試劑盒，還包括pcr技術(shù)常用試劑。

一種重組載體，它包含上述的黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列。

上述的黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列、上述的通用引物、上述的試劑盒在鑒定黑鯛中的應(yīng)用。

一種黑鯛的分子鑒定方法，它包括以下步驟：

(1)從待鑒定組織樣本中分離提取基因組dna；

(2)以步驟(1)所提取的基因組dna為模板，采用兩對(duì)通用引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增；

其中，一對(duì)通用引物的正向引物序列和反向引物序列分別如seqidno:2和seqidno:3所示；另一對(duì)通用引物的正向引物序列和反向引物序列分別如seqidno:4和seqidno:5所示；

seqidno:2如下：

5’-tgtaaaacgacggccagtcgactaatcataaagatatcggcac-3’；

seqidno:3如下：

5’-caggaaacagctatgacacttcagggtgaccgaagaatcagaa-3’；

seqidno:4如下：

5’-tgtaaaacgacggccagtcaaccaaccacaaagacattggcac-3’；

seqidno:5如下：

5’-caggaaacagctatgacacctcagggtgtccgaaraaycaraa-3’；其中，r處的堿基為a或g，y處的堿基為c或t，r或y的設(shè)立是用來擴(kuò)增未知堿基的；

(3)將步驟(2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性擴(kuò)增出710±10bp的條帶，則將其進(jìn)行測(cè)序分析；

(4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，如果與如seqidno:1所示的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判斷該待鑒定組織為黑鯛。

上述的黑鯛分子鑒定方法，作為一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件為：95℃變性2min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

步驟(2)中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)體系(25μl)為：10×pcrbuffer2.5μl，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，takarataq(5u/μl)0.3μl，fishf2_t1引物(10μm)0.5μl，fishr2_t1引物(10μm)0.5μl，vf2_t1引物(10μm)0.5μl，fr1d_t1引物(10μm)0.5μl，dna模板(約10ng/μl)1μl，ddh2o17.2μl。

上述黑鯛的分子鑒定方法流程圖如圖1所示。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明提供了一種用于鑒定黑鯛的dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列及該dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)標(biāo)本中殘缺不全無法準(zhǔn)確鑒定的個(gè)體以及完整的個(gè)體采用可靠的dna分子鑒定技術(shù)，快速、準(zhǔn)確的鑒定黑鯛；克服了現(xiàn)有技術(shù)中的如下不足：對(duì)殘缺不全的個(gè)體基本上不能鑒定；對(duì)完整的個(gè)體鑒定需要對(duì)黑鯛形態(tài)非常熟悉的專業(yè)人員；與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法相比，有效的縮短了鑒定時(shí)間。

(2)本發(fā)明提供的分子鑒定方法中的pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，重復(fù)性高，經(jīng)多次試驗(yàn)穩(wěn)定性好。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的黑鯛的分子鑒定方法的流程示意圖。

圖2是實(shí)施例1中的黑鯛肌肉組織的coi基因pcr擴(kuò)增結(jié)果電泳鑒定圖。

其中，泳道m(xù)為dna標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)，泳道1、2為黑鯛肌肉組織的coi基因，檢出大小為700bp左右的條帶。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1：

1、待測(cè)樣本的采集、保存與處理

從浸泡標(biāo)本中剪取黑鯛的部分肌肉組織，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

2、dna提取

酚-氯仿方法提取樣品中的dna，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、pcr引物合成

本方法選取2對(duì)通用引物：

fishf2_t1:

5’-tgtaaaacgacggccagtcgactaatcataaagatatcggcac-3’(seqidno:2)；

fishr2_t1:

5’-caggaaacagctatgacacttcagggtgaccgaagaatcagaa-3’(seqidno:3)；

vf2_t1:

5’-tgtaaaacgacggccagtcaaccaaccacaaagacattggcac-3’(seqidno:4)；

fr1d_t1:

5’-caggaaacagctatgacacctcagggtgtccgaaraaycaraa-3’(seqidno:5)。其中，r處的堿基為a或g，y處的堿基為c或t，r或y的設(shè)立是用來擴(kuò)增未知堿基的。

4、pcr反應(yīng)體系(25μl)

5、pcr反應(yīng)程序

反應(yīng)結(jié)束后，打開pcr儀，取出完成擴(kuò)增的樣品，于4℃保存

6、pcr產(chǎn)物檢測(cè)

取2μlpcr產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳(120v，200ma，25min)，溴化乙錠染色。凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，電泳圖譜如圖2所示，檢出大小約為710±10bp的條帶，可初步判定待測(cè)樣本可能是黑鯛。

7、基因序列測(cè)定

選取效果較好的pcr產(chǎn)物送至生物公司純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示其序列如seqidno:6所示，seqidno:6序列如下：

aaagaattggacctttatcttgtatttggtgcctgagccggaatagtgggaaccgctctaagccttctcattcgagccgaactaagccaacctggatcacttctgggcgatgatcaaatttataatgttattgtcactgcccatgccttcgtaataattttctttatagtaataccaattttaatcggaggatttggaaattgactcgtgccattaataatcggagcgcctgatatggcattcccacgaataaataacatgagtttctgacttctacctccctctttccttctactactagcctcctctggtgtcgaagccggggctggaacagggtggacagtatacccgccactcgcaggcaatcttgcccacgcaggagcatccgtagacctaacaattttctcactccacctagcaggtgtatcatcaattttaggtgcaattaacttcatcaccacaactattaatatgaaaccaccagccatctctcaataccaaacacctctgtttgtttgagctgtacttgtaacagctgtacttcttctcttatccctaccagttctagccgccggaattactatgcttcttacagatcgaaatctaaataccacattctttgatccagcaggaggaggggacccaattctatatcaacatctattctgattcttcggacaccctgaagtgtcatacttgtttccttgg。

經(jīng)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，seqidno:6所示核苷酸序列與如seqidno.1所示核苷酸序列的同源性為99％，因而可判定該待測(cè)樣本即為黑鯛的組織樣本。

實(shí)施例2：

從魚類組織樣本(殘缺不全，無法進(jìn)行生物學(xué)鑒定)中選取2組肌肉組織樣，保存在95％酒精中。選取的肌肉組織分屬兩組不同品種的魚類，其中一組為黑鯛(5個(gè)樣品)，另一組為其他品種(5個(gè)樣品)，取樣人根據(jù)具體信息做好品種記錄并編號(hào)，實(shí)驗(yàn)操作人員在不清楚2組樣本品種歸屬的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用與實(shí)施例1相同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示其中一組的5個(gè)樣品為黑鯛的組織樣本，另一組的5個(gè)樣品為非黑鯛的組織樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同取樣人記錄信息完全一致。

上述實(shí)施例為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>鎮(zhèn)江華大檢測(cè)有限公司

<120>一種黑鯛dna條形碼標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)序列及其應(yīng)用

<130>2017

<160>6

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gaccctttatctcgtatttggtgcttgagctggaatagtaggaaccgccttaagtctgct60

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gggctttggaaattgattagtaccacttatgattggtgcccctgacatagcattcccccg240

tataaacaacataagcttctgacttcttcctccatcattcctcctgctgctagcttcttc300

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<213>未知

<221>樣品pcr擴(kuò)增產(chǎn)物序列

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