專(zhuān)利名稱(chēng)：大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大豆生育期el-fs基因及其編碼蛋白。
背景技術(shù)：
El基因位于著絲 點(diǎn)附近，自Bernard (1971)年報(bào)道以來(lái)，人們一直沒(méi)有克隆出其功能基因。由于該基因位于近著絲點(diǎn)(pericentromeric region),遺傳重組率較低，不利于采用圖位克隆法克隆出該基因，在發(fā)明專(zhuān)利(一種大豆生育期El基因及其編碼蛋白，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01210112662. 9)中，公布出El基因序列及其相應(yīng)的蛋白序列后，證明大豆生育期El基因具有強(qiáng)烈抑制大豆開(kāi)花的生理功能。其蛋白質(zhì)序列雖然并不能鑒定出B3結(jié)構(gòu)域，但是與B3結(jié)構(gòu)域基因具有遠(yuǎn)緣的關(guān)系。B3結(jié)構(gòu)域基因是一類(lèi)較為保守的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，一般只有100-120氨基酸，常與其他結(jié)構(gòu)域共同起作用。B3結(jié)構(gòu)域中含有與DNA相結(jié)合的特殊位點(diǎn)，一般與DNA分子的大溝起作用。在含有B3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)對(duì)抗逆性反應(yīng)、植物的生長(zhǎng)與發(fā)育等諸多方面起重要作用。同時(shí)，El基因具有一個(gè)核定位信號(hào)，其特征為親核蛋白一般都含有的能保證整個(gè)蛋白質(zhì)能夠通過(guò)核孔復(fù)合體被運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品種中，其El基因的突變?nèi)绾斡绊懼蠖股?開(kāi)花期及成熟期)是一個(gè)非常重要的科學(xué)問(wèn)題，目前還沒(méi)有在分子水平上的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供大豆生育期el-fs基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大ii生育期el-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本發(fā)明的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本發(fā)明的大豆生育期el-fs基因是大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)的突變型基因。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類(lèi)新型的基因家族，我們已證實(shí)El基因可以代表著El位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開(kāi)花的功能。本發(fā)明對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-fs基因，其對(duì)大豆生育期關(guān)系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見(jiàn)序列表Seq ID No 2)0細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒(méi)有任何信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開(kāi)花特早，在長(zhǎng)日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開(kāi)花天數(shù)相當(dāng)，大約為30天左右，說(shuō)明具有el-fs品種幾乎喪失了對(duì)光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。


圖I為el-fs基因電泳圖，其中，I號(hào)為鐵莢四粒丑，2號(hào)為長(zhǎng)農(nóng)14,3號(hào)為Kariyutaka, 4號(hào)為鐵莢子，5號(hào)為長(zhǎng)農(nóng)18,6號(hào)為坂本早生(Sakamotowase), 7號(hào)為小金黃，8號(hào)為長(zhǎng)農(nóng)4 ；圖2為GFP未融合el-fs基因的瞬時(shí)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為GFP融合el-fs基因的瞬時(shí)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖4為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖5為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖6為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細(xì)胞定影像位圖；圖7為GFP未融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細(xì)胞定位影像圖；圖8為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖9為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡chlorophyll通道下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖10為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡明視野下的亞細(xì)胞定位影像圖；圖11為GFP融合el-fs基因的激光共聚焦顯微鏡GFP通道、chlorophyll通道與明視野融合后的亞細(xì)胞定位影像圖；圖12 :大豆品種坂本早生(Sakamotowase)在長(zhǎng)日照16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下，出苗后32天照片，其中，箭頭所指的是已開(kāi)放的大豆花朵；圖13具大豆生育期El基因的大豆品種Harosoy-El在長(zhǎng)日照16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件下，出苗后32天的照片。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。本實(shí)施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類(lèi)新型的基因家族，我們已證實(shí)EI基因可以代表著EI位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開(kāi)花的功能。本實(shí)施方式對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-fs基因，其對(duì)大豆生育期關(guān)系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見(jiàn)序列表Seq ID No 2)0細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒(méi)有任何、信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開(kāi)花特早，在長(zhǎng)日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開(kāi)花天數(shù)相當(dāng)，大約為30天左右，說(shuō)明具有el-fs品種幾乎喪失了對(duì)光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。本實(shí)施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)El基因序列進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。由于在大中具有典型的B3基因結(jié)構(gòu)域基因，本基因是代表一類(lèi)新型的基因家族，我們已證實(shí)EI基因可以代表著EI位點(diǎn)的功能，即具有抑制大豆開(kāi)花的功能。本實(shí)施方式對(duì)不同品種及近等基因系中El基因序列進(jìn)行了研究，并確定了 el-fs基因，其對(duì)大豆生育期關(guān)系密切。el-fs基因是在大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662. 9)核苷酸序 列48bp處發(fā)生了單堿基缺失,在AA 16至41之間形成移碼(frameshift),在第42位形成了終止子(見(jiàn)序列表Seq ID No 2)0細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因因移碼而造成了沒(méi)有任何信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。具有el-fs基因的品種表現(xiàn)為開(kāi)花特早，在長(zhǎng)日照條件下具有el-fs基因的品種或品系與短日照條件下的開(kāi)花天數(shù)相當(dāng)，大約為30天左右，說(shuō)明具有el-fs品種幾乎喪失了對(duì)光周期的敏感性。坂本早生(Sakamotowase)及其衍生品種是具有el-fs基因型的典型品種。通過(guò)以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的效果(I)基因el-fs序列的獲得取長(zhǎng)至三葉真葉期的待測(cè)品種坂本早生(Sakamotowase)葉片,采用CTAB法提取葉片基因組DNA ；以提取的DNA為模板通過(guò)Kl與K2引物，采用購(gòu)買(mǎi)自Takara公司的高保真酶primerSTAR HS擴(kuò)增el-fs基因，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min，將PCR產(chǎn)物在ABI3130測(cè)序儀(ABI公司)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明大豆生育期el-fs基因具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由524個(gè)堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(2) el-fs基因的鑒定一、取長(zhǎng)至三葉真葉期的待測(cè)品種葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;二、以步驟一提取的50ng基因組DNA為模板，以Fl和F2為引物采用購(gòu)買(mǎi)自Takara公司的HinfI酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下95°C預(yù)變性3min ;95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32個(gè)循環(huán)，再72°C延伸7min ;三、取經(jīng)步驟二 PCR的產(chǎn)物約8 yl (濃度為300ng/U I)，用滅菌水稀釋I倍后，經(jīng)HinfI限制性?xún)?nèi)切酶(購(gòu)買(mǎi)自Takara公司)，在37° C溫度下，消化3h ;四、然后將步驟三酶切后的產(chǎn)物，采用13%非變性PAGE膠電泳進(jìn)行檢測(cè)；其中，步驟一所述的待測(cè)品種I至8號(hào)分別為鐵莢四粒豆，長(zhǎng)農(nóng)14，Kariyutaka，鐵莢子，長(zhǎng)農(nóng)18，坂本早生(Sakamotowase),小金黃,長(zhǎng)農(nóng)4。電泳結(jié)果如圖I所示，由圖I可知，其中1、2、3、4、5、7和8品種僅出現(xiàn)三條條帶(A，B與C表示，即只有二個(gè)酶切位點(diǎn)),為大豆生育期El基因；而6號(hào)坂本早生(Sakamotowase)品種出現(xiàn)四條帶型(A，B，D，E表示，即有三個(gè)酶切位點(diǎn))即可為HinfI消化的el-fs基因型。(3) el-fs基因的功能分析一、大豆品種帶有el-fs基因的表型分析為進(jìn)一步驗(yàn)證el-fs基因型的功能， 將帶有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種與帶有大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的Harosoy-El品種，種植在人工培養(yǎng)箱中(人工控制日照長(zhǎng)度長(zhǎng)日照為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，中等長(zhǎng)照為13. 5小時(shí)/9. 5小時(shí)，短日照條件為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗)，光源為熒光燈與白熾燈，其光強(qiáng)為235 270iimol s—1 m_2，同時(shí)，在自然光照的田間種植，觀察品種從出苗到開(kāi)花的天數(shù)。結(jié)果如表I所示，從表I中可以看出，在短日照(12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗)條件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種與含有el_fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種開(kāi)花天數(shù)(從播種到開(kāi)花)相當(dāng)，大約30天左右；而在長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下,含有el-fs基因的坂本早生(Sakamotowase)品種為30天左右(圖12)，而Harosoy-El品種為73天(圖13)，在中等長(zhǎng)照強(qiáng)度(13. 5小時(shí)光照/9. 5小時(shí)黑暗)及田間的效果，坂本早生(Sakamotowase)品種開(kāi)花期與短日照相當(dāng)，說(shuō)明el_fs品種缺失了對(duì)大豆不同光周期長(zhǎng)度的敏感性。表I不同El基因型品種的開(kāi)花期
從出苗至開(kāi)花期
品種名基因型人工氣候箱# 田間(自然光照條 __12L/12D 14.5U9.5D 16U8D件)_
__E1______
ff黃豆
(Aokimame)__E±__31^0__nj.__106.0__S96_
「00411北兄小懲豆
(Peking)__El____65,0__98,0__55.2
Bay__E±__29,5__ird,__75,0__60.0
Harosoy-E/__E±__3^0__51^__73,0__46.4
Enrei__E1___ad,__510__7^,0__49.0
__e1-fs_____
坂木早4:
(Sakamotowase)__e1-fs__29.0__31.0__30.0__29.7_
_9E_ e1-fs29.0n.d.32.0n.d.注n. d. (not done)沒(méi)有進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)；L=Light (光照長(zhǎng)度)；D=Dark (黑暗長(zhǎng)度)二、大豆生育期El基因核定位研究一、提取大ii Sakamoto品種(從日本生物資源研究所基因庫(kù)購(gòu)頭得到)的DNA,并以其為模板，以Kl與K2為引物，采用購(gòu)買(mǎi)自Takara公司的高保真酶primerSTARHS擴(kuò)增el-fs基因，PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸Imin，共30循環(huán)，再72°C延伸7min ;二、將步驟一獲得的產(chǎn)物采用ClaI酶SpeI酶進(jìn)行酶切，然后將酶切片段克隆到PBSK質(zhì)粒中，形成一個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的el-fs與eGFP融合體質(zhì)粒(即 CaMV 35S el-fs :eGFP);三、制備擬南芥原生質(zhì)體(Arabidopsis protoplasts)；四、將步驟三得到CaMV 35S el-fs :eGFP質(zhì)粒通過(guò)氯化鈣聚乙二醇法轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體(Arabidopsis protoplasts),同時(shí)，將不含有 el-fs 的 pBSK (CaMV 35S :eGFP)質(zhì)粒作為對(duì)照組，通過(guò)氯化鈣聚乙二醇法轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察；其中，pBSK質(zhì)粒購(gòu)買(mǎi)自Stratagene公司；擬南芥原生質(zhì)體(Arabidopsis protoplasts)制備方法如下一、配制纖維素酶消化液，消化液各組分的配比1. 25%(w/v)的纖維素酶R10，0. 3%(w/v)的離析酶R10，0. 4M/L的甘露醇，20mM/L的KCl，20mM/L的MES (pH=5. 7)，混合均勻后在55°C溫度下加熱lOmin，再加入終濃度為10mM/L CaCl2溶液，5mM/L的P -巰基乙醇和0. 1% (w/v) BSA ;二、取三至四周齡未抽苔的擬南芥蓮座葉片，切成約0. 5mmXO. 5mm的形狀，然后浸沒(méi)于步驟一制得的消化液中，然后在黑暗放置3h，再用200目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾過(guò)液并置于離心管中以IOOg/min的速度離心2min,去上清,用預(yù)冷的W5的溶液重懸清洗,再次以100g/min的速度離心后，收集沉淀用W5重懸并于冰上放置30min，再次以100g/min的速度離心，收集沉淀，用 ImL MMg溶液重懸，即得擬南芥原生質(zhì)體(Arabidopsis protoplasts);其中，W5的組成為154mM/L 的 NaCl, 125mM/L 的 CaCl2, 5mM/L 的 KCl 和 2mM/L 的 MES 緩沖液(pH=5. 7) ;MMg 的配比為0. 4M/L的甘露醇，15mM/MgCl2溶液和4mM/L的MES。氯化鈣聚乙二醇法方法具體步驟如下一、分別取10 ill的質(zhì)粒(CaMV35S: el-fs: eGFP與CaMV 35S: eGFP，質(zhì)粒濃度約為lyg/yL)加入IOOyl的制備好的擬南芥原生質(zhì)體中，再加入110 ill的PEG-CaCl2溶液，吹吸混勻，轉(zhuǎn)化20min ;二、轉(zhuǎn)化完后，加入440 ill的W5溶液混勻后，然后以100g/min的速度離心3min，去上清后加入ImL的W5溶液過(guò)夜培養(yǎng)16h,即完成;其中，PEG-CaCl2是由4g的PEG4000,3mL的H2O, 2. 5mL的0. 8M/L甘露醇，ImL的1M/L CaCl2溶液制成；W5的組成為154mM/L的NaCl溶液，125mM/L的CaCl2溶液，5mM/L的KCl溶液和2mM/L的MES緩沖液(pH=5. 7)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察擬南芥原生質(zhì)體不同器官中大豆生育期el-fs基因的分布，從圖4至圖7中可見(jiàn)，不帶有el-fs基因的對(duì)照載體，在細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有分布，從圖8至11中可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的el-fs基因，在細(xì)胞核內(nèi)未觀察到任何信號(hào)，說(shuō)明el-fs基因并不具有核定位功能。說(shuō)明el-fs基因的突變改變了原有大豆生育期El基因(發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210112662.9)的核定位功能，使本發(fā)明的el-fs基因較大豆生育期El基因具有不完全抑制大豆開(kāi)花的功能。在上述試驗(yàn)中所述的Harosoy-El和Harosoy-el來(lái)源于美國(guó)農(nóng)業(yè)部基因種質(zhì)庫(kù)(the USDA-ARS National Plant Germplasm System)的統(tǒng)一入庫(kù)編號(hào)，分別為 PI547707 和 PI547676 ；Harosoy-EU Harosoy-el、Williams 82、Bay、Enrei、9E、坂本早生(Sakamotowase)和Kariyutaka等從日本生物資源研究所基因庫(kù)購(gòu)買(mǎi)得到。其他品種長(zhǎng)農(nóng)14,鐵莢子,長(zhǎng)農(nóng)18,小金黃,長(zhǎng)農(nóng)4,小粒秣食S 和中黃39從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大S 研究中心是購(gòu)買(mǎi)得到。
權(quán)利要求
1.大豆生育期el-fS基因，其特征在于大豆生育期el-fs基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的大豆生育期el-fs基因的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期el-fs基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白，它涉及一種大豆生育期e1-fs基因。本發(fā)明提供了大豆生育期e1-fs基因及其編碼蛋白。本發(fā)明的大豆生育期e1-fs基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發(fā)明的大豆生育期e1-fs基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本發(fā)明通過(guò)品種的相關(guān)的遺傳及分子功能驗(yàn)證，e1-fs基因與E1基因相比，具有顯著的促進(jìn)開(kāi)花的功能。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102732529SQ201210162188
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者劉寶輝, 呂世翔, 吳紅艷, 夏正俊, 孔凡江, 翟紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所